방법 논문

3D 유체 칩에서 폐절제술 후 내피 글리코칼릭스 모델링 - 혈관 기반 장기 온 칩 시스템 제작에 대한 접근 방식

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DOI:

10.3791/67246

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2025년 9월 16일

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1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

이 논문에서

요약

여기에서는 전폐절제술을 모방하도록 설계된 OOC(Organ-on-Chip) 시스템을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 글리코칼릭스 손상과 전폐절제술 후 합병증 사이의 잠재적 상관관계를 조사합니다.

초록

내피 세포의 내강 표면을 코팅하는 탄수화물이 풍부한 층인 내피 글리코칼릭스(GCX)는 자극에 대한 세포 반응을 조절하는 데 중추적인 역할을 합니다. 이는 세포 반응을 위한 기계적 변환기 역할을 하는 막관통 단백질로 구성됩니다. 항상성 조건에서는 자연적으로 구조와 안정성을 유지하지만 높은 전단 응력에 노출되면 손상이 발생하여 수많은 결과가 발생할 수 있습니다. 내피 세포에 대한 일반적인 전단 응력 효과가 조사되었지만 혈관계, 특히 전폐 절제술 후에 대한 전단 응력의 정도와 영향은 잘 연구되지 않았습니다. 이를 조사하기 위해 전폐절제술 전후 폐혈관 구조의 CAD 모델 생성을 포함하는 포괄적인 접근 방식이 수행되었습니다. 전산 유체 시뮬레이션을 활용하여 상승된 전단 응력과 압력의 주요 영역을 식별하고 OOC(Organ-on-Chip) 시스템에서 복제했습니다. 인간 폐 미세혈관 내피 세포(HLMVEC)를 시험관 내에서 상승된 전단 응력의 영향을 특성화하기 위해 선택된 절편 모양의 금형에 파종되었습니다. 실험 후, HLMVEC를 면역염색하여 전폐절제술에 의해 유도된 정상 및 증가된 스트레스 하에서 GCX 건강을 정성적으로 평가했습니다. 전산 모델링과 실험 분석의 통합은 전단 응력의 변화가 GCX에 어떤 영향을 미치는지에 대한 이해를 높이고 혈관 기능과 수술 후 합병증에 미치는 영향을 명확히 합니다.

서론

전폐절제술은 오른쪽 또는 왼쪽 폐를 적출하기 위해 수행되는 침습적이고 고위험한 외과적 개입입니다1. 이 절차는 일반적으로 폐암, 폐결핵 및 외상성 폐 손상과 같은 다양한 중증 질환에 대한 치료 옵션으로 활용됩니다2. 이 절차는 유망하지만 부정맥에서 폐부종에 이르는 수술 후 합병증의 비율 증가로 강조되는 심각한 위험을 초래합니다1.

폐절제술은 심장의 전체 심박출량을 나머지 폐로 유도함으로써 심혈관 역학에 지대한 영향을 미칩니다3. 이러한 혈류의 방향 전환은 나머지 폐 맥관 구조 내에서 압력과 전단 응력을 증가시키는 것으로 알려져 있습니다4. 혈류 패턴의 이러한 광범위한 변화로 인해 내피 글리코칼릭스(GCX)는 혈류 패턴의 이러한 변화를 감지하는 데 중추적인 역할을 합니다5.

GCX는 환경 변화에 반응하여 생화학적 활동을 조절하는 젤 같은 층입니다 6,7. 이의 발현은 정적 배양에 비해 균일한 흐름에 장기간 노출되면 증가하고 교란된 흐름에 노출되면 감소하는 것으로 나타났습니다 8,9. GCX는 전체 맥관 구조에 걸쳐 0.1-1μm 범위의 다양한 두께를 나타내며 혈관의 내피 세포를 코팅하는 필수 기계 형질도입층 역할을 합니다10. 네트워크는 그림 1과 같이 당, 지질 및 단백질의 조밀한 층으로 구성됩니다. 이 당은 결합하여 혈류에 자유롭게 존재하거나 단백질이나 지질에 부착될 수 있는 글리칸을 형성하여 프로테오글리칸, 당단백질 또는 당지질을 형성합니다 7,11. 프로테오글리칸은 혈장 단백질이나 수용체를 통해 세포막에 결합하는 글리코사미노글리칸(GAG) 사슬로 구성됩니다. 이러한 GAG에는 헤파란 설페이트(HS), 히알루론산(HA), 콘드로이틴 설페이트(CS), 더마탄 설페이트 및 케라탄 설페이트가 포함됩니다 12. 헤파란 황산염은 GCX에서 발견되는 전체 GAG의 50% 이상을 차지하는 우세한 GAG입니다. 이러한 측쇄는 CD44(표면 접착 수용체)와 함께 글리피칸(글리코실포스파티딜이노시톨에 의해 고정됨) 및 신데칸(막 스패닝 도메인 포함)을 포함하는 내장된 코어 단백질에 부착될 수 있습니다. 위에서 설명한 복합체는 성장 인자 조절, 항염증 반응, 혈관 확장 촉진 및 혈관 투과성 조절에 중요한 역할을 합니다13.

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그림 1: GCX 구성 요소 다이어그램. 내피 글리코칼릭스의 구성 요소를 나타내는 개략도. 이 개략도는 혈관의 내강에서 발견되는 정점 글리코칼릭스를 표시하여 막 결합 프로테오글리칸과 당단백질을 보여줍니다. BioRender.com 으로 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

폐절제술과 GCX 손상 사이의 정확한 연관성은 잘 연구되지 않았지만 폐절제술에 의해 유도된 변경된 혈류 패턴과 GCX의 무결성 사이에는 그럴듯한 상관관계가 존재합니다. 맥관 구조의 혈류 장애는 GCX6에 손상을 입히는 것으로 알려져 있습니다. 우리는 전폐절제술 후 남은 맥관 구조의 증가된 교란된 흐름과 전단 응력의 변화가 시간이 지남에 따라 GCX에 손상을 줄 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이러한 가속화된 악화는 수술 후 합병증 및 이환율을 촉진하여 환자의 전반적인 건강에 내재된 위험을 증가시킬 수 있습니다13.

