방법 논문

건강 및 질병의 조직 및 혈장 특이적 단백질체 변화 해명

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DOI:

10.3791/67240

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2025년 9월 23일

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1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

단백질체학은 단백질과 세포 활동의 상호 작용, 기능, 구성 및 구조에 대한 고처리량 평가입니다. 여기에서는 혈장 및 조직을 포함한 다양한 생체 샘플에서 총 단백질체 변화를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 본원에 보고된 방법론은 단백질을 함유하는 모든 바이오 샘플에 적용할 수 있습니다.

초록

단백질체학은 발현된 단백질의 구조, 기능, 상호 작용, 풍부함 및 생물학적 시스템 내에서 번역 후 변형에 초점을 맞춘 대규모 연구입니다. 예를 들어, 총 단백질체학의 중요한 하위 집합인 인산단백질체학은 단백질의 인산화 패턴과 변경에 대한 연구입니다. 본원에 기술된 방법론은 연구 동물 모델(즉, 흰족제비 및 마우스)으로부터 수집된 혈장, 뇌, 폐, 비장 및 간 조직에서 인산화 패턴을 포함한 전체 단백질 발현 프로파일의 변화를 밝히기 위한 전체 단백질체학 접근법을 보여줍니다. 이 기술은 단백질을 포함하는 거의 모든 바이오 샘플(예: 배양 세포)뿐만 아니라 다른 조직 유형에도 적용할 수 있습니다. 해부 후, 관심 조직을 급속 냉동하고 -80°C에서 보관했습니다. 그런 다음 단백질 무결성과 인산화 변화를 보존하기 위해 액체 질소와 함께 절구와 유봉을 사용하여 조직을 균질화했습니다. 총 단백질은 범용 뉴클레아제 및 프로테아제/포스파타제 억제제가 포함된 용해 완충액을 사용하여 조직 균질체에서 추출되었습니다. 조직에서 추출한 단백질 및 동등한 혈장을 상용 질량 분석기 샘플 준비 키트를 사용하여 제어된 프로테아제 분해에 의해 총 펩타이드로 전환되었습니다. 펩타이드는 초고성능 액체 크로마토그래피/Orbitrap-tribrid 탠덤 질량 분석법을 사용하여 직접 분석되었습니다. 구성 단백질의 정체는 종 특이적 아미노산 서열 라이브러리와 일치하는 단백질체학 생물정보학 소프트웨어를 사용하여 펩타이드 질량 스펙트럼 데이터에서 재구성되었습니다. 그 다음, 분석에는 특히 신뢰도가 높은 단백질 식별만 사용하여 엄격한 컷오프 기준이 포함되어야 합니다. 통계적으로 유의미한 단백질체 차이(>2배 변화, p < 0.05)는 대조군과 실험군 사이에 결정될 수 있습니다.

서론

프로테옴 실험과 데이터 분석의 조합인 단백질체학은 단백질을 식별 및 정량화하고 구성, 상호 작용, 번역 전 및 번역 후 변형(예: 인산화), 세포내 국소화 및 생리학적 조건에서의 구조를 기반으로 단백질을 특성화하는 데 중점을 둡니다1. 발현 단백질체학은 변화하는 생물학적 조건에서 다른 단백질의 정량적 비교를 다룹니다2. 또한 세포 증식, 분화, 노화 및 세포 사멸 메커니즘과 같은 주요 생물학적 기능을 직접 제어하는 복잡하고 상호 연결된 경로, 네트워크 및 분자 시스템의 지도를 프로파일링하는 데 매우 중요합니다. 최근 몇 년 동안 실험 기술이 크게 발전함에 따라 단백질체학 방법은 면역조직화학 및 효소 결합 면역흡착 분석을 포함한 기존 접근 방식에서 액체 크로마토그래피와 같은 고처리량 기술로 발전했습니다 3,4. 단백질체학 기반 접근법은 고유한 질병 표현형 및 하위 유형을 결정하고 치료 약물(약물단백질체학)에 대한 새로운 표적 상호작용을 식별하는 데 추진력을 얻고 있습니다. 예를 들어, 환자 계층화는 주로 동질적인 그룹을 정의하고 치료 요법을 안내하기 위한 게놈 접근법에 중점을 두었습니다. 그러나 전사 상태만으로는 이후에 번역된 단백질의 운명(예: 안정성 또는 변형)을 예측할 수 없습니다. 따라서 비게놈 메커니즘은 질병 발생, 진행, 중증도 및 치료제에 대한 내성에 더 많이 기여합니다 5,6,7.

단백질 발현과 활성의 정량적 비교를 통해 큰 혜택을 받은 연구 분야 중 하나는 신경퇴행성 질환 및 외상성 뇌손상(TBI) 분야의 바이오마커 발견입니다. 바이오마커 발견의 기초는 조기 발견과 잠재적 개입 표적을 용이하게 하는 진단 기술을 개발하는 것입니다. 생물정보학과 결합된 LC/MS-MS 기반 정량적 단백질체학은 신경교 섬유산성 단백질(GFAP) 및 유비퀴틴 카르복실 말단 가수분해효소 동종효소 L1(UCH-L1)을 포함한 주요 단백질 바이오마커를 발견하는 데 도움이 되었으며, 심각한 영향을 미치거나 관통하는 TBI 8,9. 예를 들어, 군인은 폭탄 폭발(즉, 폭발 TBI)에 노출되어 임무 수행 중에 TBI 사고를 자주 겪습니다. 그러나 폭발 유발 경미한 TBI로 인한 신경학적 결손의 근본적인 병리생물학은 불분명합니다. 따라서 폭발 유발 뇌 손상의 분자 및 미세 구조 메커니즘을 이해하려면 특정 바이오마커 대용자를 더 잘 식별해야 합니다. 단백질체 변화를 관찰함으로써 연구는 분열-융합 역학 손상, 산화적 인산화 감소 및 보상된 호흡 관련 효소 활성을 포함하여 뇌에서 모세포로 인한 산화 스트레스의 가능한 메커니즘이 미토콘드리아 기능 장애와 관련이 있음을 입증했습니다10. 아세틸화, 니트로실화, 탈아미노화 및 인산화와 같은 번역 후 변형의 모세포 유발 조절 장애의 초기 병인에 대한 통찰력은 또한 축삭 손상, 염증 및 혈액-뇌 장벽 파괴와 관련된 단백질 기능에 미치는 영향에 대한 추가 특성화를 제공할 수 있습니다11,12. 시스템 생물학 접근 방식의 발전으로 설치류와 흰족제비를 포함한 다양한 동물 종의 뇌 및 말초 조직의 총 프로테옴 정보를 매핑하는 것은 폭발 손상 연구의 핵심 절차가 되었습니다.

이 기사에서는 생리학적 현상과 병리학적 상태를 모니터링하는 데 광범위하게 사용되어 온 발현 단백질체학의 정량적 측면과 조직 또는 혈장에서 시작하는 번역 후 변형을 평가하기 위한 방법론 워크플로에 중점을 둡니다. 아래 방법론을 활용하면 샘플 준비 및 데이터 수집의 일관성과 신뢰성을 얻을 수 있습니다. 이 표준화된 방법론을 사용하면 조직 유형 및 특정 조직에 고유한 인산화 패턴에 걸쳐 보존된 단백질체 패턴을 결정하기 위해 비교할 수 있습니다. 이와 함께 여러 전임상 동물 모델 및 인간 임상 샘플에 대한 분석을 수행하여 잠재적으로 바이오마커 역할을 할 수 있는 보존된 인산화 패턴을 얻고 약물 치료 요법을 맞춤화할 수 있습니다.

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프로토콜

연구는 공중 보건 서비스 동물 복지 보증이 있는 AAALAC 국제 인증 시설에서 동물 복지법 및 실험 동물과 관련된 기타 연방 법령 및 규정을 준수하여 IACUC 승인 동물 사용 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 절차에 필요한 모든 소모품은 재료 표에 나열되어 있습니다. 절차는 7가지 구성 요소로 세분화됩니다.

주의. 조직을 균질화하기 위해 액체 질소로 작업할 때 적절한 안전 프로토콜을 따르는지 확인하십시오. 실험실 직원은 냉동 조직을 균질화하는 동안 냉동 장갑, 냉동 앞치마, 수술용 안면 마스크 및 안면 보호대를 착용했습니다. 이 균질화 기술은 박구와 유봉의 크기를 적절하게 조정하기만 하면 뼈와 같은 매우 단단한 물질을 포함한 모든 조직 유형에 활용할 수 있습니다. 초기 워크벤치 설정은 그림 1A 를 참조하십시오. 마우스와 흰족제비 조직을 균질화할 때 사용되는 크기는 재료 표 를 참조하십시오.

