Single-Molecule Magnetic Tweezers를 사용한 텔로머 단백질-DNA 상호 작용 분석

Summary

이 프로토콜은 단일 분자 자기 핀셋을 사용하여 텔로미어 DNA 결합 단백질(텔로미어 반복 결합 인자 1[TRF1] 및 TRF2)과 인간 세포에서 추출한 긴 텔로미어 간의 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. 텔로미어 및 텔로메릭 반복 결합 인자에 대한 준비 단계, 단일 분자 실험의 실행, 데이터 수집 및 분석 방법에 대해 설명합니다.

Abstract

염색체 끝에 있는 보호 구조인 텔로미어는 세포의 수명과 게놈 안정성을 유지하는 데 매우 중요합니다. 그들의 적절한 기능은 복제, 신장 및 손상 반응의 엄격하게 조절된 과정에 달려 있습니다. 쉘터린 복합체, 특히 텔로미어 반복결합인자 1(TRF1)과 TRF2는 텔로미어 보호에 중추적인 역할을 하며 신약 개발을 위한 잠재적인 항암 타겟으로 부상하고 있습니다. 이 단백질은 반복적인 텔로머 DNA 모티프 TTAGGG에 결합하여 보호 구조의 형성과 다른 텔로머 단백질의 모집을 촉진합니다. 구조적 방법과 고급 이미징 기술은 텔로머 단백질-DNA 상호 작용에 대한 통찰력을 제공했지만, 동적 과정을 조사하려면 단일 분자 접근 방식이 필요합니다. 자기 핀셋, 광학 핀셋 및 원자력 현미경(AFM)과 같은 도구를 사용하여 텔로머 단백질-DNA 상호 작용을 연구하여 TRF2 의존성 DNA 왜곡 및 텔로머라아제 촉매와 같은 중요한 세부 사항을 밝힙니다. 그러나 텔로메릭 반복 모티프를 가진 단일 분자 구조를 준비하는 것은 계속해서 어려운 작업이며, 잠재적으로 단일 분자 기계적 방법을 활용하는 연구의 폭을 제한할 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 자기 핀셋으로 전신 인간 텔로머 DNA를 사용하여 상호 작용을 연구하는 방법을 개발했습니다. 이 프로토콜은 TRF2를 발현 및 정제하고, 텔로머 DNA를 준비하고, 단일 분자 기계적 분석을 설정하고, 데이터를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 자세한 가이드는 텔로미어 생물학 및 텔로미어 표적 약물 발견 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

Introduction

텔로미어는 ^1,2,3번 염색체의 끝에 있는 보호 구조입니다. 세포 분열 중 텔로미어 침식은 세포 노화와 노화를 유발하며, 텔로미어의 비정상적인 신장은 암을 유발합니다 ^4,5. 텔로미어가 제대로 기능하기 위해서는 텔로미어의 복제, 신장 및 손상 반응이 고도로 조절되어야 합니다 ^6,7,8. 6개의 소단위로 구성된 쉘터린(Shelterin)은 텔로미어 보호에 중심적인 역할을 한다 ^9,10,11. 텔로미어에 대한 더 깊은 이해는 텔로미어 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 것입니다.

쉘틴의 핵심 소단위인 TRF1 및 TRF2는 텔로머 결합 단백질^12,13입니다. TRF1과 TRF2는 모두 Myb 도메인¹⁴를 통해 텔로미어의 반복적인 DNA 모티프 TTAGGG에 결합합니다. 그들은 공유된 TRFH 도메인을 통해 이량체를 형성하여 텔로머 이중 가닥 DNA를 둘러싸고 텔로머 단백질 15,16,17,18,19를 모집할 수 있습니다. TRF2는 텔로머 D-루프 및 T-루프^20,21의 형성에 특히 중요하다. 텔로미어 보호에 중요한 역할을 하기 때문에 TRF1 및 TRF2는 잠재적인 항암제 표적으로 부상하고^있습니다 22,23,24,25.

텔로미어에서 단백질-DNA 상호 작용을 조사하기 위해 상당한 노력이 기울여졌습니다. EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay) 및 SPR(Surface Plasmon Resonance)과 같은 생화학적 방법을 사용하여 결합 친화도를 검사했습니다^20,26. DNA와 복합체된 텔로머 결합 단백질의 수많은 구조는 초저온 전자 현미경(cryo-EM), X선 결정학 및 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 설명되었습니다.27,28,29. STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)과 같은 초고해상도 이미징 기술은 TRF2 의존성 T-루프 형성²¹을 밝혀냈습니다. 최근에는 나노포어 시퀀싱이 텔로머 서열 ^4,30,31을 프로파일링하기 위해 개발되었습니다. 이러한 구조적 통찰력은 텔로머 단백질-DNA 상호 작용에 대한 우리의 이해를 크게 향상시켰습니다. 텔로머 단백질-DNA 상호 작용의 역학을 더 자세히 연구하려면 새로운 기술의 개발이 필수적입니다.

단일 분자 도구는 텔로미어 32,33,34에서 단백질-DNA 상호 작용을 탐색하기 위한 강력한 기술입니다. 자기 핀셋, 광학 핀셋 및 AFM과 같은 단일 분자 기계적 방법을 사용하여 TRF2 의존성 DNA 왜곡을 조사하고, 인간 텔로머릭 크로마틴의 TRF2 매개 원주 적층을 밝히고, 다른 응용 분야 중에서 진행성 텔로머라아제 촉매 작용을 관찰합니다 35,36,37,38,39,40. 이러한 방법은 토폴로지 구조와 단백질-DNA 결합 및 해리의 역학을 조사하는 데 특히 유용합니다.

그러나 텔로메릭 반복 모티프를 가진 단일 분자 구조를 준비하는 것은 여전히 도전 과제를 제시하며, 이는 단일 분자 기계적 방법을 사용하는 연구를 제한합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 전장 인간 텔로미어(full-length human telomeres⁴¹)에서 글로벌 단백질-DNA 상호작용을 연구하기 위한 단일 분자 기계적 방법을 개발했다. 이 방법은 인간 세포에서 텔로머 DNA를 직접 추출하여 인공 텔로머 DNA의 힘든 준비를 피할 수 있습니다. 그것은 수 킬로베이스에 걸쳐 있는 긴 천연 텔로미어의 운동 과정 조사를 용이하게 합니다.