이 프로토콜은 그림 2에 설명된 일반적인 절차에 따라 폐절제술 후 폐 맥관 구조를 모델링하는 것을 목표로 했습니다. 유체 시뮬레이션은 전폐절제술 유무에 관계없이 인간 폐 맥관 구조를 복제하는 컴퓨터 지원 설계 모델에서 수행되었습니다. 전폐절제술 모델은 CT 스캔 및 문헌 데이터에서 파생된 치수를 기반으로 3D 모델링 소프트웨어에서 3D 폐 맥관 구조를 설계한 다음 전산 유체 역학(CFD) 소프트웨어의 흐름 시뮬레이션을 위해 더욱 단순화하여 생성되었습니다. 시뮬레이션은 대조군과 비교할 때 전절제술 모델에서 전단 응력이 증가한 영역에 의해 선택된 특정 관심 영역을 식별했습니다. 이러한 관심 영역은 시험관 내 모델을 구축하기 위해 복제하기 위해 선택되었습니다. 시험관 내 모델은 유체 챔버 설계를 활용하여 흐름 조건의 차이를 시뮬레이션하기 위해 정상적인 형상과 전폐 절제술 형상으로 맥관 구조의 여러 섹션을 시뮬레이션했습니다.

인간 폐 미세혈관 내피 세포(HLMVEC)를 피브로넥틴 코팅된 폴리디메틸실록산(PDMS) 기질에서 배양했으며, 선택된 분기 영역을 모방하도록 형성되었습니다. 미세혈관 내피 세포 배양 배지는 연동 펌프를 사용하여 시스템을 통해 관류되었습니다. 마지막으로, 세포와 GCX를 고정하고 GCX 염색 항체로 면역염색한 후 형광 현미경을 사용하여 시각화하여 유체 흐름에 노출된 후 상태를 평가했습니다. 프로토콜의 일반적인 타임라인은 표 1에서 찾을 수 있습니다.

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그림 2: OOC 개발 순서. 폐 전폐절제술의 효과를 연구하기 위한 새로운 OOC 시스템 개발 순서 (1) 인간 폐 맥관 구조에서 생성된 CT 스캔. (2) 3D CAD 모델의 관심 영역을 식별하는 데 사용되는 CT 스캔 형상. (3) 시험관 내 모델에 대한 관심 형상을 결정하기 위한 유체 흐름 시뮬레이션. (4) 시뮬레이션 결과에서 관심 영역을 포함하는 PDMS 금형 모델링 (5) 관류를 위해 금형을 고정하기 위해 아크릴 케이스에 삽입된 금형 (6) 플로우 챔버 설정 완료 (7) 인큐베이터로 전송된 전체 플로우 챔버 설정 (8) 전단 응력에 노출된 후 촬영한 명시야 및 형광 이미지. BioRender.com 으로 생성 이 그림의 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 일반 프로토콜 타임라인. 각 단계의 평균 지속 시간(h)이 있는 프로토콜 내에서 단계를 수행하는 일반 순서입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

이 연구는 기관 및 연방 윤리 기준에 따라 수집된 이전 문헌14 의 컴퓨터 단층촬영(CT) 영상 데이터를 활용했습니다. 참조된 모든 이미징 데이터는 참가자의 권리와 개인 정보 보호를 보장하기 위해 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받은 후 참가자의 정보에 입각한 동의를 받았습니다.