1. 절구와 유봉으로 조직의 극저온 분쇄

  1. 빈 수집 튜브의 무게를 측정하여 기록합니다. 수집 튜브에 있는 동안 분석 저울을 사용하여 조직의 무게를 측정하고 실험실 노트에 무게를 기록합니다. 티슈에서 빈 튜브의 무게와 튜브 무게를 빼서 사용된 티슈의 mg을 구합니다.
    참고: 단백질체 연구를 위해 평가된 조직에는 뇌, 폐, 간 및 비장이 포함됩니다. 전체 조직을 절구와 유봉을 사용하여 극저온으로 분말 형태로 분쇄했습니다.
  2. 액체 질소를 cryopod에 붓되 절반 미만으로 채워졌는지 확인하십시오.
  3. 샘플이 들어 있는 튜브와 이전에 고압멸균된 빈 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 냉동 포드에 있는 튜브 랙으로 옮깁니다. 이렇게 하면 절구와 유봉을 식히는 동안 샘플이 동결된 상태로 유지되어 균질화된 조직을 빈 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮길 때 샘플이 해동되는 것을 방지할 수 있습니다.
  4. 사용하기 전에 절구와 유봉에 액체 질소를 부어 이러한 기구를 식히십시오. 절구와 유봉은 냉동 각류 외부에 있습니다 (그림 1A, B).
  5. 액체 질소가 포함된 냉각된 모르타르로 조직을 옮깁니다(그림 1B).
  6. 유봉을 사용하여 냉동 조직에 반복적으로 압력을 가하고 조직이 미세한 분말로 분쇄될 때까지 유봉으로 조직에 대해 회전하고 분쇄하는 동작을 합니다(그림 1C).
    1. 과도한 힘을 가하지 않도록 하여 샘플이 모르타르 밖으로 쏟아질 위험이 있습니다. 유봉을 단단히 통제해야 합니다.
    2. 큰 조직을 균질화하는 동안 모르타르에 액체 질소를 추가하여 분쇄하는 동안 시료가 해동될 가능성을 줄입니다.
    3. 티슈를 갈아서 해동하지 않는지 확인하십시오. 해동 중인 경우 모르타르에 액체 질소를 추가로 넣으십시오.
  7. 금속 주걱의 끝을 액체 질소에 담가 식힙니다. 이는 균질화된 조직을 1.5mL 튜브로 쉽게 옮기는 데 도움이 됩니다. 이렇게 하면 이송 중에 조직이 해동되어 주걱에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다.
  8. 조직이 미세한 분말로 균질화되고 금속 주걱이 냉각되면 균질화된 조직 분말을 새 1.5mL 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
    1. 완료할 분석 수에 따라 샘플을 분취량으로 나눕니다.
      참고: 예를 들어, 이 연구의 샘플에 대해 4개의 분석을 완료해야 했으므로 균질화된 조직을 4개의 1.5mL 튜브에 균등하게 분취했습니다.
    2. 추가 균질화된 조직을 고압멸균된 5mL 스냅탑 수집 튜브에 보관하십시오.
  9. 분취된 조직은 향후 분석이 있을 때까지 -80°C 냉동고에 보관하고, 1년 이내에 실질적으로 사용하여 공기와 단백질의 가벼운 산화를 최소화합니다.
  10. 빈 수집 튜브의 무게를 측정합니다.
  11. 초기 측정값(수집 튜브와 샘플)에서 빈 수집 튜브의 무게를 빼서 조직 샘플의 무게를 얻습니다.

2. 단백질 분리를 위한 조직 용해

  1. 드라이아이스를 얼음 팬 용기에 담습니다.
  2. 드라이아이스에 튜브 랙을 놓고 식히십시오.
  3. -80°C 냉동고에서 균질화된 조직 샘플을 꺼내 냉각된 튜브 랙에 넣습니다. 이렇게 하면 샘플이 해동되는 것을 방지하여 계량 과정에서 단백질 분해 및/또는 인산화 변화를 일으킬 수 있습니다.
    1. 샘플이 들어 있는 1.5mL 튜브가 드라이아이스의 튜브 랙에 얼어 있는지 확인합니다.
  4. 드라이아이스에 새 50mL 표준 튜브를 넣습니다.
  5. 50mL 표준 튜브에서 캡을 제거하고 일회용 플라스틱 주걱을 50mL 표준 튜브에 넣어 시원하게 유지합니다. 이렇게 하면 샘플이 균질화 튜브로 옮겨지는 동안 주걱에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다.
  6. 조직 용해 및 단백질 분리를 위해 5개의 2.8mm 세라믹 비드(이 프로토콜에서는 균질화 튜브라고 함)가 포함된 2mL 튜브를 사용합니다.
  7. 영구 잉크 마킹 펜을 사용하여 캡과 균질화 튜브의 측면에 샘플 ID로 라벨을 붙입니다.
  8. 라벨이 붙은 균질화 튜브를 드라이아이스에 있는 튜브 랙에 넣어 튜브를 차갑게 유지하고 샘플 해동을 방지합니다.
  9. 균질화 튜브 하나를 분석 저울에 놓고 저울을 용기합니다.
  10. 균질화 튜브를 드라이아이스 위의 튜브 랙으로 되돌립니다.
  11. 비드가 들어 있는 균질화 튜브에서 뚜껑을 제거하고 냉각된 플라스틱 주걱 중 하나를 사용하여 분말 조직 샘플 5mg에서 10mg을 각 균질화 튜브로 옮깁니다.
  12. 균질화 튜브에 뚜껑을 다시 놓습니다.
  13. 분석 저울에서 균질화 튜브의 무게를 측정하고 균질화 튜브의 샘플 양을 기록합니다.
    1. 이 무게를 사용하여 효과적인 총 단백질 추출에 필요한 용해 완충액의 양을 결정합니다.
  14. 무게가 기록되면 샘플이 들어 있는 균질화 튜브를 드라이아이스 위의 튜브 랙에 다시 놓아 차갑게 유지합니다.
  15. 사용한 플라스틱 주걱은 폐기하십시오.
  16. 교차 오염을 방지하기 위해 이송하고 계량할 각 샘플에 대해 새롭고 깨끗한 플라스틱 주걱을 사용하십시오. 모든 샘플에 대해 2.9-2.15단계를 반복합니다.
  17. 모든 샘플을 개별 균질화 튜브로 옮긴 후 필요한 단백질 용해 마스터 믹스의 양을 계산합니다.
    1. 처리해야 하는 샘플의 수와 각 분말 샘플의 무게를 기준으로 계산되는 필요한 양의 단백질 용해 마스터 믹스를 준비합니다. 각 튜브에 조직 5mg당 100μL의 단백질 용해 마스터 믹스를 추가합니다.
    2. Protein Lysis Master Mix를 만들기 위한 시약 부피에 대한 회사 지침을 참조하십시오( 재료 표 참조).
  18. 균질화된 분말 샘플이 들어 있는 균질화 튜브를 4°C 콜드 블록에 넣습니다. 균질화 튜브는 더 이상 드라이아이스에 남아 있을 수 없습니다. 균질화 튜브를 콜드 블록에 놓으면 용해 용액이 얼지 않습니다.
  19. 균질화 튜브에서 뚜껑을 제거하고 적절한 용량의 피펫을 사용하여 필요한 계산된 양의 단백질 용해 마스터 믹스를 각 균질화 튜브로 옮깁니다.
    1. 균질화 튜브에 뚜껑을 다시 놓고 뚜껑이 단단히 닫힐 때까지 돌립니다.
  20. 샘플 튜브를 균질화기에 넣고 균질화를 위해 4°C에서 연조직 프로그램(속도 4500RPM, 사이클당 2 x 30초, 30초 일시 중지)에 설정합니다.
  21. 균질화 사이클이 완료되면 기기에서 튜브를 제거하고 4°C 콜드 블록에 다시 넣습니다.
    1. 샘플 튜브를 육안으로 검사합니다. 분말 샘플이 아직 보이지 않는지 확인하십시오. 샘플이 Protein Lysis Master Mix 전체에서 여전히 시각화되면 기기에서 조직 용해를 다시 완료합니다.
    2. 사용 중인 조직 유형에 대한 설정을 최적화합니다. 예를 들어, 섬유 기관(예: 심장)에서 파생된 분말 조직에는 추가 주기 또는 더 높은 RPM이 필요할 수 있습니다.
  22. 균질화 튜브를 원심분리기로 옮깁니다. 원심분리기에 4°C에서 10분 동안 16,000g 설정을 입력하고 원심분리기에서 시작을 누릅니다.
  23. 원심분리가 완료되면 균질화 튜브를 4°C 콜드 블록으로 조심스럽게 다시 옮깁니다.
  24. 새 1.5mL 튜브의 뚜껑과 측면에 샘플 ID 및 기타 관련 정보를 표시하여 라벨을 붙입니다. 라벨이 부착되면 이 1.5mL 튜브를 4°C의 저가운 블록에 넣습니다.
    참고: 튜브에는 최소한 동물 ID, 연구 시점, 동물 유형 및 조직 유형이 표시되었습니다.
  25. 균질화 튜브에서 4°C 콜드 블록에 보관된 각각의 표지된 1.5mL 튜브로 해당 단백질 용해물을 옮깁니다.
  26. 추가 분석을 위해 샘플을 -80°C에서 보관하십시오. 이것은 안전한 정차 지점입니다.