이 프로토콜에서는 널리 사용되는 단일 분자 기계 도구 42,43,44인 자기 핀셋을 사용하여 텔로머 단백질-DNA 상호 작용을 조사하는 단계에 대한 자세한 설명을 제공합니다. TRF2를 예로 들어 텔로머 단백질을 발현하고 정제하는 방법과 인간 세포에서 텔로머 DNA를 제조하는 방법을 보여줍니다. 또한 텔로머 단백질-DNA 상호 작용을 연구하기 위해 자기 핀셋에 단일 분자 분석을 설정하는 방법을 보여주고 단일 분자 실험의 후속 데이터 분석을 다룹니다. 이 프로토콜은 텔로미어 생물학 및 텔로미어 표적 약물 발견 분야의 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

Protocol

1. 일반 재료 및 방법

1. 이 프로토콜에 사용된 염, 화학 물질, 항생제, 효소, 항체 및 수지 재료에 대해서는 Table of Materials 파일을 참조하십시오.
2. 콜드 스프링 하버 프로토콜 45,46,47,48,49,50,51,52,53의 조리법에 따라 Luria-Bertani(LB) 액체 매체, LB 한천 플레이트, HEPES 완충액, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 인산염 완충 식염수(PBS), Tris-EDTA(TE) 완충액을 준비합니다.
3. 상용 소스를 통해 pET28a 벡터(Addgene), 원핵생물 및 진핵생물 세포주(ATCC)를 획득합니다. 그런 다음 실험실에서 지속적으로 배양하고 통과시킵니다.
4. 많은 양의 액체의 경우 120°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다. 소량의 경우 공극 크기가 0.22μm인 제균 필터를 사용하십시오.
5. 용액을 최종 부피로 가져오기 전에 HCl 또는 NaOH를 사용하여 용액의 pH를 원하는 수준으로 조정합니다.
   참고: 자기 핀셋은 맞춤 제작되어 LabVIEW 2017 환경에서 실행되며, 단일 분자 데이터 분석은 MATLAB 2017 ^2,54,55에서 수행됩니다.
6. 안전상의 이유로 긴팔 실험복, 니트릴 장갑(또는 불침투성 및 물질에 내성이 있는 재료로 만든 장갑), 보안경 또는 고글, 발가락이 막힌 신발을 착용하십시오.

2. 텔로머 DNA 결합 단백질의 단백질 발현 및 정제

1. 세포 배양을 수행하고 단백질 발현을 유도합니다.
   1. 텔로머 DNA 결합 단백질(그림 1A)에 대한 암호화 서열(이 경우 예: TRF2)을 효소 분해 및 결찰(fusion tag)로 사용하여 SUMO를 사용하여 pET28a 벡터에 삽입합니다. BamHI와 HindIII의 제한 부위 사이에 삽입하여 pET28a-SUMO-TRF2의 플라스미드를 생성합니다(그림 1B).
   2. pET28a-SUMO-TRF2 plasmid로 BL21(DE3) 세포를 형질전환시킵니다.
      1. 유능한 BL21(DE3) 세포의 50μL 부분 표본을 얼음에서 해동합니다.
      2. pET28a-SUMO-TRF2 플라스미드(DNA 50ng 함유)의 DNA 1μL를 competent cell에 추가합니다. 부드럽게 휘저어 위아래로 피펫팅하지 않고 혼합합니다.
         알림: 소용돌이치지 마십시오.
      3. 혼합물을 얼음에 30분 동안 배양합니다.
      4. 열 충격의 경우 셀 혼합물을 42°C에서 수조에서 정확히 45초 동안 가열합니다. 형질전환된 세포를 안정화시키기 위해 즉시 세포를 2분 동안 얼음으로 되돌립니다.
      5. 950μL의 실온(RT) LB 배지를 세포에 추가하여 회수를 용이하게 합니다.
      6. 형질전환된 세포를 37°C에서 220rpm으로 흔들면서 1시간 동안 배양합니다.
      7. 50 μg/mL 카나마이신(85.8 μM)을 함유한 LB 한천 플레이트에 형질전환 혼합물 100μL를 펴 바릅니다.
      8. 도금된 세포를 37°C에서 밤새 배양합니다. 배양 후에는 스타터 배양균의 접종에 사용할 뚜렷한 콜로니를 선택합니다.
         참고: 플레이트의 콜로니는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
   3. 형질전환된 BL21(DE3) 세포의 콜로니를 채취하여 50μg/mL 카나마이신(85.8μM)이 보충된 5mL의 LB 배지에서 배양합니다. 37 °C에서 220 rpm에서 진탕하면서 18 시간 동안 배양합니다.
   4. 스케일을 확장하려면 야간 배양액 2mL를 50μg/mL 카나마이신(85.8μM)을 함유한 LB 배지 200mL로 옮깁니다. 600nm(OD 600)의 광학 밀도가 0.6-0.8에 도달할 때까지 220rpm에서 흔들면서 37°C에서 계속 배양합니다.
   5. 배양액 1mL를 유도되지 않은 대조군 샘플로 채취합니다.
   6. 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 남은 배양을 최종 농도 1mM까지 유도하고 20°C에서 17시간 동안 배양하여 단백질 발현을 촉진합니다.