1. CAD 소프트웨어에서 폐 맥관 구조 모델링

  1. 모델링할 1차 혈관의 생리학적 기하학을 연구합니다.
  2. 모델링할 혈관의 환자 CT 이미지를 사용하여 그림 2와 같이 복제할 특정 형상을 선택합니다.
    참고: 이 프로토콜의 경우 이전 문헌의 임상 상태 폐 CT 스캔이 활용되었습니다14. 이 프로토콜은 또한 모든 CT 스캔 데이터를 사용하여 시험관 내 모델을 생성할 수 있습니다.
    1. DICOM 뷰어를 열고 CT 이미지를 가져옵니다 . 슬라이스를 탐색하여 관심 있는 선박을 식별합니다. 추가 분석을 위해 관련 이미지를 저장 합니다.
      참고: 이 프로토콜을 위해 복제된 혈관은 폐 맥관 구조였는데, 이 프로토콜의 적용은 건강한 전폐 절제술 후 조건에서 내피 글리코칼릭스를 모델링하는 것이기 때문입니다. 다른 위치는 다른 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.
  3. ImageJ FIJI v1.54f15를 사용하여 CT 이미지 또는 문헌 값에서 혈관 직경을 측정합니다.
    1. 열다 ImageJ FIJI 및 저장된 CT 이미지 가져오기: 파일 > 열기를 선택합니다.
    2. 도구 모음에서 선 도구를 선택하여 CT 이미지의 축척 막대 길이에 걸쳐 선을 그립니다.
    3. 그런 다음 분석 > 배율 설정을 선택합니다. 알려진 거리를 입력합니다(예: 이미지의 축척 막대가 10mm인 경우 알려진 거리로 10을 입력합니다). 길이 단위(예: mm)를 입력합니다. 확인을 클릭합니다.
  4. 선 도구를 사용하여 지름을 측정합니다. 이렇게 하려면 도구 모음에서 선 도구를 선택하고 선박 지름에 걸쳐 선을 그립니다. 그런 다음 분석 > 측정 을 선택하여 지름 값을 가져옵니다.
  5. 관심 있는 모든 용기에 대해 1.3단계와 1.4단계를 반복하고 측정값을 기록합니다.
  6. 모델링의 용이성을 위해 선박 측정값을 세그먼트 유형으로 컴파일합니다.
    1. 스프레드시트를 만들어 혈관 측정값을 분류하고 각 행에 혈관 이름, 측정 및 세그먼트 유형(예: 동맥, 정맥)으로 레이블을 지정합니다.
  7. 문헌 및 방사선 촬영 측정을 기반으로 혈관 분절 길이 및 직경에 대한 참조 테이블을 만듭니다.
  8. 3D 모델링 소프트웨어를 사용하여 3D 모델을 생성하여 CT 이미지의 형상과 치수를 복제합니다.
    1. 소프트웨어를 열고 새 부품 파일을 만듭니다: 파일 > 새 > 부품을 선택하고 스케치 > 스케치 생성 을 선택하고 ImageJ의 치수를 사용하여 프로파일을 그립니다.
    2. 3D 형상에 서피스 스윕 및 로프팅 활용: 스윕의 경우 스윕 보스/베이스 > 피쳐를 선택합니다. 로프트의 경우 피쳐 > 로프트 보스/베이스를 선택합니다.
    3. 정확한 측정값과 일치하도록 모델을 구체화합니다.
  9. 대조군 모델 및 전폐 절제술 모델과 같이 개발할 모델 변형을 식별합니다.
    1. 다양한 조건(예: 정상 대 전폐 절제술)을 간략하게 설명하고 각 변형에 필요한 구조적 변화를 나열합니다.
  10. 수정을 위해 원래 모델을 복제하여 매개변수(즉, 오른쪽 및 왼쪽 전폐 절제술)에 따라 실험 모델을 만듭니다.
    1. 원본 모델을 저장한 다음 파일 > 복사본으로 저장 을 선택하여 각 실험 조건에 대한 복사본을 만듭니다.
    2. 정의된 매개변수(예: 오른쪽 및 왼쪽 전폐절제술)에 따라 각 사본을 수정합니다.
  11. 전산 유체 역학(CFD) 시뮬레이션을 위해 부품을 파일에서 Parasolid 파일로 모델을 변환합니다.
    1. 파일 > 다른 이름으로 저장을 선택합니다. 파일 형식 드롭다운에서 Parasolid(*.x_t)를 선택한 다음 원하는 디렉터리에 파일을 저장합니다.

2. 유체 흐름 시뮬레이션

참고: 이 단계는 전폐절제술 후 수정된 전단 응력 영역을 찾아 시험관 내 시스템을 위해 복제할 혈관 형상을 선택하는 데 도움이 됩니다. 또한 소프트웨어 라이센스는 가져오기 모듈을 지원해야 합니다.