3. 총 단백질 정량

  1. -80°C 냉동고에서 샘플을 꺼내 얼음통의 젖은 얼음 위에서 샘플을 해동합니다.
  2. 해동되면 단백질 정량 키트의 모든 샘플과 표준물질을 최소 3초 동안 소용돌이치게 합니다.
  3. 개략도 레이아웃에 따라 표준물질, 샘플 및 적절한 블랭크의 각 반복 10μL를 96웰 마이크로타이터 플레이트에 추가합니다(그림 2A).
    참고: 각 조직 샘플에 대해, 단백질 용해물을 바람직하게는 인산염 완충 식염수로 1:100 희석하는 것이 단백질 분석 분석에 사용됩니다. 개략도 레이아웃은 단백질 분석에 사용되는 샘플의 수에 따라 변경될 수 있습니다. 샘플, 표준물질 및 적절한 블랭크는 단백질 농도 정확도를 평가하기 위해 96웰 마이크로타이터 플레이트에 3중으로 로드되지만, 많은 샘플이 플레이트에 맞아야 하는 경우 중복이 허용됩니다.
    1. 시작 조직의 양이 적은(즉, 5mg 미만) 샘플의 경우, 후속 단백질 분해에 사용할 수 있는 단백질 용해물의 양을 최대화하기 위해 단백질 분석에 단일 복제 또는 복제만 사용합니다.
    2. 정확한 피펫팅 및 보정된 피펫이 사용되는지 확인하십시오.
  4. 단백질 분석 시약 병을 여러 번 뒤집어 잘 섞은 다음 10mL 시약 저장소에 붓습니다.
  5. 200 μL 최대 용량의 다중 채널 피펫을 사용하여 150 μL의 단백질 분석 시약을 컬럼 1에 추가합니다.
  6. 위아래로 여러 번 피펫팅하여 단백질 분석 시약을 웰에 이미 들어 있는 10μL의 함량과 혼합하여 웰의 침전물을 줄이는 데 도움이 됩니다.
  7. 피펫 팁을 버리고 최대 용량 200μL 멀티채널 피펫에 새 팁을 놓습니다.
  8. 단백질 분석 시약이 전체 96웰 플레이트에 추가될 때까지 3.5-3.7단계를 반복합니다.
    1. 교차 오염을 방지하기 위해 웰의 각 컬럼에 새 피펫 팁을 사용하십시오.
    2. 단백질 정량화를 위한 빈 흡광도 값으로 사용하기 위해 시약이나 샘플을 추가하지 않은 상태에서 적어도 하나의 웰을 비워 두어야 합니다.
  9. 단백질 분석 시약이 필요한 모든 웰에 추가되면 96웰 플레이트를 알루미늄 호일 플레이트 씰로 덮습니다.
  10. 96웰 플레이트를 와류 기기에서 중간 속도로 1분 동안 소용돌이치게 한 다음 플레이트를 읽기 전에 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
  11. 96웰 플레이트와 알루미늄 호일 씰을 검사합니다. 시약이 알루미늄 호일 씰에 붙어 있으면 적절한 저울을 가지고 원심분리기 안에 놓습니다.
    1. 약 200g에 도달할 때까지 빠른 회전을 길게 누릅니다.
    2. 96웰 플레이트를 꺼내 알루미늄 호일 씰을 육안으로 검사하여 호일에 액체가 남아 있지 않은지 확인합니다.
  12. 알루미늄 호일 씰을 천천히 제거하고 투명 뚜껑을 96웰 플레이트에 다시 놓습니다(그림 2B).
  13. 비색 반응이 5분 동안 발생하도록 허용한 후 660nm의 분광 광도계에서 96웰 플레이트를 읽습니다.
    참고: UV/가시광선 분광 광도계를 사용한 흡광도 판독값은 실온에서 측정됩니다. 660nm 단백질 분석은 산성 조건에서 독점적인 염료-금속 복합체가 단백질에 결합하여 660nm에서 측정되는 염료의 흡수 최대값에 변화를 일으키는 것을 기반으로 합니다.
  14. 알려진 표준물질의 흡광도 판독값을 사용하여 그래프 소프트웨어(그림 2C-E)를 사용하여 표준 곡선을 생성하며, 이는 모든 샘플에 대한 단백질 농도를 계산하는 데 추가로 적용됩니다.

4. 단백질 소화

주의. 아래 프로토콜에 사용되는 유해 화학 물질로 작업할 때 적절한 안전 프로토콜을 따르는지 확인하십시오. 실험실 직원은 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 화학 연기 후드에서 이러한 단계를 완료했습니다. 이러한 화학 물질을 사용하기 전에 모든 안전 보건 자료를 검토하십시오.

  1. 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 세트에 튜브 뚜껑과 측면에 샘플 ID를 영구 잉크로 라벨을 붙입니다. 기타 관련 정보를 포함하십시오.
    1. 표준 곡선 방정식, 시료 흡광도 판독값 및 희석 계수를 기반으로 각 시료의 단백질 농도를 마이크로리터당 마이크로그램(μg/μL)으로 계산합니다. 이 값을 사용하여 100μg의 단백질을 포함하는 샘플 용해물의 필요한 부피를 계산합니다(그림 2C-E). 이 계산된 양의 샘플 용해물을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  2. 용해 완충액으로 최종 부피를 100μL로 구성합니다. 이것은 소화 프로토콜에 필요한 시작 부피입니다.
    참고: 단백질 샘플과 용해 완충액의 최종 부피는 100μL와 같아야 합니다.
  3. 이전에 발표된 문헌에 따르면 소화를 위해 혈장 1.5μL를 사용하는데, 이는 단백질 100μg에 해당합니다.
  4. 각 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 50μL의 환원 용액(10mM 디티오스레이톨)을 넣고 상단을 닫은 다음 3초 동안 잠시 소용돌이치게 합니다. 그런 다음 각 샘플에 50μL의 알킬화 용액(30mM 요오도아세트아미드)을 첨가하고 상단을 닫고 3초 동안 소용돌이치게 합니다.
  5. 히트 블록을 사용하여 95°C에서 11분 동안 샘플을 배양하여 단백질 샘플을 각각 환원 및 알킬화합니다. 이것은 모든 이황화 가교를 절단하고 아세트아미드 그룹으로 덮어 재형성을 방지하여 단백질을 완전히 풀린 상태로 변성시키고 펩타이드 소화 부위의 노출을 최대화합니다.
  6. 배양 후 히트 블록에서 샘플을 제거하고 RT로 식힙니다.
  7. 샘플이 식을 때까지 기다리는 동안 동결건조된 트립신/Lys-C 프로테아제 혼합물(1:1 비율, 각 50μg)을 고체 시약 1바이알, 즉 각각 0.1μg/μL에 515μL의 액체를 첨가하여 효소 재구성 용액으로 재구성합니다. 트립신은 심각한 자극 물질 및 알레르겐이 될 수 있으므로 프로테아제 용액과의 직접적인 피부 접촉 및 그 이후의 모든 단계를 피하십시오.
  8. 샘플이 RT로 냉각되면 재구성된 트립신/Lys-C 프로테아제 믹스 50μL(각각 2.5μg)를 환원 및 알킬화 단백질 샘플 용액에 넣고 잠시 소용돌이치게 합니다.
  9. 37°C의 열혼합기에서 배양하고 단백질 샘플을 소화하기 위해 3시간 동안 1000rpm으로 설정합니다.
    참고: Lys-C 프로테아제는 접힘 또는 아미노산 서열(예: Lys-Pro 결합)으로 인해 트립신에 의한 소화에 저항하는 부위를 절단하는 데 도움이 됩니다. 이것은 각 단백질을 합리적으로 작은 크기와 총 전하의 알 수 있는 수많은 펩타이드로 환원시킬 뿐만 아니라 동일한 분해 조건을 면밀히 따를 경우 재현성이 높습니다. 소화 중 3시간의 배양 시간은 모든 단백질의 완전한 절단을 보장하기 위해 권장되는 최소 시간입니다.
  10. 3시간의 배양 후 손가락 화상을 방지하기 위해 한 쌍의 집게를 사용하여 열혼합기에서 제거합니다.
  11. 50 μL의 분해 정지 용액(6% 트리플루오로아세트산 또는 물의 포름산)을 샘플에 넣고 잠시 소용돌이치게 합니다.
    참고: 이것은 두 프로테아제가 중성 pH 7-8에서 최대 활성을 갖기 때문에 반응을 억제합니다.
  12. -80°C 냉동고에 샘플을 보관하면 잔류 프로테아제 활성도 중단됩니다. 이것은 안전한 정차 지점입니다.