   7. 5% 스태킹 겔과 10% 분리 겔을 사용하여 SDS-PAGE를 수행합니다. SDS-PAGE 로딩 버퍼로 샘플을 로드하고 처음에 SDS-PAGE를 100V에서 30분 동안 실행한 다음 Tris-Glycine 버퍼에서 50분 동안 120V를 실행합니다. 단백질 발현을 시각화하기 위해 Coomassie blue로 염색합니다( 보충 표 1의 레시피 참조)(그림 1C).
      참고: 표현식이 관찰되지 않는 경우 문제 해결에 대한 설명을 참조하십시오.
2. 단백질을 정제하십시오.
   1. 4°C, 8500 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 PBS 200mL로 세척합니다. 다시 원심분리하고, 상층액을 버리고, 세포 펠릿을 25mL의 용해 완충액(20mM HEPES, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0.5mM DTT, 1mM 페닐메틸설포닐플루오라이드[PMSF])에 재현탁시킵니다.
      주의: PMSF는 부식성이며 독성이 있으며 화상을 유발할 수 있습니다. 적절한 보호복, 장갑 및 눈/얼굴 보호구를 착용하십시오.
      알림: 즉시 진행하지 않을 경우 -80 °C에서 얼립니다.
   2. 5 μL의 100 mg/mL 라이소자임, 5 μL의 1 U/μL DNase I, 5 μL의 10 mg/mL RNase A를 재현탁 세포에 추가합니다.
   3. 총 30분 동안 1W에서 250초 동안 파열한 다음 2초 동안 일시 중지하여 얼음 위에서 초음파 처리를 수행합니다.
   4. 38,000 x g, 4°C에서 40분 동안 원심분리하고(30-60분 허용) 0.22μm 주사기 필터를 통해 상층액을 여과합니다.
   5. 8.76g의 NaCl(최종 농도 300mM)과 0.68g의 이미다졸(최종 농도 20mM)을 20mM HEPES(pH 8.0)에 용해시켜 500mL의 Ni-column 결합 완충액을 준비합니다. 0.22μm 필터를 통해 용액을 여과합니다.
      주의: 이미다졸은 위험하며 피부와 눈에 자극을 줄 수 있습니다. 또한 태아에게도 해를 끼칠 수 있습니다. 눈, 피부, 의복과의 접촉을 피하십시오. 섭취하거나 흡입하지 마십시오. 안면 보호구를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
   6. 단계적 용리를 위해 이미다졸(100mM, 200mM, 300mM 및 500mM) 농도를 증가시킨 Ni-column 용출 완충액(20mM HEPES(pH 8.0), 300mM NaCl)을 준비하여 모든 완충액이 적절하게 여과되도록 합니다.
   7. 여과된 상층액을 결합 완충액(20mM HEPES(pH 8.0), 300mM NaCl, 20mM 이미다졸)의 사전 평형화된 Ni-컬럼에 로드합니다. 결합 완충액으로 세척하고 준비된 이미다졸 그래디언트로 단백질을 용출하여 각각 1mL가 있는 12개의 분획을 수집합니다(그림 1C). 순도가 >95%인 분획을 결합합니다.
   8. 분광 광도계에서 A₂₈₀ 으로 용리된 6xHis-sumo-TRF2 융합 단백질의 농도를 측정합니다.
   9. 단일 분자 분석에 사용되는 단백질의 경우 제조업체의 지침에 따라 sumo 프로테아제를 추가하고(일반적으로 융합 단백질 2μg당 프로테아제 0.125U) 4°C에서 하룻밤 동안 분해합니다.
   10. 스모 프로테아제 처리 후 혼합물을 Ni-column에 다시 로드하여 소화되지 않은 융합 단백질과 His-tagged sumo에 결합하여 tag-free TRF2 단백질이 흐를 수 있도록 합니다. 플로우 스루를 수집합니다.
3. 단백질 농도를 측정하고 단백질을 저장합니다.
   1. 30kDa 차단 원심 필터 장치를 사용하여 정제된 TRF2 단백질을 농축하고 20mM HEPES(pH 8.0), 150mM NaCl, 0.5mM DTT를 포함하는 저장 완충액으로 교체하여 이미다졸 농도를 150mM 미만으로 낮춥니다.
   2. 부피가 1mL 미만으로 줄어들 때까지 농축 과정을 반복합니다.
   3. 단백질의 순도와 무결성을 평가하기 위해 SDS-PAGE로 각 정제 단계의 샘플을 분석합니다(그림 1C).
      참고: 친화성 크로마토그래피는 단백질을 정제하고, 용리된 샘플을 수집 및 세척하고, 단백질 무결성을 평가하고 품질 관리를 보장하기 위해 SDS-PAGE를 수행하는 데 사용됩니다. 친화성 크로마토그래피만으로 순도 요구 사항을 충족하지 못하는 경우 단백질 순도를 더욱 향상시키기 위해 크기 배제 크로마토그래피가 사용됩니다. UV 흡광도 곡선은 용리 분율을 평가하는 데 도움이 되며, SDS-PAGE는 단백질 무결성을 확인하여 공정 전반에 걸쳐 엄격한 품질 관리를 보장합니다.
   4. 저장을 위해 농축 및 완충액 교환 단백질에 최종 농도 50%까지 글리세롤을 첨가합니다.
   5. 단백질을 -80 °C에서 보관하십시오.