  1. 새로운 정상 상태 층류 연구를 설정합니다.
    1. 3D(공간 차원)>> 단상 흐름 > 층류(spf)> 유체 흐름 모델 마법사를 선택> 추가를 선택하여 층류 물리 인터페이스를 추가> 연구를 선택> 일반 연구에서 고정을 선택> 완료를 선택합니다.
  2. CAD 모델에서 형상을 추가합니다.
    1. Parasolid 파일을 가져옵니다. 캡 면(Cap Faces)을 선택하고 그래픽(Graphics) 창에서 열린 각 입구와 출구에서 용기 내벽의 둘레를 선택합니다. 이는 캡 면의 경계 가장자리가 됩니다. 폼 유니온 및 모두 빌드를 선택합니다.
    2. 세부 정보 제거를 선택하고 제거할 세부 정보에서 모든 옵션이 선택되어 있는지 확인한 다음 모두 빌드를 선택하여 불필요한 형상을 제거합니다.
  3. 메쉬 1 생성(메쉬된 혈관 벽 + 메쉬된 유체 도메인).
    1. 크기를 predefined: extra fine, calibration for fluid dynamics로 설정합니다.
    2. 크기 1을 predefined: extra fine, calibrate for fluid dynamics로 설정하고, Geometric Entity Selection의 경우 Boundary와 Manual을 지정합니다. 그래픽 창에서 캡 면 주위의 링 모양의 면을 포함하여 선박 벽 도메인의 모든 보이는 외부 면을 선택합니다. 입구와 출구에서 캡면을 선택하지 마십시오.
      참고: 전폐절제술 모델의 오른쪽과 왼쪽에 있는 제거된 섹션의 끝에 있는 캡면을 선택하는데, 이는 전폐절제술 후 기하학적 경계로 간주되기 때문입니다.
    3. 코너 세분화(Corner Refinement)에서 도메인(Domain) 및 수동(Manual)을 선택합니다. 그래픽 창에서 [도메인] 1(용기 벽) 및 [도메인] 2(유체)를 선택합니다.
    4. 경계 선택에서 경계가 "크기 1"의 "기하학적 도면요소 선택"에 지정된 것과 동일한지 확인합니다.
    5. 자유 사면체 1(Free Tetrahedral 1)에서 도메인 선택(Domain Selection) 아래의 기하학적 엔티티 레벨(Geometric entity level)에 대해 남은 (Remain)을 선택합니다.
    6. 경계 레이어 1 및 형상 엔티티 선택에서 도메인을 지정하고 그래픽 창 [도메인] 1 및 [도메인] 2에서 수동을 선택합니다. 경계 레이어 특성은 크기 1에 지정된 것과 동일한 선택이 됩니다.
    7. 메시 1 아래에서 모두 빌드 (Build All ) 를 선택하여 메시를 빌드합니다.
  4. 메쉬 2 생성(메쉬된 유체 도메인만 해당).
    1. 메시 1을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 가져오기를 선택하여 "메시 2"를 만들고 가져오기 2를 삭제합니다.
    2. 가져오기 1에서 메쉬 시퀀스 를 선택하여 메쉬 1을 자동으로 선택합니다. 소스 메시 자동 빌드(Build source mesh automatically), 도메인 요소 가져오기(Import domain elements) 및 메 시되지 않은 도메인 가져오기(Import unmeshed domains )가 선택되어 있는지 확인한 다음 가져오기(Import) 를 선택합니다. 메시 1에 정의된 모든 세팅은 메시 2로 이월됩니다.
    3. 메시 2 를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 엔티티 삭제(Delete Entities) 를 선택합니다. 엔티티 1 삭제의 경우 형상 엔티티 선택에서 도메인을 선택하고 수동을 선택한 다음 그래픽 창에서 [도메인] 1(용기 벽)을 선택한 다음 모두 빌드를 선택하여 유체 도메인 메쉬의 표면이 유체 흐름과 용기의 내부 벽 사이의 인터페이스에 있으므로 유체 형상만 남깁니다.
  5. 흐름 재료 추가: 문헌에서 혈액의 특성을 사용하여 새로운 재료를 만듭니다. 재질을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 빈 재질을 선택합니다. 지오메트리 엔티티 수준 선택에서 도메인을 선택하고 모든 도메인을 선택합니다. 재료 유형에서 비고체 를 선택하고 점도 및 밀도를 포함한 혈액의 재료 특성을 추가합니다.
  6. 층류 연구 경계 조건 및 매개변수를 설정합니다.
    1. 층류(spf)를 선택하고 도메인 선택에서 모든 도메인을 선택합니다. [도메인] 1만 나열됩니다. 이 경우 도메인 1은 혈관 벽이 아닌 유체 형상입니다. 유체 특성 1은 5단계에서 정의한 재질에서 자동으로 채워집니다.
    2. 초기 값 1 압력을 생리적 혈압으로 설정합니다. 벽 1의 경계 조건을 미끄럼 방지로 설정합니다.
    3. 그래픽 창에서 입구 1 을 선택하고 경계 조건을 완전히 전개된 흐름으로 설정합니다. 각 분리된 선택에 개별적으로 조건 적용이 선택되어 있는지 확인합니다.
    4. 완전히 개발된 흐름에서 유속을 선택하고 속도를 입력합니다.
    5. 출구 1의 경우 그래픽 창에서 모든 출구를 선택하고 경계 조건이 압력으로 설정되어 있는지 확인합니다.
    6. 압력 조건에서 합계를 선택하고 압력을 입력합니다. 평균(Average) 및 역류 억제(Suppress backflow)를 선택합니다.
  7. 연구를 설정하고 실행합니다.
    1. 연구 아래의 1단계: 고정의 경우 물리 및 변수 섹션이 의도한 연구와 일치하고 메쉬 선택 구성 요소 1이 메시 2로 설정되어 있는지 확인합니다. 컴퓨팅을 선택합니다.
  8. 전단 응력 결과를 분석합니다.
    1. 압력(spf)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 복제를 선택합니다. 이름을 전단 응력으로 바꿉니다.
    2. 전단 응력에서 표면을 선택하고 데이터 세트를 스터디 1/솔루션 1(sol1)으로 변경합니다.
    3. 표현식에서 spf.sr*spf.mu를 입력하고 단위를 Pa로 설정합니다.
      알림: 이것은 "단상 유동 전단 속도 * 단상 유동 점도"를 나타냅니다.
    4. 그런 다음 플롯 을 선택하고 투명도 1 을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 비활성화를 선택합니다.
    5. 전단 응력을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 볼륨을 선택하여 데이터 세트를 연구 1/솔루션 1(sol1)으로 변경합니다.
    6. 표현식에서 spf.sr*spf.mu를 입력하고 단위를 Pa로 설정합니다.
    7. 플롯을 선택하고 표면을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 비활성화를 선택하여 "볼륨 1"을 시각적으로 분석하여 OOC 모델에서 연구할 관심 있는 선박 영역을 결정합니다

3. PDMS 금형 준비

  1. 유체 시뮬레이션 결과를 사용하여 대조군과 전폐 절제술 모델 간의 전단 응력에 상당한 차이를 보이는 영역을 선택하여 대조군 및 전폐 절제술을 위한 형상을 선택하고 이를 CAD에서 네거티브 몰드로 복제합니다. 대조군 및 전폐 절제술 맥관 구조의 CAD 모델 치수는 그림 3과 그림 4에 나와 있습니다.
  2. 또한 셀 파종 중 누출을 방지하기 위해 금형의 입구와 출구에 플러그를 설계하십시오.
  3. 3D 프린터를 사용하여 PLA 필라멘트를 사용하여 금형과 플러그를 인쇄합니다.
  4. 3D 프린팅된 폴리락트산(PLA) 금형(대조군 + 전폐절제술)을 얻습니다(그림 5A).
  5. 실리콘 엘라스토머 베이스 10부와 실리콘 엘라스토머 경화제 1부의 무게를 달아 총 30mL의 혼합물(10:1 질량/질량 비율)을 만들어 금형을 3mm 두께로 채웁니다(그림 5B).
    알림: 계량 과정에서 원액을 혼합하지 마십시오. 각 시약에 대해 별도의 계량 재료를 사용하십시오.
  6. 엘라스토머 베이스와 경화제를 함께 붓고 잘 섞는다
    알림: 이것은 계량 보트에서 수행할 수 있습니다.
  7. 잘 혼합된 용액을 금형에 붓습니다(금형 절반의 경우 약 15mL)(그림 5C).
  8. PDMS를 진공 챔버에 30 - 60분 동안 또는 기포가 남지 않을 때까지 PDMS를 탈기시킵니다(그림 5D).
  9. 진공 챔버에서 PDMS를 제거하고 실온에서 48시간 동안 경화시킵니다.
    참고: PLA 금형의 열용량으로 인해 경화에 오븐을 사용하지 않았습니다.
  10. PLA 금형에서 PDMS를 추출합니다.
  11. PLA 몰드를 DI-물로 충분히 헹구어 표면에 불순물이 남아 있지 않도록 하여 다시 사용할 수 있도록 합니다.