5. 펩타이드 세척, 건조 및 재현탁

참고: 이 절차는 주로 LC/MS-MS 기기를 쉽게 손상시킬 수 있는 분해 시약, 특히 비휘발성 염을 제거하고 생성된 펩타이드를 분리 및 농축하는 데 도움이 됩니다. 펩타이드 정화는 키트에서 제공하는 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 수행되며, 이 컬럼은 처음에 펩타이드를 포착한 다음 특히 염을 씻어낼 수 있는 크기 배제(겔 여과) 수지로 미리 포장되어 있습니다. 키트 시약은 독성 유기 용매를 포함하므로 화학 연기의 스핀 컬럼으로 완전히 옮깁니다.

주의. 아래 프로토콜의 유해 화학 물질을 다룰 때 PPE 착용 및 유해 폐기물 봉쇄 규정을 포함한 적절한 안전 절차를 따르는지 확인하십시오. 화학 훈기 후드에서 이 단계를 완료하고 이러한 화학 물질로 작업하기 전에 모든 안전 데이터 시트를 검토하십시오.

  1. -80°C 냉동고에서 샘플을 꺼내 샘플을 RT로 가져옵니다.
  2. Peptide Clean-Up 컬럼 하단의 흰색 캡을 제거하고 녹색 상단 캡을 푼 다음 2mL 수집 튜브에 넣습니다.
  3. 이것을 원심분리기에 넣고 뚜껑을 닫고 시작을 누른 다음 3000g에서 2분 동안 원심 분리하여 모든 선적 전 컨디셔닝 액체를 제거합니다.
  4. 유해 폐기물 용기에 플로우 스루를 버리고 펩타이드 클린업 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣습니다.
  5. 펩타이드 클린업 컬럼의 녹색 뚜껑에 샘플 ID로 라벨을 붙이고 잉크 마킹 펜을 사용합니다.
  6. 부피가 약 300μL인 단백질 소화 제제를 200μL 피펫(예: 150μL 2회)을 사용하여 건식 펩타이드 클린업 컬럼으로 부드럽게 옮깁니다.
    1. 스핀 컬럼의 수지 상단에 기포가 관찰되지 않는지 확인하십시오. 기포가 관찰되면 컬럼을 가볍게 두드리거나 깨끗한 10μL 피펫 팁을 사용하여 기포를 분산시켜 기포를 제거합니다.
      참고: 갇힌 기포는 샘플이 수지로 원활하게 전환되는 것을 방해하여 펩타이드 세척 및 수율의 효율성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
  7. 이것을 원심분리기에 넣고 뚜껑을 닫고 시작 을 누르고 1,500g에서 2분 동안 원심 분리합니다.
  8. 유해 폐기물 용기에 플로우 스루를 버리고 펩타이드 클린업 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣습니다.
  9. 다시 200μL 피펫을 사용하여 컬럼 레진 위에 300μL의 세척액 A(물, 0.1% 트리플루오로아세트산/TFA)를 추가합니다.
    1. 스핀 컬럼의 수지 상단에 기포가 관찰되지 않는지 확인하십시오. 기포가 관찰되면 컬럼을 가볍게 두드려 기포를 제거하거나 깨끗한 10μL 피펫 팁을 사용하여 기포를 분산시킵니다.
  10. 이것을 원심분리기에 넣고 뚜껑을 닫고 시작을 누르고 1,500g에서 2분 동안 원심분리합니다 .
  11. 유해 폐기물 용기에 플로우 스루를 버리고 펩타이드 클린업 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣습니다.
  12. 다시 200μL 피펫을 사용하여 컬럼 레진 위에 300μL의 세척액 B(5% 메탄올, 0.1% TFA)를 추가합니다.
    1. 스핀 컬럼의 수지 상단에 기포가 관찰되지 않는지 확인하십시오. 기포가 관찰되면 컬럼을 부드럽게 두드려 기포를 제거하거나 깨끗한 10μL 피펫 팁을 사용하여 기포를 분산시킵니다.
  13. 이것을 원심분리기에 넣고 뚜껑을 닫고 시작 을 누르고 1,500g에서 2분 동안 원심 분리합니다.
  14. 유해 폐기물 용기에 플로우 스루를 버리고 펩타이드 클린업 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣습니다.
  15. 5.12-5.14단계를 한 번 더 반복하여 컬럼이 세척액 B로 두 번 세척되도록 합니다.
  16. 펩타이드 클린업 컬럼을 새 2mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    1. 이 단계에서 사용되는 2mL 미세 원심분리기 튜브가 키트에서 제공하는 저단백질 결합 수집 튜브인지 확인합니다.
    2. 저단백 결합 수집 튜브의 사용 가능한 양을 보존하려면 이전 세척 단계에 표준 실험실 수집 튜브를 사용하십시오.
  17. 다시 200μL 피펫을 사용하여 컬럼 레진 위에 300μL의 용출 용액(50% 아세토니트릴, 0.1% TFA)을 추가합니다.
    1. 스핀 컬럼의 수지 상단에 기포가 관찰되지 않는지 확인하십시오. 기포가 관찰되면 컬럼을 가볍게 두드려 기포를 제거하거나 깨끗한 10μL 피펫 팁을 사용하여 기포를 분산시킵니다.
  18. 이를 원심분리기에 넣고 뚜껑을 닫고 시작을 누른 다음 1,500g에서 3분 동안 원심분리하여 깨끗한 펩타이드 샘플을 새로운 저단백 결합 2mL 수집 튜브에 수집합니다.
    1. 원하는 경우 용출된 깨끗한 펩타이드 용액 125μL(약 절반)를 200μL 피펫을 사용하여 1mL 유리 바이알에 옮기고 -80°C에서 보관합니다.
      참고: 이 분취량은 시중에서 판매되는 키트에 의해 수행되는 펩타이드의 탠덤 질량 태그(TMT) 라벨링과 같은 추가 분석에 나중에 사용할 수 있으며, 샘플, 특히 독립적으로 준비된 세트 전반에 걸쳐 보다 정확한 정량화를 수행할 수 있습니다.
  19. 건조 및 재구성을 진행할 준비가 될 때까지 나머지 샘플(약 175μL)을 저단백 결합 2mL 튜브에 -30°C에서 보관합니다. 이것은 안전한 정차 지점입니다.
  20. 샘플을 건조하려면 펩타이드 샘플을 -30°C에서 RT까지 해동합니다. 펩타이드 세척 직후 건조 및 재구성을 진행하는 경우 이 단계를 무시하십시오.
  21. 2mL 미세 원심분리기 튜브를 열고 진공 원심분리기 농축기에 넣습니다.
    1. 고르지 않은 수의 샘플이 동시에 실행되는 경우 진공 원심분리기 농축기의 균형을 맞춰야 합니다.
    2. 진공 원심분리기 농축기 뚜껑을 닫고 시작을 누릅니다.
    3. 가열하지 않고 진공 원심분리기 농축기에서 샘플을 3시간 동안 실행하도록 합니다.
    4. 튜브를 주기적으로 검사하여 내부에 액체가 남아 있지 않은지 확인하면 LC/MS-MS 기기의 분리 컬럼에 펩타이드가 결합하는 데 방해가 될 수 있습니다.
    5. 액체가 여전히 관찰되면 추가 시간 동안 샘플을 계속 회전시킵니다.
    6. 30분에서 1시간 사이에 튜브에 액체가 남아 있는지 확인하십시오.
      알림: 펩타이드는 진공 조건에 있기 때문에 이 과정에서 매우 안정적이며 진공 원심분리기 농축기 작동만으로 생성된 단기간의 건조 또는 적당한 따뜻함으로 인해 악화되지 않습니다.
  22. 건조되면 즉시 샘플을 MS 등급 물에 있는 0.1% 포름산 50μL에 재현탁합니다(예: 물 5mL에 100% 포름산 5μL).
    1. 200μL 피펫을 사용하여 건조된 펩타이드 샘플이 들어 있는 2mL 저단백질 결합 튜브의 바닥에 50μL의 0.1% 포름산을 추가합니다.
  23. 캡을 닫은 다음 15초 동안 소용돌이치십시오.
  24. 200μL 피펫을 사용하여 재구성된 샘플을 각각의 1mL 유리 바이알로 옮깁니다.
  25. 재구성된 샘플이 들어 있는 유리 바이알을 -30°C에서 보관하고 가능한 한 빨리 LC-MS/MS 기반 접근 방식으로 분석합니다.
    참고: 냉동 펩타이드 샘플은 단기 보관의 경우 -30°C, 장기 보관의 경우 -80°C에서 안정적입니다.