3. 인간 텔로머 제한 단편의 제조

1. 게놈 DNA를 추출합니다.
   1. 순서도(그림 2A)에 따라 1000 x g에서 1 x 10⁷ 셀을 3분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세척을 위해 세포를 200μL의 PBS에 재현탁시키고 1000 x g에서 3분 동안 다시 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
   2. 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 100 mM EDTA 및 1 % SDS를 포함하는 760 μL의 완충액을 1 x 10⁷ 세포가 들어있는 튜브에 추가하고 기포를 피하기 위해 피펫팅으로 부드럽게 재현탁합니다.
      알림: 소용돌이치지 마십시오.
   3. 단백질의 분해와 샘플에서 DNase 및 RNase를 제거하기 위해 Proteinase K를 10mg/mL 원액의 40μL에 해당하는 0.5mg/mL의 최종 농도로 첨가합니다. 혼합할 튜브의 바닥을 두드립니다(소용돌이 치지 않음).
   4. 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   5. 5.4m NaCl 265μL를 추가합니다. 튜브를 1분마다 5회 뒤집어 5분 동안 섞은 다음 얼음 위에 20분 동안 놓습니다.
   6. RT에서 10분 동안 최대 속도(예: 16,900 x g)로 원심분리합니다.
   7. 상층액을 원심분리 튜브로 옮기고 동일한 부피의 이소프로판올(약 750μL)을 추가하여 부유 지질이나 침전물을 피합니다. DNA는 상층액에 있습니다.
   8. 튜브를 5번 뒤집어 섞습니다. 원심분리기 튜브에 침전되는 DNA 펠릿의 존재를 육안으로 확인합니다.
   9. 10분 동안 최대 속도로 RT에서 원심분리기.
   10. 상층액을 버리십시오. 원심분리기 튜브를 5회 뒤집어 500μL의 70% 에탄올로 DNA 펠릿을 세척합니다.
       참고: 펠릿은 DNA입니다.
   11. RT에서 최대 속도(예: 16,900 x g)로 10분 동안 원심분리합니다.
   12. DNA 펠릿을 남기고 모든 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 펠릿을 실온에서 5분 동안 자연 건조시킵니다.
       알림: 게놈 DNA가 용해되기 어려울 수 있으므로 과도한 건조를 피하십시오.
   13. DNA 펠릿을 475μL의 TE 완충액(10mM Tris-HCl[pH 8.0], 1mM EDTA)에 재현탁시킵니다. 튜브 바닥을 두드려 부드럽게 섞습니다. DNA 준비 중 RNA를 분해하기 위해 10mg/mL RNase A 25μL(최종 농도 0.5mg/mL)를 추가하고 DNA 펠릿이 완전히 용해될 때까지 가볍게 두드려 혼합합니다.
       알림: DNA 전단을 방지하기 위해 소용돌이를 피하십시오.
   14. DNA 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   15. 동일한 부피의 트리스 포화 페놀 추출 수행: 원심분리기 튜브에 500μL의 페놀을 추가하고 피펫으로 부드럽게 혼합한 다음 4°C에서 10분 동안 최대 속도로 원심분리합니다.
       주의: 페놀에 노출되면 피부, 눈, 코, 목 및 신경계에 자극을 줄 수 있습니다. 눈, 피부, 의복과의 접촉을 피하십시오. 섭취하거나 흡입하지 마십시오. 안면 보호구를 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오.
       참고 : DNA는 상부 수성 상부에 있고, 단백질은 간기에 있으며, 유기 상은 맨 아래에 있습니다.
   16. 세 번 반복합니다. DNA의 상층액(약 280μL)을 취합니다.
   17. DNA 샘플의 부피에 따라 3M 아세트산 나트륨(최종 농도 0.3M, pH 5.2)의 1/10 부피(28μL)와 차가운 100% 에탄올 2부피(616μL)를 추가합니다. 원심분리기 튜브를 -80°C에서 2-3시간 동안 놓습니다.
   18. 4°C에서 10분 동안 최대 속도(예: 16,900 x g)로 원심분리합니다. 원심분리 전에 용액이 얼면 얼음에서 해동하십시오.
   19. 상층액을 버리고 원심분리기 튜브를 뒤집어 3% 에탄올로 4-70회 세척합니다. 5°C에서 4분 동안 최대 속도로 원심분리합니다.
   20. 에탄올을 제거하고 펠릿을 실온에서 5분 동안 자연 건조시킵니다.
   21. 100μL의 TE 버퍼를 추가하고 튜브를 두드려 혼합한 다음 4°C에서 2시간 동안 그대로 두어 완전히 용해시킵니다.
       참고: 1% 아가로스 겔에서 게놈 DNA의 무결성을 검사합니다(그림 2B).
   22. DNA를 -20 °C의 냉동고에 보관합니다. 최소 1년 동안 안정적으로 유지됩니다.
2. 게놈 DNA 분해 및 변형을 수행합니다.
   1. 4 μg의 게놈 DNA를 1 μL의 CviAII (10 U), 2 μL의 10x 분해 완충액 (레시피는 보충 표 1 참조)과 결합하고 물을 첨가하여 총 부피가 20 μL에 도달합니다. 혼합물을 25 °C에서 12 시간 동안 배양합니다.
      참고: FatI는 현재 NEB에 의해 중단된 CviAII를 대체할 수 있습니다.
   2. 이전 혼합물(20μL)이 포함된 동일한 튜브에 1μL의 NdeI(20U), 1μL의 MseI(10U) 및 1μL의 BfaI(10U)를 추가합니다. 또한 2 μL의 10x 분해 완충액과 15 μL의 물을 첨가하여 총 부피가 40 μL가 됩니다. 37 °C에서 12 시간 동안 배양 한 다음 80 °C에서 20 분 동안 모든 효소를 가열 비활성화합니다.
      참고: 게놈 DNA의 분해는 TRF(Terminal Restriction Fragment) 방법을 사용하여 검사할 수 있습니다(그림 2C). 4가지 제한 효소(CviAII, NdeI, MseI 및 BfaI)의 조합은 게놈 DNA를 약 800bp의 단편으로 분해하고 최소의 텔로머 DNA 오염으로 TRF를 생성합니다.
   3. 디고시제닌 변형을 위해 분해된 게놈 DNA 40μL를 취하고 1mM dATP 4μL(최종 농도 0.08mM), 1mM digoxigenin-11-dUTP 4μL(최종 농도 0.08mM), Klenow Fragment(5U) 1μL, 100mM DTT 0.5μL(최종 농도 1mM) 및 10x 분해 완충액 1μL를 추가합니다. 37°C에서 12시간 동안 배양한 후 75°C에서 20분 동안 가열하여 Klenow Fragment를 비활성화합니다.
   4. 비오틴 라벨링을 위해 12.5 μL의 Digoxigenin 변형 게놈 DNA(1 μg)를 취하고 텔로머 단일 가닥 돌출부를 보완하는 1 μM 비오틴화 텔로미릭 프로브(즉, 1 pmol) 1 μL를 추가합니다. 611.5 μL의 TE Li 완충액 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 50 mM LiCl)을 첨가하여 50 mM K 이온을 1 mM으로 희석하여 총 부피 625 μL를 만들며, 이는 각각 39 μL의 16 개의 튜브로 나눌 수 있습니다.
   5. 열 순환기에서 75°C에서 3분 동안 가열한 다음 0.1°C에 도달할 때까지 30초마다 온도를 25°C씩 낮춥니다.
   6. DNA 샘플을 -20 °C에서 최소 1년 동안 보관합니다.