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그림 3: 제어 맥관 구조의 3D CAD 도면. 평면도 및 측면도에서 제어 맥관 구조 모델의 치수(mm)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 전폐절제술 맥관 구조의 3D CAD 도면. 평면도 및 측면도에서 전폐 절제술 맥관 구조 모델의 치수(mm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: PDMS 금형 생성. PDMS 금형 생성. (A) 대조군(주황색) 및 전폐절제술(녹색) 실험을 위한 3D 프린팅 PLA 금형. (B) PDMS 제조 재료가 있는 저울. (C) PDMS 혼합물(10:1 베이스 + 경화제)을 3D 프린팅 금형에 붓습니다. (D) 진공 챔버에서 PDMS를 탈기합니다. BioRender.com 으로 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 세포 배양 및 파종

  1. 현지 실험실 프로토콜에 따라 적절한 무균 기술을 사용하십시오.
  2. 70% 에탄올을 뿌리고 PDMS 조각과 양면 테이프 4개를 포함하여 필요한 모든 재료와 구성 요소를 생물안전 캐비닛(BSC)(그림 6A)으로 가져옵니다.
  3. 각 세포 배양 플레이트에 양면 테이프 두 장을 놓습니다(그림 6B).
  4. 각 PDMS 맥관 구조의 절반을 양면 테이프 위에 있는 자체 세포 배양 접시에 놓습니다(그림 6C).
  5. BSC에서 20분 동안 UV 광선에 노출되어 모든 구성 요소를 추가로 멸균합니다.
  6. 필요한 경우 트립신, HLMVEC 배양 배지 및 20μg/mL 피브로넥틴을 37°C에서 해동합니다.
  7. 마이크로피펫을 사용하여 PDMS 맥관 구조를 따라 20μg/mL 피브로넥틴의 30μL 방울을 여러 방울로 놓습니다. PDMS 기울이기 필요한 경우 피펫 팁을 사용하여 PDMS를 고르게 코팅합니다(그림 7A).
  8. BSC에 있는 동안 PDMS 조각을 30분 동안 배양합니다.
  9. 배양 후, 피브로넥틴 용액을 흡인하고 PDMS 조각을 BSC에서 건조시킵니다(그림 7B).
  10. 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 HLMVEC 세포의 합류 플라스크를 BSC로 가져옵니다.
  11. 배양 플라스크에서 HLMVEC 배양 배지를 흡인합니다. 트립신 또는 멸균 PBS로 잠깐 헹굽니다.
  12. 세척액을 흡인하고 플라스크에 트립신 3mL를 첨가합니다. 37°C, 5% CO2 에서 5분 동안 배양합니다. 현미경으로 세포를 관찰하여 모든 세포가 플라스크에서 분리되었는지 확인합니다.
  13. HLMVEC 완전 배양 배지 9mL를 첨가하여 트립신 작용을 중단합니다.
  14. 세포 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브로 옮긴 다음 플라스크를 10mL의 HLMVEC 배양 배지로 헹구어 남은 세포를 수집합니다.
  15. 50mL 튜브로 옮깁니다. 세포를 220 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  16. 완료되면 튜브 바닥에 있는 세포 펠릿을 육안으로 확인합니다. 튜브에 70% 에탄올을 뿌리고 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 펠릿을 남기고 상청액을 흡인합니다.
  17. 신선한 HLMVEC 배양 배지 1mL에 세포를 부드럽게 재현탁하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 아래 방정식을 사용하여 총 세포 수를 계산합니다., 여기서 AH는 혈구계 제곱당 계산된 세포 수입니다. 세포를 얼음 위에 보관하십시오.
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  18. HLMVEC 배양 배지를 사용하여 세포 농도를 2 x 106 cells/mL로 가져옵니다.
  19. 그림 5(총 4개의 플러그, PDMS 조각당 2개)와 같이 PDMS 몰드에서 세포 현탁액 누출을 제거하기 위해 각 맥관 구조 절반의 끝에 3D 프린팅 플러그를 배치합니다(그림 7C).
  20. 마이크로피펫을 사용하여 300μL의 HLMVEC 세포 현탁액(600k 세포)을 각 PDMS 조각에 시드합니다(그림 7D).
  21. HLMVEC 세포를 포함하는 PDMS 조각을 인큐베이터(37°C, 5% CO2)로 1-2시간 동안 부드럽게 옮겨 부착합니다(그림 7E).
  22. 현미경으로 검사하여 PDMS 기판에 HLMVEC가 성공적으로 부착되었는지 육안으로 확인합니다.
  23. PDMS 맥관 구조 절반을 BSC로 되돌립니다.
  24. 4개의 플러그를 제거하고 PDMS 맥관 구조 절반을 잠글 만큼 충분한 HLMVEC 배양 배지를 추가한 다음 PDMS 맥관 구조가 포함된 배양 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다(그림 7F).
  25. 파종 후 6-10시간, PDMS를 둘러싼 HLMVEC 배양 배지를 맥관 구조에 수동으로 피펫팅하여 세포에 가장 가까운 배지를 새로 고칩니다.