6. UHPLC/MS-MS 기기에서 펩타이드 샘플의 데이터 수집

주의. 초고성능 액체 크로마토그래피/Orbitrap tribrid 탠덤 질량 분석기 시스템으로 작업할 때 적절한 안전 프로토콜을 따르는지 확인하십시오. 실험실 직원은 PPE를 착용하고 UHPLC/MS-MS 제조업체에서 제공하는 공식적인 실습 기기 교육을 받았습니다. 주요 주의 사항은 UHPLC의 경우 산성 및 유기 용매 이동상과 MS의 경우 고전압 이온화 소스를 적절하게 취급하는 것입니다.

  1. 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC) 시스템을 사용하여 펩타이드 분리를 수행합니다. LC 컬럼은 동일한 재료의 가드 프리 컬럼 뒤에 인라인으로 배치된 2μm, 100Å, 50μm x 15cm 크기의 전기 분무 가능한 C18 역상, 급속 분리(RSLC) 설계입니다.
  2. UHPLC 이동상은 물 속 0.1% 포름산(용매 A), 아세토니트릴 속 포름산 0.1%(용매 B), 물 90% 및 메탄올 10% 메탄올 0.1% 포름산(용매 C)을 사용합니다.
    참고: 이동상 제조에 사용되는 모든 용매와 포름산은 LC/MS 등급 인증을 받았으며 필요한 경우에만 제조됩니다. UHPLC는 펌프 앞에 여과 및 탈기 장치가 있으므로 이동상을 수동으로 여과하고 공기를 퍼지하지 않습니다.
  3. 혈장 및 조직 샘플을 위해 준비된 총 펩타이드의 프로그래밍된 주입을 처음부터 3μL로 설정하며, 이는 사용된 단백질의 시작 양에 따라 결정되는 펩타이드 물질의 ~3μg에 해당합니다.
    참고: 이것은 최대 단백질 식별을 위한 이상적인 MS 신호 강도를 생성해야 합니다. 주입량을 최대 15μL로 늘려 신호 출력을 더욱 높이거나 과부하가 명백한 경우 1μL까지 줄일 수 있습니다.
  4. 컬럼과 자동 시료 주입기를 각각 40°C 및 10°C로 유지합니다.
  5. UHPLC 나노 펌프를 사용하여 단백질체학 수집을 위한 용매 유량을 물(A)에서 아세토니트릴(B) 이동상의 선형 분리 구배로 일정한 0.3 μL/min으로 설정합니다.
  6. UHPLC 로딩 펌프를 초기에 5μL/min으로 설정하여 물과 메탄올 이동상(C)을 사용하여 주입 주사기 및 샘플 루프(20μL 용량)를 세척합니다.
  7. 총 80분 이상의 샘플 분리 동안 LC 구배(선형 곡선)를 다음과 같이 설정합니다. 초기 - 5% B; 0-60분 - 32% B; 60-61분 - 95% B; 61-65분 - 95% B; 65-66분 - 2% B; 및 66-80분 - 2% B. 마찬가지로 로딩 펌프를 일정한 100%의 A로 작동하되 다음과 같이 유량을 선형적으로 조정합니다. 초기 - 5 μL/min; 0-5분 - 1μL/분; 5-61분 - 5μL/분; 및 61-80분 - 5μL/분(그림 3A).
  8. 알려지지 않은 펩타이드 샘플을 순차적 중복 실행으로 주입합니다.
  9. 캐리오버를 방지하기 위해 다음과 같이 총 35분 동안 잘린 LC 구배(선형 곡선)를 사용하여 샘플 사이에 물에 0.1% 포름산을 최소 2회 순차적으로 블랭크 주입합니다. 초기 - 5% B; 0-23분 - 32% B; 23-24분 - 95% B; 24-30분 - 95% B; 30-31분 - 2% B; 및 31-35분 - 2% B(그림 3B).
    1. 로딩 펌프 LC 기울기 설정이 변경되지 않았는지 확인합니다.
    2. 간(예: 담즙산)과 같이 높은 수준의 내인성 오염 물질이 있는 펩타이드 샘플의 경우 3-5개 샘플마다 그리고 LC 컬럼을 세척하는 데 도움이 되도록 실행이 끝날 때 세 번째 블랭크를 포함합니다. 이는 아세토니트릴, 이소프로판올, 메탄올 및 물을 각각 25%씩 함유한 용액 1-2μL를 주입하는 것으로 구성됩니다.
    3. 대안으로, 또는 위의 단계와 함께 다음과 같이 시스템 세척으로 총 35분에 걸쳐 백분율 변화 강화 LC 구배(즉, 시소)를 수행한다: 초기 - 2% B; 0-3분 - 2% B; 3-4분 - 95% B; 4-10분 - 95% B; 10-11분 - 2% B; 및 11-15분 - 2% B; 15-16분 - 95% B; 16-20분 - 95% B; 20-21분 - 2% B; 21-25분 - 2% B; 25-26분 - 95% B; 26-30분 - 95% B; 30-31분 - 2% B; 및 31-35분 - 2% B(그림 3C).
  10. Orbitrap 및 이온 트랩 조합 탠덤 사중극자 질량 분석기(MS-MS) 시스템을 사용하여 LC 컬럼에서 분리되고 용출되는 펩타이드, 즉 해당 분자량의 검출을 수행합니다.
    1. 샘플 실행을 수행하기 전에 LC 컬럼을 장치의 왼쪽 상단 전면 모서리에 있는 MS 기기의 교체 가능한 나노 스프레이 이온화(NSI) 소스의 표면에 직접 연결합니다.
      참고: 이렇게 하면 LC 이동상 용매의 하전 미세 방울 내부에 부유하는 펩타이드를 검출기의 이온 전달 튜브 입구로 전달하는 LC 컬럼의 내장 전기 스프레이 바늘이 노출됩니다.
    2. 또한 전기분무 휘발 효율을 높이려면 NSI 소스의 내장 가열 장치를 켜고 40°C로 설정하십시오.
  11. 또한 샘플을 실행하기 전에 MS 기기에 압축 질소와 헬륨 가스가 만족스러운 외부 입력이 있는지 확인하십시오. 이를 달성하려면 각 가스의 초고순도 등급, 300 크기 강철 실린더 탱크를 사용하여 이를 달성하며, 레귤레이터 게이지는 각각 60psi와 40psi의 정적 유량 압력으로 설정되어 있습니다.
  12. MS 기기가 질소 가스 입력의 불안정성에 대한 경고를 표시하면 압력을 최대 100psi까지 올립니다. 탱크가 최소 10-20% 이상 가득 차 있는지 확인하며, 이는 ~250-500psi의 상단 밸브 게이지 판독값입니다. 그렇지 않은 경우 새 것으로 변경하십시오. 전체 용량의 10% 미만으로 떨어지면 MS 기기로 오염 물질이 유입되어 가스 탱크 바닥에 침전될 위험이 있습니다.
  13. 펩타이드 및 번역 후 변형의 최적 검출을 위해 설계된 제어 소프트웨어 제공 템플릿을 사용하여 질량 분석기 방법을 미리 만들고 다음 표준 조건을 입력합니다.
    1. 총 감지 기간을 80분으로 설정합니다.
    2. 일반 검출 모드를 펩타이드로 설정합니다.
    3. NSI 소스를 포지티브 모드(즉, 펩타이드 이온 전하)로 설정합니다.
    4. 나노 스프레이 바늘 전압을 2000V로 설정하고 정적으로 유지합니다.
    5. 질소 가스 입력을 NSI로 설정하고 감지기를 정적으로 설정합니다.
    6. 이온 전사 튜브 온도를 275°C로 설정합니다.
    7. 전체 펩타이드의 질량(즉, 모 이온; MS1)을 사용하여 스캔 범위를 350-2000m/z로, RF 렌즈 를 30%, 최대 주입 시간을 자동으로, orbitrap 질량 분석기를 120,000 분해능으로 설정합니다.
      참고: 기기의 대체 이온 트랩 기능은 오비트랩에 비해 이러한 유형의 분자를 모니터링하는 데 덜 민감하기 때문에 펩타이드 질량을 스크리닝하는 데 사용되지 않습니다.
    8. 2-7 범위의 여러 전하 상태를 갖는 펩타이드를 구별하도록 이온 필터를 설정합니다. 이를 통해 기기는 데이터를 기록하는 동안 분자의 본질적으로 감지된 전하 비율 (m/z) 질량을 정확한 질량으로 자동 변환 할 수 있습니다. 마찬가지로, 단일 전하 상태(m/z = 1)만 갖는 펩타이드는 정확한 질량을 얻기 위해 변환 계수가 필요하지 않습니다.
    9. 이온에 대한 동적 배제 게이 트를 60초 동안 1패스, ±10ppm 질량 허용 오차로 설정하고 천연 동위원소 원자가 존재하는 분자(예: 14C)를 떨어뜨립니다.
    10. 펩타이드에 대해 생성된 신원 확인 단편의 대량을 검출합니다(즉, 딸 이온; MS2)를 사용하여 기기를 데이터 종속 수집(DDA 모드)으로 설정합니다.
    11. m/z = 1.6의 질량 변동성 허용 오차 창에 대한 설정을 사용하여 사중극자 분리로 전체 펩타이드(즉, 모 이온)를 캡처합니다.
    12. 전자 충격 모드를 HCD(즉, 질소 및 헬륨 가스를 전자 전달제로 사용하는 고에너지 충돌 해리), 충돌 에너지를 30%, 스캔 범위를 자동으로, 최대 주입 시간을 자동으로, Orbitrap 질량 분석기를 30,000 분해능으로 설정하여 포획된 펩타이드의 단편화를 수행합니다.
    13. 신호 피크 모양을 중심 형식으로 설정하여 최종 데이터(MS1 및 MS2 이온)를 수집합니다.
  14. 아래에 설명된 대로 일반적으로 각 시료 배치 실행 전에 기기를 정기적으로 교정하여 검출된 펩타이드에 대한 정확한 질량 측정을 유지합니다.
    1. 제어 소프트웨어를 사용하여 MS 기기를 이온 소스 전원 끄기 상태로 전환하고 NSI 소스를 장치의 대체 내부 가열 전기 스프레이 이온화(HESI) 소스로 전환합니다. 이것은 LC 펌프에 대해 매우 큰 시료 주입량과 그에 상응하는 높은 유속(1-2500 μL/min)이 필요할 수 있는 응용 분야(예: 대사체학 및 약물 약동학 실험)에 사용되는 소스입니다.
    2. 제어 소프트웨어에서 전체 교정 확인 옵션을 선택합니다.
    3. 테프론 코팅 플런저와 스테인리스 스틸 무딘 바늘이 있는 500μL 유리 주사기에 시중에서 판매되는 MS 표준 용액을 채운 다음 PTFE 모세관 라인을 HSEI 소스에 연결합니다(전원이 꺼진 상태에서).
      참고: 여기에 사용된 표준물질은 m/z = 50-2800의 질량 범위에 걸쳐 광범위한 가능한 화학 결합 유형, 특히 펩타이드와 관련된 화학 결합 유형(예: 아미드기)을 포괄하는 천연 및 합성 분자(예: 카페인)의 혼합물을 포함합니다.
    4. 주사기 펌프를 사용하는 것처럼 3-5 μL/min의 속도를 사용하여 MS 표준물질을 HSEI 소스에 지속적으로 주입합니다(전원이 켜진 상태에서). 제어 소프트웨어 라이브 뷰 창에 표준 피크의 안정적인 패턴이 표시되면 자동 교정 검사를 활성화합니다.
      참고: 표준물질에 대한 질량 측정의 감도와 정확도에 문제가 발견되지 않으면 전체 교정에 성공하는 데 일반적으로 40분 < 걸립니다. 마찬가지로, 기기가 검사된 모든 MS 하드웨어 매개변수를 통과하는 경우에만 샘플 실행에 신뢰할 수 있는 것으로 간주됩니다.
    5. NSI 소스와 LC 컬럼을 재설정한 다음 1-10ng(예: 1, 2, 6 및 10ng)를 포함하는 총 주입량으로 인간[Glu 1]-피브리노펩티드 B(Glu-Fib)의 표준 용액을 실행하여 교정 성공을 확인합니다. 미지의 샘플에 대해 위에서 설명한 것과 동일한 LC 분리 및 MS 검출 방법을 사용하십시오.
    6. 적절한 LC 머무름 시간(~20분), MS1 및 MS2 이안의 존재(m/z = 1285.54, 813.39, 785.84, 445.12, 333.19 및 175.12), 주입량에 따른 피크 면적 증가의 선형성에 대한 Glu-Fib 표준물질을 확인하십시오.
    7. 그런 다음 제어 및 데이터 캡처 소프트웨어를 사용하여 미지의 펩타이드 및 샘플 유형, 파일 이름, 샘플 ID, 데이터 경로, LC/MS 기기 분석법, 바이알 위치 및 주입량을 입력하기 위한 열이 포함된 빈 샘플을 실행하기 위한 서열 테이블을 생성합니다(그림 3D-E).
    8. 결과 MS 데이터 파일(확장자: RAW, 각각 500 - 800 GB)을 기기 컴퓨터 하드 드라이브의 지정된 경로 폴더에 저장합니다. 그런 다음 이러한 파일을 나중에 설명하는 대로 생물정보학 소프트웨어를 구동할 수 있을 만큼 강력한 워크스테이션 컴퓨터로 전송하여 매우 광범위하고 복잡한 펩타이드 질량 스펙트럼 데이터(즉, MS1 및 MS2 신호)를 해당 총 단백질 구성 프로파일로 변환합니다.