4. 자기 핀셋에 텔로머 DNA 시료를 위한 플로우 셀 설정

1. 단일 분자 분석을 위한 플로우 셀을 만듭니다.
   1. 전기 그라인더를 사용하여 상단 커버슬립의 입구와 출구로 구멍을 뚫습니다(두께가 0.2mm인 # 2 커버 유리).
   2. 커버슬립을 세제에 넣고 30분 동안 초음파 처리하여 청소합니다.
   3. 커버 슬립을 초순수로 3회 세탁합니다.
   4. 이소프로판올의 커버슬립을 30분 동안 초음파 처리하여 청소합니다.
   5. 커버슬립을 초순수로 3회 세탁합니다.
   6. 15-30 분 동안 초음파 처리로 초순수로 커버 슬립을 청소하십시오.
   7. 커버슬립을 질소로 건조시킵니다.
      알림: 여기에서 프로토콜을 중지할 수 있으며 청소한 커버슬립은 나중에 사용할 수 있도록 보관할 수 있습니다.
   8. 하단 커버슬립(구멍 없음)에 0.1% 니트로셀룰로오스 20μL를 코팅하고 기준 비드(20배 희석, 직경 3μm)를 추가합니다. 100°C에서 4분 동안 굽습니다.
   9. 메스를 사용하여 금속 금형에 따라 이중층 파라필름 스페이서를 절단합니다. 이 금형은 커버슬립과 동일한 치수의 직사각형 알루미늄 합금 조각으로, 채널 절단을 용이하게 하기 위해 속이 빈 중심이 특징입니다.
   10. 플로우 셀 샌드위치를 조립합니다(그림 3A). 85°C에서 가열하고 두 개의 면봉을 사용하여 파라필름이 채널을 밀봉할 때까지 마사지합니다.
   11. 플로우 셀(flow cell)을 항체로 코팅합니다. 70μL의 anti-digoxigenin 항체(0.1mg/mL)를 플로우 셀에 직접 주입합니다. 상온에서 1시간 동안 그대로 두십시오.
   12. 플로우 셀(flow cell)을 부동태화합니다. 70μL의 10mg/mL BSA를 주입하여 항-디곡시제닌 항체를 대체합니다. 12시간 동안 실온에서 그대로 두십시오. 결합되지 않은 항-디곡시제닌 항체는 다음 단계에 따라 엄격한 세척으로 세척됩니다.
       참고: 플로우 셀을 4°C에서 1-2주 동안 보관하십시오.
   13. DNA가 없는 세척된 MyOne(10mg/mL) 5μL(또는 세척된 M270(10mg/mL) 비드 5μL를 플로우 셀로 플러시하여 비특이적 결합을 테스트합니다. 10분 동안 그대로 둔 다음 작동 완충액(20mM HEPES(pH 7.5), 100mM NaCl, 1mM EDTA)를 사용하여 비드를 씻어냅니다. 한 시야에서 표면에 붙어있는 구슬의 수를 계산합니다. 잘 처리된 표면에는 비드가 0개 또는 몇 개만 표시되어야 합니다.
2. 플로우 셀(flow cell)에서 텔로머 DNA 테더(telomeric DNA tethers)를 분리하고 고정시킵니다.
   1. 10μL의 M270 비드(10mg/mL) 또는 5μL의 10mg/mL MyOne을 자석을 사용하여 50μL의 작업 완충액(20mM HEPES[pH 7.5], 100mM NaCl, 1mM EDTA)으로 5회 세척합니다.
   2. 500ng의 분해된 게놈 DNA를 1.5mL 원심분리 튜브에 넣습니다. DNA 샘플 위에 모든 비드(50μL)를 추가합니다.
   3. 피펫팅하지 않고 원심분리기 튜브를 몇 번 부드럽게 튕겨 비드와 DNA 샘플을 혼합합니다. 혼합물을 얼음 위에 1시간 동안 그대로 두십시오. 500μL의 작업 버퍼로 자석을 사용하여 비드를 아래로 당기고 세척 사이에 10분 간격으로 세 번 세척합니다.
   4. 30 μL의 작업 버퍼를 사용하여 시료를 재현탁하고 혼합물을 플로우 셀에 로드합니다. 30분 동안 그대로 두십시오. 바인딩되지 않은 마그네틱 비드를 세척합니다.
      참고: 텔로머 DNA는 digoxigenin-antibody 및 biotin-streptavidin에 의해 매개되는 친화성 상호 작용을 통해 하단 커버 슬립과 마그네틱 비드 사이에 연결되어 있습니다(그림 3B).
3. 마그네틱 핀셋에 플로우 셀(flow cell) 설정
   1. 플로우 셀을 70% 에탄올로 세척하고 렌즈 티슈를 사용하여 표면을 건조시킵니다. 세척된 플로우 셀을 하단 샘플 홀더에 놓고 드라이버를 사용하여 상단 샘플 랙을 부드럽게 조립합니다.
   2. 렌즈 오일 한 방울을 플로우 셀(flow cell)의 바닥 표면에 바르면 대물렌즈와 정렬됩니다. 그런 다음 샘플 홀더를 대물 렌즈 위에 놓고 드라이버를 사용하여 고정합니다.
   3. 수직 구성으로 배열된 한 쌍의 5mm 입방체 자석을 선택합니다. 이미징을 위해 자석 홀더를 자기 핀셋의 광 경로의 X축에 맞춥니다.
      참고: 이것은 중요한 단계입니다. 자기장의 방향은 정렬되어 자석 홀더의 방향에 따라 결정됩니다.
   4. 그래픽 프로그래밍 소프트웨어를 실행하고 자기 핀셋용 컨트롤러를 연결합니다. 시야를 조정하여 플로우 셀의 하단에서 reference bead를 찾고 reference bead가 명확한 회절 고리를 보이도록 대물렌즈를 약간 조정합니다.
   5. 자석을 플로우 셀의 상단으로 이동합니다.
      참고: 이것은 중요한 단계입니다. 비드 회절 패턴의 급격한 변화는 자석이 플로우 셀의 표면에 방금 닿았음을 나타냅니다. 이 위치는 측정 영점에 대한 오프셋으로 간주됩니다.
      알림: 더 큰 단계부터 시작하여 점차적으로 더 작은 단계로 이동하면서 자석을 조심스럽게 내립니다. 플로우 셀에 접근할 때 플로우 셀이 손상되지 않도록 0.1mm 단위로 이동합니다.
   6. 자석을 가장 높은 위치로 올리고 자석 홀더를 제거합니다.
   7. 쓰레기통에 연결된 연동 펌프를 켜고 액체를 버리십시오. 100 μL의 작동 버퍼를 입구에 추가하고 연동 펌프 유속을 100 μL/min으로 설정하여 플로우 셀을 버퍼로 채웁니다.

5. single-molecule magnetic tweezers를 이용한 텔로미어 측정

1. 카메라를 설정합니다.
   1. CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor) 카메라의 그레이스케일을 설정하여 밝기를 150 레벨로 조정합니다.
   2. 관심 영역(ROI)의 크기를 정의합니다.
   3. 프레임 속도를 200Hz로 설정하고 노출 시간은 5000μs입니다.
      참고: 이것은 중요한 단계입니다. 셔터 데드 타임이 0으로 설정되어 있는지 확인합니다.
   4. 자석 위치를 3cm(약 8pN)로 이동하고 비드에 대한 대물렌즈 초점을 조정합니다.
2. 룩업 테이블(LUT)을 설정합니다.
   1. 자석을 8pN에 해당하는 위치로 이동하여 DNA 테더링된 마그네틱 비드를 단단히 늘립니다.
   2. LUT를 0.05μm의 단계 크기로 200단계로 설정합니다.
   3. CMOS 카메라를 사용하여 서로 다른 위치에서 자기 비드의 프로파일을 캡처하여 LUT를 설정합니다.
      참고: 이것은 중요한 단계입니다. 플로우 셀(flow cell)에 고정된 폴리스티렌 비드(polystyrene beads)는 관심 비드(bead)의 드리프트를 제거하기 위한 기준 비드(reference bead) 역할을 합니다.
3. 단일 분자 기계 실험을 설계합니다.
   1. MATLAB에서 force ramp 또는 force jump assay를 위한 모터 움직임을 제어하는 스크립트를 작성할 수 있습니다.
      참고: 이것은 중요한 단계입니다. 이 스크립트는 자석 이동에 대한 명령을 인코딩합니다. 하중 하중 비율은 force ramp 분석을 위해 이 단계에서 설정됩니다. force jump assay의 수준과 지속 시간도 여기에서 결정됩니다(그림 4, 보충 파일 1, 보충 파일 2 및 보충 파일 3).
   2. 스크립트를 그래픽 프로그래밍 소프트웨어로 가져와 단일 분자 실험을 테스트합니다.
   3. 단일 분자 실험을 실행하는 데 필요한 총 프레임을 확인하고 사용 가능한 메모리가 이 요구 사항을 초과하는지 확인합니다.
      참고: 데이터를 저장하는 데 시간이 걸리기 때문에 할당된 메모리가 필요한 것보다 적으면 데이터가 손실됩니다.
   4. 최대 이미징 속도를 확인하여 동시에 모니터링할 수 있는 최대 비드 수를 결정합니다.
      참고: 이미징 속도 제한을 초과하면 실험이 종료됩니다.
   5. force jump assay를 예로 들어 단일 분자 기계 실험을 실행합니다. 힘은 자기 비드에 갑자기 가해지고, 이 힘은 이러한 힘을 DNA 분자로 전달하여 즉시 위쪽으로 늘어납니다.