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그림 6: PDMS 금형을 플레이트에 부착합니다. PDMS 맥관 구조를 세포 배양 플레이트에 부착하는 기본 단계. (A) PDMS 맥관 구조 반쪽을 배양 플레이트에 배치하는 데 필요한 재료. (B) 양면 접착 테이프 두 장을 각 멸균 배양판에 대각선으로 배치합니다. (C) 양면 접착제 위에 장착된 PDMS 맥관 구조 반쪽. BioRender.com 으로 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: PDMS 금형에 HLMVEC를 시딩합니다. PDMS 맥관 구조에 HLMVEC를 파종하는 단계. (A) 맥관 구조 150-300μL를 20μg/mL 피브로넥틴으로 채웁니다. (B) 틸트 탭 기술을 사용하여 과도한 피브로넥틴을 흡인합니다. (C) PDMS 맥관 구조의 절반 끝을 3D 프린팅 플러그로 막습니다. (D) 300μL 배지에 500-600K 세포를 각 맥관 구조 절반에 시드합니다. (E) 세포 부착을 용이하게 하기 위해 PDMS 반쪽을 인큐베이터에 1-2시간 동안 넣습니다. (F) PDMS 절반을 미디어로 덮고 플러그를 제거합니다. BioRender.com 으로 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 흐름 시스템 조립 및 실행

  1. 현미경으로 육안 검사로 결정된 바와 같이 PDMS 맥관 구조 반쪽의 세포가 완전히 합류하면 흐름 절차를 수행합니다.
  2. 실험을 수행하기 전에 제조업체의 프로토콜에 따라 연동 펌프를 보정하십시오.
  3. 유량 튜브, 튜브 커넥터, 주사기 저장소 및 고무 마개를 포함한 모든 오토클레이브 가능한 구성 요소를 오토클레이브합니다.
  4. 아크릴 블록, 나사, 플러그, 1인치 길이의 Masterflex L/S 16 튜브 조각 및 15mm 페트리 접시 접시 뚜껑을 BSC에서 70% 에탄올에 15분 동안 담그고 UV 처리를 20분 동안 담그고 중간에 뒤집습니다.
  5. 다른 모든 장비와 재료가 멸균되면 PDMS 맥관 구조 절반을 BSC로 가져옵니다.
  6. 맥관 구조 절반을 포함하는 페트리 접시에서 HLMVEC 배지를 흡인합니다(그림 8A,B).
  7. PDMS 반쪽을 두 개의 폴리카보네이트 블록에 놓고 정렬되었는지 확인합니다(그림 8C).
  8. 튜브가 PDMS 반쪽에 부착될 맥관 구조의 끝에 실리콘 실란트를 바르고 하단 맥관 구조의 두 끝에 인치 길이의 튜브를 놓습니다(그림 8D).
  9. 상단 아크릴 블록(PDMS 맥관 구조의 위쪽 절반 포함)을 아래쪽 아크릴 블록(PDMS 맥관 구조의 아래쪽 절반 포함)으로 뒤집습니다(그림 8E).
  10. 아크릴 블록을 바닥의 나사산 블록과 함께 볼트로 고정하고 인치 길이의 튜브의 자유 끝을 3D 프린팅 플러그로 연결합니다(그림 8F).
  11. 하나의 플러그를 제거하고 500μL의 HLMVEC 배양 배지를 맥관 구조에 부드럽게 주입하고 기포를 방지하기 위해 기울인 다음 플러그를 교체합니다.
  12. 조립된 전체 칩을 인큐베이터에 넣어 실리콘이 1-2시간 동안 경화되도록 합니다.
  13. 조립된 칩과 기타 모든 멸균 재료를 BSC로 가져오고 그림 9에 따라 모든 것을 연결하여 흐름 시스템을 설정합니다. 연동 펌프를 통해 맥관 구조 입구로 이어지는 튜브가 주사기 저장소 바닥에 부착되어 있는지 확인하십시오. 이렇게 하면 중력이 튜브에 공급되고 시스템의 기포를 줄일 수 있습니다.
  14. HLMVEC 배지로 유량 시스템을 부드럽게 프라이밍합니다. 50mL 혈청학적 피펫을 사용하여 주사기 저장소 상단에 30mL의 배지를 주입합니다(그림 10B). 연동 펌프를 낮은 유속으로 작동시켜 튜브를 채웁니다. 시스템이 완전히 프라이밍되고 모든 기포가 제거될 때까지 저장소에 매체를 계속 추가합니다.
    알림: 기포는 흐름 실험 중에 세포를 전단할 수 있습니다.
  15. 저장소 상단에 배치된 고무 마개에 부착된 피팅을 사용하여 튜브를 저장소 입구(혈관 몰드 출구에서)에 부착합니다(그림 10C).
  16. 연동 펌프에서 유량 시스템을 분리하여 금속 팬 위에 놓습니다. BSC에서 인큐베이터(37°C, 5% CO2)로 전체 설정을 부드럽게 운반합니다. 인큐베이터 뒷면을 통해 연동 펌프에 튜브를 공급합니다.
  17. 연동 펌프를 다시 부착하고 원하는 유속으로 설정하여 혈관 모델을 통해 혈류 속도를 에뮬레이션합니다.
  18. 펌프를 시동하고 누출이 없는지 확인하십시오. 시스템을 24시간 또는 원하는 기간 동안 실행합니다. 주기적으로 누출 여부를 확인하십시오.

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그림 8: 플로우 칩 구성. 흐름 칩을 구성합니다. (A) 세포 배양 플레이트에서 배지를 흡인합니다. (B) PDMS는 배지가 흡인된 후 반으로 나뉩니다. (C) 칩을 만드는 데 필요한 다른 재료(플러그, 주사기 필터, 1/2" 튜브 조각, 실리콘 실란트, 10x 나사 및 아크릴 블록)와 함께 플레이트에서 PDMS 절반을 제거합니다. (D) PDMS 반쪽을 아크릴 블록에 놓고 빨간색으로 표시된 위치에 실리콘 실란트를 도포합니다. (E) 튜브를 각 컷아웃에 놓습니다. (F) 플로우 챔버 반쪽을 연결하고 플러그와 주사기 필터를 부착합니다. BioRender.com 으로 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 9: 흐름 시스템 설정. 흐름 시스템 설정. 전체 흐름 시스템은 튜브, 튜브 커넥터, 연동 펌프, 주사기 저장소, 지지 스탠드 및 흐름 칩을 사용하여 구성됩니다. BioRender.com 으로 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 10: 흐름 시스템 프라이밍. 매체로 흐름 시스템을 프라이밍합니다. (A) 매체 없이 흐름 시스템을 간단하게 설정할 수 있습니다. (B) 주사기 저장소에서 고무 마개를 제거하고 튜브가 채워지고 저장소에 20-30mL의 초과 매체가 있을 때까지 매체를 지속적으로 추가합니다. (C) HLMVEC 배지로 프라이밍된 흐름 시스템. BioRender.com 으로 생성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 고정 및 염색