7. 원시 MS 데이터를 대표적인 총 프로테옴 결과로 변환

참고: 펩타이드 샘플에 대해 캡처된 원시 MS 데이터는 생물정보학 소프트웨어를 사용하여 총 단백질 조성 프로파일(프로테옴)으로 처리됩니다. 간단히 말해서, 생물정보학 소프트웨어는 단백질의 아미노산 서열에 대한 광범위하고 고유한 범위를 통해 원시 MS 데이터를 웹 기반 종 특이적 프로테옴 참조 라이브러리에서 발견된 알려진 펩타이드 MS1 및 MS2 스펙트럼과 일치시켜 샘플의 원래 단백질을 재구성합니다. 식별된 각 단백질의 상대적 풍부도는 일치하는 고유 펩타이드의 MS1 신호 강도를 사용하여 프로그램에 의해 결정됩니다. 결정된 풍부도는 샘플 간에 안정적으로 비교할 수 있지만 동일한 준비 배치 내에서 동일한 LC 및 MS 설정을 사용하여 실행되는 경우에만 가능합니다. 그렇지 않으면 각 샘플 내에서 펩타이드의 선택적 TMT 라벨링과 같이 내부 표준/리포터 이온 회수율을 기반으로 앞서 언급한 절대 정량 기술을 사용해야 합니다.

