SV40 기반 인간 에피솜 내에서 구조가 형성되기 쉬운 DNA 반복을 통한 복제의 전기영동 분석

요약

여기에서는 2차원 겔 전기영동을 사용하여 병원성, 구조가 발생하기 쉬운 반복을 통한 복제 진행을 분석하는 절차를 간략하게 설명합니다.

초록

2차원 중성/중성 겔 전기영동(2DGE)은 자연적 장애를 통해 DNA 복제를 분석하기 위한 벤치마크 기법으로 부상했습니다. 이 프로토콜은 인간 세포의 유인원 바이러스 40(SV40) 기반 에피솜 내에서 구조가 발생하기 쉽고 확장 가능한 DNA 반복을 통해 복제 포크 진행을 분석하는 방법을 설명합니다. 간단히 말해서, 플라스미드가 인간 세포로 transfection되면 복제 중간체는 modified Hirt 프로토콜에 의해 분리되고 DpnI 제한 효소로 처리되어 복제되지 않은 DNA를 제거합니다. 그런 다음 중간체를 적절한 제한 효소에 의해 절단하여 3-5kb 길이의 DNA 단편의 기원 원위 절반 내에 관심 반복을 배치합니다. 복제 중간체는 두 개의 수직 차원으로 분리되는데, 처음에는 크기에 의해, 그 다음에는 모양에 따라 분리됩니다. 서던 블롯 교잡에 이어 이 접근 방식을 통해 연구자들은 복제 Y-아크의 하강 절반에서 다양한 구조 형성 반복에서 포크가 멈추는 것을 관찰할 수 있습니다. 또한, 스톨 사이트의 이러한 포지셔닝은 포크 반전, 수렴 포크의 출현 및 재조합 포크 재시작과 같은 반복 매개 포크 실속의 다양한 결과를 시각화할 수 있습니다.

서론

STR(Short Tandem Repeats)은 일반적으로 2-9개의 염기쌍(bp)으로 작으며, 인간 게놈의 약 3%를 구성하는 DNA의 반복적인 염기서열입니다¹. STR은 유전자 조절²에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 그들의 반복적인 구성은 비표준 DNA 2차 구조 형성 및 그에 따른 유전적 불안정성을 유발합니다 ^3,4. 왼손잡이 나선에서 머리핀/십자형, 3가닥 및 4가닥 나선에 이르기까지, 이러한 대체 DNA 구조는 레플리솜에 본질적인 문제를 일으킵니다. 2차 구조 형성을 위한 자연스러운 전제 조건은 DNA 풀림이며, 이는 DNA 복제의 전제 조건입니다. 이는 게놈 기능에 대한 독특한 수수께끼를 제시하는데, 이러한 구조 중 많은 부분이 복제 중에 형성되어 replisome 진행을 방해하고 궁극적으로 복제 포크 정지 ^5,6,7 또는 심한 경우 포크 붕괴 및 DNA 파손 ^8,9

프로토콜

참고: 포유류 세포에서 간략하게 설명한 2DGE 분석을 위해 설계된 플라스미드에는 구조가 발생하기 쉬운 반복의 업스트림에서 수 kb 떨어진 SV40 복제 기원이 포함되어야 합니다(그림 2). 선행 및 후행 synthesis는 반복이 플라스미드에 클로닝되어야 하는 origin에 상대적인 방향을 선택할 때 염두에 두어야 합니다.

그림 2: 2DGE 분석을 위한 반복 함유 플라스미드의 분해. 구조가 발생하기 쉬운 반복은 오른쪽으로 이동하는 복제 포크에서 몇 kb 다운스트림으로 표시됩니다. 고유한 커터 1과 2를 사용한 분해는 분해된 단편의 중간 지점을 넘어서는 시퀀스가 주어지면 Y-아크의 하강하는 암에 반복 시퀀스를 배치합니다. 약어: 2DGE = 2차원 중성/중성 겔 전기영동.