  1. 각 PDMS 맥관 구조의 절반을 PBS에서 5분 동안 세척합니다. 전체 혈관 섹션이 잠길 만큼 충분히 추가하십시오.
  2. 플레이트를 기울이고 PBS가 흘러나오도록 하여 맥관 구조에서 PBS를 흡인한 다음 유출물을 진공 흡인합니다.
  3. PBS에 600μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 각 혈관 절반에 첨가하고 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다.
  4. 2단계의 방법을 사용하여 PFA 용액을 적절한 폐기물 용기에 흡인합니다.
  5. 2단계의 절차를 사용하여 고정 세포를 PBS에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
    알림: 이러한 각 세척액은 포름알데히드에 대한 적절한 폐기물 용기에 폐기하십시오.
  6. 깨끗한 3D 프린팅 플러그로 PDMS 맥관 구조 반쪽의 끝을 막습니다.
  7. 차단을 위해 PBS에서 3% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다.
  8. 혈관 절반을 600μL의 차단 용액으로 채우고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
  9. 플러그를 제거하고 차단 용액을 흡인합니다.
  10. GCX9를 염색하기 위해 3% BSA 용액에서 접합 비오틴(1차 항체)과 함께 밀 배아 응집소(WGA) 렉틴의 1:200 희석액을 준비합니다.
  11. 플러그를 반환하여 맥관 구조의 끝을 막고 각 혈관 절반에 500μL의 1차 항체 용액을 추가합니다.
  12. 샘플을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  13. 이전에 사용한 기술에 따라 1차 항체를 부드럽게 흡인합니다.
  14. PBS로 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
  15. 3% BSA 용액에서 WGA 스트렙타비딘 접합체(2차 항체)의 1:500 희석액을 준비합니다.
  16. 맥관 구조의 끝을 막기 위해 플러그를 되돌리고 각 혈관 절반에 500μL의 2차 항체 용액을 추가합니다.
  17. 6.12-6.14단계를 반복합니다.
  18. 맥관 구조를 완전히 채우기 위해 간격을 두고 30μL 방울을 분배하여 혈관 표면에 DAPI 마운팅 매체를 추가합니다.
  19. 혈관 채널을 덮기 위해 PDMS에 유리 커버슬립을 놓습니다.
  20. 투명한 매니큐어를 사용하여 커버슬립 가장자리를 밀봉합니다.
  21. 플레이트를 주석 호일로 덮고 이미징할 때까지 4°C에서 보관합니다.

7. 이미징

  1. 현미경의 전원을 켜고 연결된 컴퓨터에서 view응용 프로그램을 엽니다.
  2. 현미경을 열고 빛을 올립니다. 샘플에 맞는 적절한 플랫폼을 부착합니다(다용도 페트리 접시 홀더).
  3. 현미경 내의 접시 홀더에 샘플을 놓고 관심 영역이 대물렌즈 위 중앙에 있도록 합니다.
  4. 조명을 내리고 현미경 뚜껑을 닫습니다.
  5. 현미경 소프트웨어에서 정지 이미지 캡처 옵션을 선택합니다.
  6. 시편 유형을 선택하고 다용도로 사용하십시오.
  7. 최상의 시각화를 위해 렌즈 섹션에서 적절한 대물렌즈를 선택하십시오.
  8. 현미경 소프트웨어에서 관심 영역(ROI)에 맞게 대물렌즈 위치를 조정합니다.
  9. 자동 초점을 선택하면 셀에 대략적으로 초점이 맞춰집니다.
  10. 이미지를 완전히 선명하게 하기 위해 초점을 수동으로 조정합니다.
  11. 밝기와 노출을 조정하여 세포를 보다 명확하게 시각화합니다.
  12. 소프트웨어에서 멀티 컬러 및 컬러 를 켭니다.
  13. CH 설정에서 CH1 플로어 DAPI 및 CH2 플로어 GFP를 켭니다.
  14. 각 채널의 밝기를 개별적으로 조정하여 이미지를 명확하게 시각화합니다.
  15. 현미경 소프트웨어에서 Z-Stack 을 선택합니다.
  16. 이미지를 가장 높은 평면으로 초점을 조정하고 설정을 선택하여 상한을 설정합니다.
  17. 이미지를 이미지에 가장 낮은 평면으로 초점을 조정하고 설정을 선택하여 하한을 설정합니다.
  18. 원하는 슬라이스 두께를 선택하고 캡처 시작을 눌러 이미지를 촬영합니다.
    참고: 이 이미지는 추가 수정을 위해 현미경 분석 소프트웨어로도 출력됩니다.