  1. 웹 기반 라이브러리에서 프로테옴 참조 파일을 워크스테이션 컴퓨터의 하드 드라이브에 다운로드합니다.
    1. 관심 있는 샘플 종(예: 흰족제비/ Mustela furo)에 대해 Uniprot 웹사이트에 있는 데이터베이스를 사용하여 이를 찾으십시오. 이를 FASTA 파일이라고 합니다. 프로테옴 검색 도구 및 테이블 보기를 사용하여 프로테옴 참조 파일을 찾은 다음 다운로드합니다.
    2. 생성되는 단백질 식별의 가능한 수를 최대화하려면 FASTA 파일을 만들 때 Uniprot 데이터베이스에 대한 위원회 동료 검토(Swiss-Prot) 및 미검토(TrEMBL) 항목을 모두 선택합니다. 마찬가지로 단백질에 대해 검토된 모든 이소형을 포함하는 옵션을 선택합니다.
  2. 생물정보학 소프트웨어(예: Proteome Discoverer)를 시작 페이지 탭으로 연 다음 관리 탭을 선택합니다.
  3. FASTA 파일 유지 하위 탭으로 이동한 다음 실험을 위해 생성된 위의 종별 FASTA 파일을 프로그램에 다운로드합니다.
  4. 시작 페이지 탭으로 돌아가서 새 연구/분석을 클릭한 다음 대화상자의 연구 이름 필드에 연구 이름을 입력하고 연구 루트 디렉토리 필드에 연구를 저장할 파일 폴더를 선택합니다.
  5. 처리 워크플로 및 합의 워크플로 필드는 나중에 선택되므로 지금은 비워 둡니다.
  6. 확인을 클릭하여 대화상자를 저장하고 종료하면 연구 정의 페이지가 나타납니다.
  7. 연구 정의 탭으로 이동하여 왼쪽 가운데 있는 연구 설명 상자에 프로젝트 세부 정보를 입력합니다.
  8. 입력 파일 탭으로 이동하여 파일 추가를 클릭합니다.
    1. 그러면 총 단백질 구성 프로필(프로테옴) 결과로 처리되는 데 필요한 원시 데이터 파일을 선택하고 컴퓨터의 하드 드라이브에서 다운로드할 수 있는 대화 상자가 나타납니다.
  9. 이제 입력 파일 탭 아래에 나열된 원시 MS 데이터 파일을 클릭하여 개별적으로 또는 한 번에 모두 선택하고 강조 표시할 수 있습니다.
  10. 그것들을 끌어다 놓습니다 분석 상자의 분석 섹션 처리 단계 하위 상자의 일부로 오른쪽 가운데에 있습니다.
  11. Workflows(워크플로우) 탭으로 이동하여 오른쪽 가운데에 있는 Analysis(분석) 상자의 Processing Step(처리 단계) 헤더 옆에 있는 Edit(편집)를 클릭합니다.
  12. Open Common을 클릭하고 ProcessingWF_Tribrid 폴더에서 HCD 단편화 기반 MS 검출에서 얻은 인단백질 하위 식별을 위해 특별히 지정된 처리 워크플로 파일을 선택합니다(그림 4A).
    참고: 그러면 편집 가능한 노드가 포함된 처리 단계 다이어그램이 워크플로 트리 상자에 나타납니다. 아래에 설명된 대로 사용자가 실험별 정보를 입력해야 함을 나타내는 느낌표로 표시된 두 개의 노드가 있습니다.
  13. 처리 워크플로우 트리 다이어그램에서 을 클릭하고 Spectrum Files RC 노드를 엽니다.
    1. Parameters of Spectrum Files RC 범주에서 실험 관심 단백질을 식별하기 위해 검색할 펩타이드 MS 스펙트럼의 종별 참조 라이브러리에 대해 이전에 Uniprot 웹 사이트를 사용하여 생성된 FASTA 파일을 단백질 데이터베이스 매개변수에서 찾아 선택합니다.
  14. Sequest HT 노드를 클릭하고 열고 다음 세 가지 변경을 수행합니다.
    1. Protein Database 매개변수에서 위에서 설명한 대로 동일한 FASTA 파일을 선택합니다.
    2. 효소 이름 매개변수에서 트립신(전체) 또는 원래 펩타이드 분해물을 준비하는 데 사용되는 주요 및 백업 프로테아제인 Lys-C를 선택합니다.
    3. 동적 수정 매개변수에서 최소한 Phospho / +79.966 Da (S, T, Y)가 선택되었는지 확인합니다.
      1. 후자의 설정을 사용하여 인산염 그룹(m/z = 79.97)의 해당 MS 스펙트럼 손실을 찾아 인산화에 의해 번역 후 변형된 단백질과 관련된 펩타이드를 밝힙니다.
      2. MS2 단편화 패턴의 예상되는 변경에 의해 인산염이 점유하는 아미노산 부위(즉, 세린, 트레오닌 또는 티로신)를 찾습니다.
      3. 관련 그룹의 정확한 질량 손실이 알려진 경우 이 시점에서 동일한 방식으로 일상적인 관심의 다른 단백질 번역 후 변형(예: 메틸화, 아세틸화, 미리스타일화)을 Sequest HT 노드에 추가합니다. 마찬가지로, 인산화 부위에 대한 검색을 덜 자주 보고되는 다른 아미노산, 예를 들어 히스티딘으로 확장합니다.
        참고: 처리 단계에 대한 워크플로 트리의 Spectrum Files RC 및 Sequest HT 노드는 매개변수를 조정해야 하는 유일한 두 노드입니다.
    4. 나머지는 제조업체에서 가장 많은 수의 지정된 관심 단백질 식별을 생성하도록 이미 최적화되었으므로 기본 설정으로 둡니다. 마찬가지로 이는 워크플로 트리의 다른 모든 노드에도 적용됩니다.
    5. Percolator 및 IMP-ptmRS 노드가 워크플로우 트리의 끝에 포함되어 있는지 확인합니다.
      참고: 여과기는 반복 피팅을 사용하여 최종 결과를 크게 개선합니다. IMP-ptmRS는 인산화를 포함한 모든 단백질 번역 후 변형의 적절한 식별 및 부위 국소화를 보고하는 데 필수적입니다.
  15. 워크플로우 탭으로 돌아가서 오른쪽 상단에 있는 분석 상자의 합의 단계 헤더 옆에 있는 편집을 클릭합니다. 그러면 합의 단계에 대한 워크플로 트리 다이어그램이 나타납니다.
  16. Open Common을 클릭하고 ConsensusWF 폴더에서 단백질 구성 프로파일(프로테옴) 결과에 대해 원하는 출력 형식을 생성하는 합의 워크플로 파일을 선택합니다(그림 4B).
    참고: 편집 가능한 노드가 포함된 합의 단계 다이어그램이 워크플로 트리 상자에서 열립니다. 데이터 처리에 사용되는 다이어그램은 단백질 상대 풍부도의 정량화를 용이하게 하기 위해 초기 MSF 파일 노드에서 분기로 인라인 Feature Mapper 및 Precursor Ions Quantifier 노드가 추가된 기본 합의 워크플로우를 수정하여 생성됩니다. 워크플로우의 모든 노드에는 제조업체에서 설정한 최적화된 매개변수가 이미 포함되어 있지만, 아래에 설명된 대로 적절한 선택을 다시 확인해야 하는 매우 중요한 항목이 포함된 노드도 있습니다.
  17. 워크플로우 트리 다이어그램에서 을 클릭하고 Precursor Ions Quantifier 노드를 엽니다. 이것은 식별된 각 단백질의 상대적 풍부도를 정량화하는 데 필수적인 노드입니다.
    1. 일반 정량화 설정(General Quantification Settings) 범주에서 사용할 펩타이드(Peptides to Use) 파라미터에서 고유 + 면도기(Unique + Razor) 옵션을 찾아 선택합니다.
      참고: 고유한 펩타이드는 단일 단백질에만 고유한 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드입니다. 따라서 MS 신호 강도에 따라 그 양을 구체적으로 결정하는 데 사용됩니다. 면도기 펩타이드는 단백질 그룹 간에 공유되는 펩타이드입니다. 따라서 계산된 상대적 풍부도를 일치시키는 데 사용됩니다.
    2. 정 규화 및 스케일링 카테고리에서 정규화 모드 및 스케일링 모드 파라미터를 모두 없음 옵션으로 변경하는데, 이 유형의 조정은 전체 프로테옴에서 신뢰할 수 있는 적용을 하기에는 너무 제한적이기 때문입니다.
      참고: 이러한 설정은 세포에 안정적으로 내재된 단백질(예: 하우스키핑 유전자)에 대해 관심 있는 선택된 단백질의 계산된 상대적 풍부도를 정규화한 다음 결과 값을 스케일링된 비율로 표현하려는 경우에만 활성화됩니다.
    3. 그런 다음 Peptide and Protein Filter 노드를 클릭하고 열고 Peptide Filters 범주에서 Peptide Confidence At Least 및 Keep Lower Confident PSM 매개변수를 각각 High 및 False 옵션으로 변경합니다. 이것은 단백질 식별을 만드는 데 사용되는 펩타이드 일치를 최대 수준의 적합 유의성(즉, ≥ 95%)으로 설정합니다.
      참고: 또는 첫 번째 매개변수를 Medium 으로 설정하여 펩타이드 일치의 엄격성을 완화하여 단백질 히트의 출력을 크게 증가시킬 수 있습니다. 그러나 이것은 반대로 많은 잘못된 식별을 생성할 위험이 매우 높습니다. 마찬가지로 "낮음" 값이 두 매개 변수에 대해 허용되는 옵션으로 사용되어서는 안 됩니다.
    4. 이들은 매개변수를 조정해야 하는 합의 단계의 유일한 노드이며, 나머지는 기본 설정을 사용하는 상태로 둡니다.
      참고: 전반적으로 합의 단계 워크플로우는 모든 사후 분석, 즉 단백질 상대적 풍부도, 식별 신뢰도(즉, 잘못된 발견률 및 펩타이드 스펙트럼 일치 점수) 및 매핑된 펩타이드 커버리지의 결정을 처리합니다. 결과 통계 및 데이터 분포도 엔드 테이블로 제공됩니다.
  18. 위의 처리 및 합의 단계 워크플로우가 준비되면 전체 연구를 저장한 다음 분석 상자 상단에 있는 실행 아이콘(톱니바퀴)을 클릭합니다. 여러 원시 MS 데이터 파일을 한 번에 처리하는 경우 처리 실행을 시작하기 전에 근처의 파일별 아이콘(사각형)을 클릭하고 선택합니다.
    참고: 하나의 MS 원시 데이터 파일을 전체 프로테옴 결과 파일로 처리하는 데는 일반적으로 20-40분이 걸리지만, 각 엔티티 내에 존재하는 인산염 변형과 함께 낮음, 중간 및 높은 신뢰도 일치(즉, 높은 적중에 대한 가중치)에 이르는 수천 개의 단백질 식별 실행 목록을 생성할 수 있습니다(그림 4C). 확인된 단백질에 대한 주요 결과 출력 파라미터는 FDR(신뢰도), 마스터(FASTA 파일/라이브러리 항목을 검토한 경우), 수탁 #, 설명, 커버리지%, 서열 커버리지, 펩타이드 스펙트럼 일치(예를 들어, 고유한 펩타이드의 수), 물리적 특성(예를 들어, kDa 단위의 MW), 상대적 풍부도 및 변형(즉, 인산화기)이다.
    1. 열은 연구 관심 사항에 따라 도구 모음의 깔때기 아이콘(그림 4C)을 사용하여 총 프로테옴 결과를 오름차순 또는 내림차순으로 배열하거나 완전히 필터링합니다(예: 높은 신뢰도 식별(단백질 FDR) 또는 높은 수준의 펩타이드 일치(예: 커버리지 % 및/또는 발견된 고유 수)를 보여줍니다.
    2. 번역 후 변형 정보가 특별히 필요한 경우, 추가 분석을 위해 인산화가 있는 식별된 단백질을 필터링합니다.
    3. 적용된 필터를 제거하고 창을 새로 고치기만 하면 원래 출력으로 복원할 수 있으므로 파일 이름을 변경하지 않고 필터링된 결과를 저장합니다.