6. 자기 핀셋을 이용한 텔로미어의 TRF1/2 측정

1. Force ramp 어세이
   1. TRF1을 예로 들면, 10nM TRF1 200μL를 느린 유속(예: 30μL/min)으로 플로우 셀에 로드합니다. TRF1이 텔로머 DNA에 결합할 때까지 30분 동안 기다립니다.
   2. 힘 로딩 속도가 ±1pN/s인 힘 램프 실험을 위한 스크립트를 선택합니다.
   3. 데이터 파일의 이름을 적절하게 지정하고 실험을 실행합니다. 데이터는 분석을 위해 지정된 대상에 저장됩니다(그림 5).
      참고: 이 실험 동안, 힘은 0 pN과 17 pN 사이에서 선형으로 증가 및 감소하며, 이는 텔로머 DNA를 늘리고 이완시키고 TRF1/2에 의해 매개되는 DNA 루프를 끊습니다.
2. Force Jump 어세이
   1. force jump assay를 실행할 스크립트를 선택합니다.
      참고: 텔로머 DNA를 늘리기 위해 다양한 힘이 가해집니다(예: 40초 동안 0pN에서 "Rest force"(Frest), 60초 동안 2-8pN에 이르는 "Test force"(Ftest), 30초 동안 10pN에서 "High force"(Fhigh), 30초 동안 20pN에서 "최대 힘"(Fmax).
   2. 데이터 파일의 이름을 적절하게 지정하고 실험을 실행합니다. 데이터는 분석을 위해 지정된 대상에 저장됩니다(그림 5).

Results

그림 1A는 원핵 세포에서 발현될 수 있는 각각 439개 및 542개의 아미노산으로 구성된 TRF1 및 TRF2의 개략적인 도메인과 구조를 보여줍니다. TRF1의 제조는 문헌⁴¹에 이전에 기재되어 있다. 여기에서는 TRF2 제조에 대한 포괄적인 설명과 대표적인 결과를 제공합니다. 그림 1B는 E. coli에서 TRF2를 발현하는 데 사용되는 plasmid map을 보여줍니다. 그림 1B와 같이 E. coli에서 유도 전후의 TRF2 발현을 평가했습니다. 정제 및 태그 절단 공정도 SDS-PAGE를 사용하여 분석했습니다(그림 1C). 이 프로토콜에 따라 텔로머 결합 단백질인 TRF1 및 TRF2가 모두 E. coli에서 성공적으로 발현되었습니다.

텔로머 DNA는 말단 제한 단편(TRF) 형태로 4개의 제한 효소의 조합을 사용하여 인간 게놈에서 생성됩니다. 그림 2A에 표시된 순서도에 따라 인간 세포에서 게놈을 추출했습니다. 이 효소는 전장 텔로머 DNA를 그대로 유지하면서 게놈 DNA를 선택적으로 소화하여 단일 분자 분석을 위한 물질을 제공합니다. 당사는 다양한 인간 세포주를 사용하여 TRF DNA 제제를 광범위하게 테스트했습니다. 게놈 DNA의 무결성은 그림 2B와 같이 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 검사했습니다. TRF는 이후에 텔로메릭 반복 서열 TTAGGG(그림 2C)에 상보적인 형광 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 다른 곳에서 설명된 방법^41,56에 따라 Southern blotting으로 분석되었습니다. 평균적으로 인간 TRF의 길이는 약 몇 킬로베이스입니다.

단일 분자 분석은 그림 3A에 설명된 대로 조립된 플로우 셀에서 이루어집니다. 니트로셀룰로오스 코팅은 음전하를 띤 유리 표면을 덮어 항체 흡착을 위한 친수성 매트릭스를 제공합니다. BSA 패시베이션은 항-디곡시제닌 항체에 의해 결합되지 않은 니트로셀룰로오스 매트릭스 영역을 차단합니다. 철 나노 입자를 포함하지 않는 폴리스티렌 비드는 기준 비드 역할을합니다. TRF 테더는 니트로셀룰로오스 매트릭스의 디곡시제닌 항체와 마그네틱 비드 표면의 비오틴-스트렙타비딘 사이의 친화성 상호 작용을 통해 형성됩니다(그림 3B). TRF1 또는 TRF2는 플로우 셀에 도입되어 자유 확산을 통해 TRF DNA 테더에 결합합니다. 자기 핀셋은 자기장을 조절하는 데 사용되며, 자기 비드에 힘을 가하여 TRF 테더를 늘리고 이완시킴으로써 단백질-DNA 상호 작용을 조사할 수 있습니다.

단일 분자 기계 분석은 자기 핀셋 모터의 움직임을 제어하는 스크립트를 개발하여 설계되었습니다. 순서도는 자기 핀셋을 사용하여 단일 분자 분석을 위해 MatLab에서 이 스크립트를 생성하는 구조화된 접근 방식을 제공합니다(그림 4A). 자석은 0-25mm 범위 내에서 z축을 따라 이동합니다. 힘은 문헌⁵⁴에 설명된 방정식을 사용하여 자석 구성에 따라 자석 위치를 기반으로 계산됩니다. 특정 하중 하중 속도의 경우, 힘 램프 분석 예제(그림 4B-D)에서 볼 수 있듯이 원하는 힘 조작 프로파일을 달성하기 위해 MatLab에서 자석 위치와 이동 속도를 설계 및 프로그래밍합니다.

TRF1을 예로 들면, 우리는 단일분자 자기 핀셋을 이용한 텔로머 DNA-단백질 상호작용을 조사했습니다. 실험 설정은 그림 5A와 같이 force-ramp assay로 구성할 수 있으며, 여기서 힘-확장 곡선은 단백질-DNA 상호 작용의 끊어짐으로 인해 스트레칭 중에 지그재그 특징을 나타내고 이완 중 부드러운 흔적을 나타내며 단백질 매개 루프 없이 DNA 섬유를 반영합니다. 이 설정은 그림 5B,C와 같이 force-jump assay로 구성할 수도 있으며, 이를 통해 특정 힘에서 단백질-DNA 상호 작용의 지속 시간과 확장의 변화를 측정할 수 있습니다. 텔로머 DNA-단백질 복합체의 해리 역학은 이러한 측정에서 파생될 수 있습니다(그림 5D). 또한 DNA-단백질 복합체의 루프 형성은 확장의 변화에 의해 밝혀질 수 있습니다(그림 5E). 또한, 단백질 농도는 이 텔로머 DNA 실험 설정 내에서 적정할 수 있습니다. 또한, 인간 세포에서 추출한 텔로머 DNA의 길이 이질성을 통해 다양한 길이의 텔로미어에서 루프 형성 메커니즘을 조사할 수 있습니다(그림 6).