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결과

유체 시뮬레이션 층류 정상 상태 연구의 결과는 그림 11과 같이 대조군 모델과 비교할 때 전폐 절제술 모델의 특정 분기점에서 전단 응력이 증가한 것으로 나타났습니다. 프로토콜의 2.8단계에서 시각화된 빨간색 영역은 전단 응력이 높은 영역을 나타내고 파란색 영역은 전단 응력이 낮은 영역을 나타냅니다.

figure-results-1
그림 11: 시뮬레이션된 관심 영역. 전폐 절제술 모델에서 관심 영역을 시각화하는 유체 시뮬레이션. (A) 제어 모델에서 밝은 파란색 영역은 전단 응력이 더 높은 영역을 나타냅니다. (

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토론

혈관 모델링은 탐구를 위한 중요한 새로운 분야입니다. 정확한 혈관 모델의 성공적인 생성은 조직 공학 및 약물 개발 분야를 발전시키는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이 기사에서는 GCX 손상과 전폐 절제술 후 합병증 사이의 잠재적 연관성을 연구하기 위해 전폐 절제술 또는 기타 혈관 시스템 또는 형상을 에뮬레이션하는 데 활용할 수 있는 OOC 혈관 시스템을 생성하는 새로운 방법을 간략하게 설명합니다. 더 넓은 규모에서 이 방법론은 죽상동맥경화증이나 동맥류와 같은 기하학적 구조나 기타 질병 상태를 조정하여 다른 혈관계를 에뮬레이션하는 데에도 적용할 수 있습니다.

설명된 OOC 시스템은 시중의 다른 OOC 시스템에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 이 시스템은 간단한 제조 공정을 사용하며 OOC 대안에 비해 저렴합니다. 이를 통해 시스템을 쉽게 조정할 수 있으며, 다양한 혈관 영역을 모델링하고 평가할 수 있는 잠재력을 열어줍...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 지원과 지도에 대해 Worcester Polytechnic Institute 의생명공학과에 깊은 감사를 표하고 싶습니다. 이 연구의 품질과 실행 가능성을 크게 향상시킨 공동 노력과 혁신적인 아이디어에 대해 Megan Ouellette, John Martel 및 Sudish Vengat에게 특별한 감사를 표하고 싶습니다. 또한 Samantha Cocchiaro와 Udaya Rattan의 실험실 내 기여와 필수적인 지원 및 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#8-32 x 3/4인치 콤보 라운드 헤드 아연 도금 기계 나사(8팩)에버빌트204274613-
0.25% EDTA-트립신써모피셔 사이언티픽25200056 -
15mL 원추형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브써모 사이언티픽12-565-269-
35x10mm 접시, Nunclon Delta써모 사이언티픽153066-
50mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브써모 사이언티픽12-565-271-
모듬 고무 마개피셔브랜드14-132
BioLite 세포 배양 처리 플라스크 (25cm^2)써모 사이언티픽12-556-009-
BioLite 세포 배양 처리 플라스크 (75cm^2)써모 사이언티픽12-556-010-
COMSOL 다중물리컴솔해당 사항 없음-
양면 접착제 3분16758005-
Epredia Richard-Allan Scientific 커버 글래스 써모 사이언티픽22-050-218-
태아 소 세럼써모피셔 사이언티픽 A5256701 -
피브로넥틴써모피셔 사이언티픽 33016015 20 & 뮤; g/mL 희석
Fisherbrand Isotemp 디지털 제어 수조: 모델 210피셔브랜드15-462-10Q-
피셔브랜드 멸균 주사기 (60mL)피셔브랜드14-955-461-
인간 폐 미세혈관 내피 세포시그마 알드리치540-05A -
Keyence BZX810 형광 현미경키엔스해당 사항 없음-
Krayden Dow Sylgard 184 실리콘 탄성계 키트. 클리어, (1.1LB)다우4019862-
Marga Cipta 캐스트 아크릴 시트 1/2' 두께, 48x96'마르가 치프타해당 사항 없음-
Masterflex L/S Easy-Load II 펌프 헤드마스터플렉스77200-50
Masterflex L/S 정밀 펌프 튜빙, 백금 경화 실리콘, L/S 16; 25피트마스터플렉스96410-16-
Masterflex L/S 표준 연동 펌프마스터플렉스07522-20
마이크로피펫 0.2 내지 2 & L피셔브랜드FBE00002-
마이크로피펫 10 내지 100 & L피셔브랜드FBE00100-
마이크로피펫 100 내지 1000 & mu; L피셔브랜드FBE01000-
마이크로피펫 5 내지 50 & mu; L피셔브랜드FBE00050-
미세혈관 내피 세포 성장 배지 (500ml)시그마 - 알드리치111-500-
Nalgene 멸균 주사기 필터써모 사이언티픽725-2520-
Nikon Eclipse TS-100 형광 현미경니콘NI-TS100
인산염 완충 식염수(DPBS, 10X), Dulbecco의 포뮬러써모 사이언티픽J61917입니다. 케이3-
프루사먼트 PLA 프루사 갤럭시 블랙 1kg프루사PRM-PLA-GLX-1000-
Rebel 하이브리드 현미경, 정립 및 거꾸로, Echo 알아보기반향76376-746-
실리콘 실란트 록타이트908570-
솔리드웍스다쏘시스템해당 사항 없음
확대기 줄무늬가 있는 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학적 피펫(10mL)피셔브랜드13-678-11E-
확대기 줄무늬가 있는 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학적 피펫(25mL)피셔브랜드13-678-11-
돋보기 줄무늬가 있는 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학적 피펫(50mL)피셔브랜드13-678-11층-
확대기 줄무늬가 있는 멸균 폴리스티렌 일회용 혈청학적 피펫(5mL)피셔브랜드13-678-11D-
스트렙타비딘, Alexa Fluor 488 접합체인비트로젠 S32354
스트렙타비딘, Alexa Fluor 488 접합체인비트로젠S32354-
주사기 리세보아 BD300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1LT 알부민, 소, 분획 V, 35% 솔른, 시약 등급, 지방산 무함유, 아지드화물 함유써모 사이언티픽N12H004-
튜빙 커넥터피셔브랜드01-000-161-
DAPI 가 포함된 VECTASHIELD 퇴색 방지 마운팅 매체;벡타쉴드H-1200-10-
VWR 워터 재킷 CO2 인큐베이터아반타 10810-744 -
WGA 비오티닐화 항체벡터B-1025-

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