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결과

화산 플롯으로의 선택적 처리를 통한 총 프로테옴 결과의 시각화
각 샘플에 대한 총 프로테옴 결과는 연구 관심 있는 특정 단백질에 대한 수탁 # 또는 설명에 의해 쉽게 검색될 수 있으며, 연관된 상대적 풍부도는 평균화된 후 유의미한 차이에 대해 치료군 간에 비교된다(예를 들어, t-검정 유도 p-값에 의해). 또는 실험의 처리 그룹을 구성하는 개별 샘플 간에 완전히 공유되는 인단백질을 포함한 전체 프로테옴에 걸친 전반적인 변화를 찾는 것은 큰 탐색적 가치가 있을 수 있습니다. 이는 데이터를 본질적으로 단백질 변화 분포 지도인 선택적 화산 플롯으로 변환하여 수행됩니다. 개별 샘플에 대한 프로테옴 결과를 생성하는 데 사용되는 생물정보학 소프트웨어는 원시 MS 데이터 파일을 처리하는 동안 자동으로 치료 그룹 비교를 수행한 다음 해당 화산 플롯을 생성하도록 설정할 수 있습니다. 그러나 프로그램이 그룹 평균을 결정하는 데 들어간 개별 상대적 풍부도를 공개적으로 보여주지 않기 때문에 출력을 해석하기 어려운...

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토론

위의 방법은 장기 보관을 위해 -80°C로 옮기기 전에 액체 질소에서 급속 냉동된 조직을 사용하여 모든 생물학적 활동을 즉시 중단했습니다. 모든 샘플이 수집되면 조직 균질화가 발생했습니다. 균질화 중에는 단백질의 재활성화 또는 분해를 방지하기 위해 모든 조직과 도구를 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 또한 균질화된 조직에서 단백질을 처음 추출하는 동안 단백질 활성 손실이나 단백질 분해를 방지하기 위해 샘플을 차갑게 유지합니다. 우리는 TBI의 전임상 동물 모델(즉, 모의 폭발 과압파 노출 마우스 및 흰족제비)에서 분리된 뇌, 폐, 비장, 간 및 혈장을 포함한 조직의 단백질 프로필의 변화를 밝히기 위해 이 방법론을 활용했습니다. 이 방법은 전체 프로테옴에서 조직 전체의 변화를 관찰하는 데 이상적입니다. 그러나 추가 실험은 조직의 특정 영역에 초점을 맞추기 위해 이 프로토콜을 확장할 수 있습니다. 예를 들어, 향후 실험은 급속 동결 전에 분리된 뇌의 해부학적으로 다른 영역...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 프로젝트는 국립 과학, 공학 및 의학 아카데미의 펠로우십 사무실과 월터 리드 육군 연구소의 오크리지 과학 및 교육 프로그램 연구소에서 관리하는 국립 연구 위원회 준회원 프로그램에 임명되어 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
660 nm 단백질 분석 키트피어스 / Thermo Scientific22662BCA가 시료의 단백질 농도를 측정하기 위해 Pierce 660nm 단백질 분석 시약과 사전 희석된 단백질 분석 표준물질을 포함합니다.
아세토니트릴, Optima LC/MS 등급써모 피셔 사이언티픽047138.K2액체 크로마토그래피/질량 분석법에 사용되는 초순수 아세토니트릴
알루미늄 호일 플레이트 씰베크만 쿨터538619단백질 분석 플레이트 개발 중에 사용되는 씰
BioTek Synergy Neo2 다중 모드 리더 / UV-Vis 분광계애질런트https://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195단백질 농도를 결정하기 위해 660nm 흡광도 판독값을 완료하는 데 사용되는 분광 광도계/분석 플레이트 판독기 기기 
ChromaCare LC-MS 기기 플러시 솔루션써모 피셔 사이언티픽T111101000아세토니트릴, 이소프로프라놀, 메탄올 및 물을 각각 25% 함유한 용액은 시료 실행 후 LC 시스템을 청소하는 데 도움이 됩니다.
CK28 Precellys 튜브Bertin Corp / 기술P000911LYSK0A.0균질화된 조직은 Precellyis 기기를 사용하여 조직 용해 및 단백질 분리를 위해 이 튜브에 배치됩니다. 이들은 프로토콜에서 "균질화 튜브"라고 하는 우리 실험실에서 사용하는 튜브입니다.
냉동 포드브룩스 / 아젠타 생명과학https://www.azenta.com/products/cryopod-carriertisuse 균질화 중 모르타르를 냉각하기 위해 액체 질소를 보관하는 데 사용되는 용기
EasyPep Mini MS 시료 전처리 키트써모 피셔 사이언티픽A40006하나의 키트로 20개의 샘플을 처리할 수 있으며, 내용물에는 단백질 추출을 위한 용해 용액, 추출 용액에 보충된 범용 뉴클레아제, 1.4단계 및 1.5단계에 필요한 레지안트가 포함됩니다.
EASY-Spray C18 LC 컬럼(15 cm L, 50 & micro; m 직경 및 2 & 마이크로; m 입자 크기)써모 피셔 사이언티픽ES901MS 검출 전 펩타이드 분리에 사용되는 Electrospray LC 컬럼
FlexMix 교정 솔루션피어스 / Thermo ScientificA39239시료 실행 전에 MS 기기의 검출기 정확도 및 감도를 교정하는 데 사용되는 16가지 표준 분자의 혼합물
포름산, LC/MS 등급써모 피셔 사이언티픽851780.1%(v/v)의 최종 농도에서 모든 LC 용액 및 시료를 자극하는 데 사용되는 초순수 포름산(Ultra-pure Formic Acid)
프로테아제 중단 & 포스포타제 일회용 억제제 칵테일 (100x)써모 피셔 사이언티픽78442샘플에서 단백질 및 인단백질의 분해를 방지하기 위해 추출 완충액에 보충
메탄올, Optima LC/MS 등급써모 피셔 사이언티픽047192.K2액체 크로마토그래피/질량 분석법에 사용되는 초순수 메탄올
도자기 모르타르, 150mL써모 피셔 사이언티픽FB961C150mL 용량, 더 작은 흰족제비 조직(즉, 뇌)을 균질화하는 데 사용됨
도자기 모르타르, 275mL써모 피셔 사이언티픽FB961D275mL 용량, 큰 흰족제비 조직(즉, 간)을 균질화하는 데 사용됨
도자기 모르타르, 50mL써모 피셔 사이언티픽FB961A50mL 용량, 마우스 조직 균질화에 사용
도자기 페슬, 50 mL써모 피셔 사이언티픽FB961K50mL 모르타르와 함께 사용
도자기 유봉, 150mL써모 피셔 사이언티픽FB961엠150mL 절격포와 함께 사용
도자기 유봉, 275mL써모 피셔 사이언티픽FB961N275mL 절격포와 함께 사용
프레셀리스Bertin Corp / 기술https://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/조직 샘플을 균질화하는 데 사용되는 기기입니다. 다음 설정이 사용되었습니다: 4500RPM, 사이클당 2 x 30초, 30초 일시 중지. 
단백질 분석 시약피어스 / Thermo Scientific226623.4단계에 사용된 단백질 분석 시약– 3.8
프로테옴 발견자써모 피셔 사이언티픽CSW0064764단백질체학/인산단백질체학 데이터 분석을 위한 생물정보학 소프트웨어
SureSTART MSCERT 스크류 캡 LC 주입 바이알(0.02– 1.5mL 용량)써모 피셔 사이언티픽6PMCK39TRLC/MS 기기에 주입할 샘플을 담는 데 사용되는 높은 성능 응용 프로그램 인증, 스크류 캡(PTFE, 사전 슬릿 격막) 유리 바이알     
Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC/MS) 시스템써모 피셔 사이언티픽LC: 할인 / MS: FETD2-10002, 특별 요청에 따라초고성능의 액체 크로마토그래피/질량 분석기(LC/MS) 기기는 시료에서 펩타이드를 분리한 후 분자량으로 검출하는 데 사용됩니다.
세포 용해를 위한 범용 뉴클레아제, 100kU, 400 및 마이크로; L피어스 / Thermo Scientific88702추가 범용 뉴클레아제를 구입했습니다 
진공분리기 플러스에펜도르프https://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748재구성 전에 펩타이드 샘플을 건조하는 데 사용되는 진공 분리기. 
물, Optima LC/MS 등급써모 피셔 사이언티픽047146.K2액체 크로마토그래피/질량 분석에 사용되는 초순수

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