그림 1: TRF1/2의 발현 및 정제. (A) TRF1 및 TRF2의 도메인 아키텍처. (B) E. coli에서 TRF2를 발현하기 위한 pET28a-SUMO-TRF2의 플라스미드 맵. (C) 다양한 발현 및 정제 단계에서 얻은 샘플의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: IPTG에 의해 유도되지 않음. Lane 2: 세포 용해에 의해 얻어진 IPTG 유도 침전물. Lane 3: 세포 용해 후 얻은 IPTG 유도 상층액. 레인 4: Ni 기둥을 통한 흐름. 5열: 불순물 단백질을 제거하기 위해 저농도 이미다졸 완충액으로 세척합니다. 레인 6: 300mM 이미다졸을 함유한 완충액을 사용한 6xHis-SUMO-TRF2 용리. Lane 7: SUMO 프로테아제 효소에 의한 SUMO 태그의 분해. Lane 8: Ni 컬럼을 사용한 재정제 및 20mM 이미다졸을 함유한 완충액으로 TRF2(6xHis 및 SUMO 태그 제거) 용출. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: TRF(Terminal Restriction Fragments)의 준비. (A) 인간 세포에서 TRF를 제조하기 위한 흐름도. (B) 5개의 인간 세포주에 대해 1% 아가로스 겔을 사용한 게놈 DNA 무결성 검사. (C) 5개의 인간 세포주에 대해 Southern blotting으로 수행한 TRF 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: single-molecule mechanical assay의 준비. (A) single-molecule mechanical assay를 위한 플로우 셀의 준비를 보여주는 흐름도. (B) 자기 핀셋을 사용한 단일 분자 기계 분석의 개략적 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 단일 분자 기계적 분석의 설계. (A) force-ramp assay를 실행하기 위한 스크립트를 생성하기 위한 순서도. (B) z축을 따른 자석의 이동 프로파일. (C) 자석 움직임에 해당하는 힘 프로파일. (D) 자석 위치와 결과 힘 사이의 상관 관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 단일 분자 자기 핀셋으로 조사한 텔로머 DNA-단백질 상호 작용. (A) TRF1-텔로미어 상호 작용은 23°C에서 20mM HEPES(pH 7.5), 1mM EDTA 및 100mM NaCl을 포함하는 완충액의 force-ramp 분석(N = 10)에서 조사되었습니다. TRF1의 농도는 10nM이었고 힘 로딩 속도는 ±1pN/s였습니다. (B) TRF 테더는 힘-점프 분석에서 늘어나고 이완되었습니다. 적용된 힘 프로토콜은 Frest = 0 pN, Ftest = 2 pN - 8 pN, Fhigh = 10 pN 및 Fmax = 20 pN이었습니다. 완충액 및 온도 조건은 (A)와 동일하였다. 프레임 속도 = 200Hz. (C) TRF1-텔로미어 상호 작용은 TRF1 농도가 10nM인 force-jump 분석에서 조사되었습니다. (D) TRF1-텔로미어 복합체의 해리 역학. 테스트된 힘에서 해리 속도의 로그(평균 ± SD, n = 206)는 Kramer-Bell-Evans 모델(빨간색 곡선 및 범례 방정식)을 따릅니다. 삽입은 Ftest에서의 평균 해리 시간(<τ>)을 보여줍니다. (E) TRF1-텔로미어 복합체의 파열 사건에 따른 신장(ΔL) 변화의 분포. 검은색과 빨간색 곡선은 가우스 피팅을 나타냅니다. 이 그림은 Li et ^al.41의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 텔로미어에서 TRF1에 의해 형성된 DNA 루프의 수와 크기. (A) [TRF1] = 20nM에서 DNA 루프 크기(ΔL)의 텔로미어 길이 의존성. 곡선은 가우스 피팅을 나타냅니다. (B) [TRF1] = 40nM에서 ΔL의 텔로미어 길이 의존성. (C) ΔL과 텔로미어당 파열 사건 수 사이의 상관관계, N. 영차 상관 계수는 r = -0.20이고 p < 0.001(표본 크기 = 1496)입니다. (D) ΔL과 N 사이의 음의 상관 관계를 설명하는 가능한 메커니즘을 보여주는 만화로, TRF1이 1차 루프 도메인을 가진 단일 텔로미어를 고차원 토폴로지로 압축할 수 있음을 시사합니다. 이 그림은 Li et ^al.41의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 스크립트 생성을 위한 MatLab 코드.m 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 일정한 힘 assay.txt를 위한 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: 강제 램프 assay.txt에 대한 스크립트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 조리법 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 단일 분자 수준 57,58,59에서 TRF의 조작을 위해 자기 핀셋을 사용합니다. 우리는 게놈 DNA 단편에서 TRF를 분리하기 위해 자성 비드를 사용합니다. 제한 분해 후 TRF는 마그네틱 비드에 결합하여 게놈 DNA 단편에서 쉽게 분리할 수 있습니다. 이 접근 방식은 투명도 문제로 인해 제한되는 광학 핀셋과 달리 자기 비드를 효과적으로 잡을 수 있는 자기 핀셋을 사용하여 조작할 수 있습니다. 또한, AFM은 단일 분자 조작에 사용할 수 있지만 자성 비드에서 TRF를 해리하고 운모 표면과 캔틸레버 팁 사이에 고정시키기 위해 추가 단계가 필요합니다. 대조적으로, 자기 핀셋은 TRF의 단일 분자 조작을 위한 보다 간단하고 효율적인 방법을 제공하므로 이러한 추가 단계(⁴¹)의 필요성을 제거합니다.

단일 분자 조작은 온전한 TRF에 의존하기 때문에 게놈 DNA 및 TRF의 무결성을 유지하는 것이 중요합니다. 자기 핀셋을 사용하여 단백질-DNA 상호 작용을 조사하기 위해 TRF의 두 끝을 잡고 TRF를 늘리고 이완합니다. 마그네틱 비드에 대한 정확한 힘 측정은 단일 분자 기계 분석의 기본입니다⁵⁴. 따라서 입방체 모양의 자석은 자기 핀셋에서 카메라의 광 경로와 평행 또는 직각으로 정렬되어야 하며(아래 단계 4.3.3 참고) 확립된 방정식^54,60에 따라 정확한 3차원 비드 위치 기록을 보장해야 합니다. 자석 오프셋은 그들의 위치와 마그네틱 비드에 가해지는 결과적인 힘을 결정하는 데 중요합니다. 우리는 일관성을 위해 약 0.2 mm 두께의 #2 커버 유리를 사용하거나 다른 커버 유리(⁵⁴)에 대한 방정식의 오프셋을 조정합니다. 프레임 속도는 단백질-DNA 상호 작용의 역학을 캡처하는 데 매우 중요하며, 완전한 비드 이동 데이터를 위해 셔터 데드 타임을 0으로 설정해야 합니다. 스크립트로 인코딩된 모터 움직임은 단일 분자 기계 분석을 설계하는 데 핵심입니다. 하중 하중 속도, 하중 및 지속 시간과 같은 중요한 매개변수는 반복적으로 설정하고 최적화해야 합니다. 단일 분자 분석에 사용되는 단백질 농도는 단백질-DNA 상호 작용을 연구하기 위한 최적의 수준을 결정하기 위해 광범위한 적정이 필요합니다. 초기 힘 테스트는 힘 분광법과 함께 force-ramp assay를 사용하여 수행할 수 있으며, force-jump assay는 일정한 수준에서 관심 힘을 평가합니다.