결과

만약 성공한다면, 시각화 시 거대한 1n 지점에서 위아래로 뻗어 있는 복제 포크의 날카로운 호를 관찰할 수 있습니다(그림 5A). 프래그먼트의 크기 또는 복제되는 비율은 첫 번째 차원에서 프래그먼트의 이동성을 결정합니다. 중간체가 더 관절이 있는 구조를 개발함에 따라 2차원에서 더 천천히 이동하기 시작할 것입니다. 그러므로, 만약 중간체가 두 차원에서 모두 천천히 이동했다면, 그것은 기존의 복제 포크로부터 상당한 접합 변동을 가진 고도로 복제된 분자라고 주장할 수 있습니다. (GAA)₁₀₀ 반복의 후행 가닥 합성의 경우, 포크 스톨링은 아크 (I)에 정의된 어두운 점으로 표시되며, 이는 반복을 만날 때 복제 포크의 증가를 나타내며(그림 5B), 이는 삼중 형성으로 인한 것일 수 있습니다. 이것은 마구간 사이트 위에 더 무겁고 더 많은 분기가 있는 중간체(II 및 III)를 동반합니다. 이러한 중간체의 특.......

토론

2DGE는 특정 염기서열의 복제 중에 발생하는 중간체의 상대적 집단에 대한 반정량적이고 포괄적인 이미지를 제공합니다. 복제 포크의 취약한 분자 구조가 이 절차 전반에 걸쳐 유지되어야 한다는 점을 감안할 때 물리적 전단 및 화학적 변성을 방지하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다. 따라서 플라스미드 분리 중에는 알칼리 처리를 피하는 것이 매우 권장됩니다. 이를 피하기 위해, 우리와 다른 연구자들은 1967년 히르트(Hirt)에 의해 확립된 DNA의 히르트 분리(Hirt isolation of DNA)의 변형된 형태를 구현했다³³. 여기서 DNA는 4°C에서 하룻밤 동안 1M NaCl로 세포 용해물을 처리하여 단백질, RNA 및 기타 세포 파편에서 분리됩니다. 이 방법은 복제 중간체의 품질을 보존하는 데 탁월한 것으로 입증되었지만, 게놈 DNA에서 플라스미드 DNA를 완전히 분리하지는 않는 것으로 보입니다. 방사성 표지 프로빙을.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10x TBE 버퍼	Bio Rad	1610733
20x SSC 버퍼	Fisher Scientific	BP1325-1
293T 셀	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP, 3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
	Agarose Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS 저장 형광체 스크린	Fisher Scientific	28956482
Church 및 Gibert의 하이브리드화 완충액	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA 라벨링 키트	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM, 고포도당, GltaMAX 보충제, 피루브산	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	추가 제한 효소도 구입해야 합니다
EDTA 0.5 M, pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
에탄올, 70%	Fisher Scientific
소 태아 세럼	VWR	97068-085
염산 용액, 12 M	Millipore Sigma	13-1683
이소프로판올	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA 및 siRNA 트랜스펙션 시약(완충액 포함	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge 고속 원심분리기 튜브	ThermoFisher Scientific	3139-0050
인산염 완충액 식염수, pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
인산염 완충액 식염수, pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
단백질분해효소 K	ThermoFisher Scientific	EO0491
단백질분해효소 K	ThermoFisher Scientific	EO0492
순수 셀룰로오스 크로마토그래피 용지	Fisher Scientific	05-714-4
순수 셀룰로오스 크로마토그래피 용지	Fisher Scientific	05-714-5
눈금자	Fisher Scientific	09-016
메스	Fisher Scientific	12-460-451
황산	나트륨 도데실Millipore Sigma	436143-25G
수산화나트륨	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 초고속 원심분리기	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell 수평 전기영동 시스템	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 스윙 버킷 로터	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M, pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드	ThermoFisher Scientific	25200056

BP82031GAL)