이 프로토콜을 적용할 때 몇 가지 문제가 발생할 수 있습니다. TRF1 또는 TRF2가 대장균에서 발현되지 않는 경우 소규모 시험으로 시작하여 세포를 용해하고 SDS-PAGE 및 염색을 통해 단백질을 분석하고 태그 특이적 항체를 사용하여 Western Blot으로 확인합니다. 돌연변이, 프레임시프트 또는 조기 정지 코돈이 없는 올바른 클로닝을 보장하기 위해 구조체와 플라스미드를 검증하고 E. coli에 대한 promoter 적합성을 확인해야 합니다. 다양한 대장균 균주(예: BL21(DE3), Rosetta)를 테스트하고 성장 온도(15-25°C), 유도 시간(2-16시간) 및 IPTG 농도(0.1-1mM)를 조정하여 발현을 최적화해야 합니다. 포함 물체는 초음파 처리 전후의 세포 펠릿을 분석하여 처리해야 합니다. 희귀 tRNA를 제공하는 균주 또는 코돈 최적화를 통해 코돈 편향을 해결해야 합니다. 다양한 성장 매체(LB, TB, 자동 유도)를 시도하고 진탕 속도와 배양량을 조정하여 폭기를 개선하십시오. 독성 문제의 경우, 엄격하게 조절된 promoter 또는 low-copy-number vector를 사용하고 포도당(0.2%)을 첨가하여 leaky lac promoter 발현을 억제합니다. 적절한 항생제 선택으로 플라스미드 무결성을 유지하고 세포 용해 방법^61,62를 최적화하여 완전한 단백질 방출을 보장합니다.

단일 분자 분석에서 TRF 테더가 발견되지 않는 경우, 한 가지 가능성은 초기 게놈 DNA가 충분히 사용되지 않았다는 것입니다. TRF에 해당하는 500ng의 게놈 DNA를 사용하여 단일 분자 기계적 분석을 설정해 보십시오. 자기 핀셋에서 TRF 밧줄을 찾는 데 지속적인 문제가 발생하는 것은 게놈 DNA의 분해 시간이 과도하게 길기 때문일 수 있습니다. 별 활동을 피하기 위해 소화 절차를 12시간 미만으로 유지하십시오. 또한, 텔로머 DNA의 단일 가닥 돌출부에서 G-quadruplexes의 형성은 자성 비드에 결합하기 위한 비오틴 표지 올리고뉴클레오티드의 어닐링을 억제할 수 있습니다. 이를 방지하려면 칼륨 또는 나트륨 이온 농도를 1mM 미만으로 유지하여 G-4중 형성을 피하고 단일 분자 설정에서 TRF 테더를 형성할 가능성을 높입니다. 또한 어닐링 단계(단계 3.2.5) 동안 가열 온도를 높이면 G-쿼드러플렉스를 불안정하게 만들고 비오틴 표지 올리고뉴클레오티드와 TRF의 결합을 용이하게 합니다.

TRF1 또는 TRF2 단백질이 있는 경우, TRF DNA 테더는 텔로미어에 이러한 단백질의 결합 부위가 풍부하기 때문에 단단히 압축되고 자기 핀셋으로 늘리기가 너무 어려울 수 있습니다. 단백질 농도를 적정하면 단일 분자 기계 분석을 위한 최적의 수준을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 단백질-DNA 결합 친화도는 EMSA 또는 SPR 분석을 사용하여 해리 상수(K_d)를 측정하여 단일 분자 분석에 적합한 농도를 알릴 수 있습니다.

게놈 DNA에서 생성된 TRF의 제한된 양은 단일 분자 분석의 효율성을 저해할 수 있습니다. 결과적으로, 단일 분자 데이터를 수집하는 것은 인위적으로 합성된 텔로머 DNA 구조를 사용하는 것에 비해 시간이 더 오래 걸릴 수 있습니다. 그러나 인간 게놈에서 직접 추출한 텔로미어를 사용하면 일반적으로 박테리아 또는 PCR 방법에서 플라스미드에 의해 제조되는 인공 텔로미어 DNA가 제공할 수 없는 몇 가지 이점을 제공합니다. 한 가지 장점은 인간 TRF가 길이가 이질적이어서 단백질-DNA 상호 작용에서 텔로미어 길이 의존성을 검사할 수 있다는 것입니다. 대조적으로, 인공 텔로머 DNA는 일반적으로 길이가 균일하며 다양한 길이의 인공 텔로머 DNA를 생성하는 것은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 또한 인간 TRF에는 변형, 돌연변이 및 손상과 같은 자연 마커를 포함하여 세포의 원래 염기서열이 포함되어 있습니다. 이를 통해 생리학적 또는 병리학적 조건에서 단백질-DNA 상호 작용을 조사할 수 있으며, 이는 인공 텔로머 DNA로는 불가능합니다.

이 프로토콜은 단일 분자 수준의 텔로미어 생물학 분야 연구에 필수적이며 텔로미어 표적 약물 발견에 잠재적으로 도움이 될 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
안티-디곡시제닌	로슈	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS 카메라	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA 추출 솔루션	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc	Ea Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP 혼합물	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  비즈	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin 비즈
Dynabeads MyOne 비즈	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin 비즈
에탄올	Tianjin No.6 화학 시약 공장	1083
글리세롤	Beijing Hwrkchemical 공동. Ltd	SMG66258-1
이미다졸	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
이소프로판올	톈진 No.6 화학 시약 공장	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow 단편(3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	그래픽 프로그래밍 소프트웨어
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd(bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab(NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		분광 광도계
NdeI	New England Biolab(NEB)	R0111S
Ni NTA 구슬 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., Ltd	SA005025
니트로셀룰로오스 멤브레인	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
단백질 분해 효소 K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart 버퍼	뉴잉글랜드 Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
아세트산	나트륨 SERVA 전기영동 GmbH	2124902
스모 프로테아제	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M