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유전자 조작 Tet-On 스파이킹 HEK 세포에서 전기천공법으로 유도된 작용 전위 생성 변화 모니터링

DOI:

10.3791/67257

⸱

September 6th, 2024

 ,  , 
1Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

체외에서 흥분성 세포의 반응을 연구하기 위해 이 프로토콜은 유전적으로 조작된 tet-on 스파이킹 HEK 세포의 간단한 흥분성 세포 모델에 대한 전기천공으로 인한 활동 전위 생성의 변화와 관련 매개변수의 자동 추출을 통한 막관통 전압의 변화에 대한 광학 모니터링을 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 세포 및 근육 세포와 같은 흥분성 세포는 빠르게 부상하는 전기천공법 기반 치료의 주요 표적이 될 수 있습니다. 그러나 주요 표적이 아닌 치료법에서도 전기 펄스의 영향을 받을 수 있으며 이는 부작용을 유발할 수 있습니다. 따라서 흥분성 및 비흥분성 조직의 전기천공법 기반 처리를 최적화하기 위해서는 흥분성 세포, 이온 채널 및 흥분성에 대한 전기 펄스의 영향을 in vitro에서 연구할 필요가 있습니다. 이를 위해 유전자 조작 tet-on 스파이킹 HEK 세포의 간단한 흥분성 세포 모델에서 전기천공으로 인한 활동 전위 생성의 변화를 광학적으로 모니터링하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 형광 전위차 염료를 사용하여 형광 현미경으로 막관통 전압의 변화를 모니터링하고, MATLAB 응용 프로그램을 사용하여 세포 반응의 관련 파라미터를 자동으로 추출했습니다. 이러한 방식으로 서로 다른 전기 펄스에 대한 흥분성 세포 반응과 여기와 전기천공법 간의 상호 작용을 효율적으로 평가할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

electroporation에서 고전압 전기 펄스는 투과성이 좋지 않은 분자에 대한 원형질막 투과성을 증가시킵니다1. 전기천공법(Electroporation) 기반 기술은 요즘 의학2, 생명 공학3 및 식품 기술4 분야의 응용 분야에서 널리 사용되고 있습니다.

뉴런 세포(neuronal cell) 및 근육 세포(muscle cell)와 같은 흥분성 세포(excitable cell)는 심장, 뇌 및 골격근에서 빠르게 부상하는 전기천공법(electroporation) 기반 치료의 주요 표적 중 하나입니다5. 더욱이, 주요 표적이 아닌 치료법에서도 전기 펄스의 영향을 받을 수 있으며, 이는 통증, 근육 경련 및 신경 손상과 같은 부작용을 유발할 수 있습니다6. 즉, 전기 펄스는 흥분성 세포에 전기 자극을 유발할 수 있습니다: 전기 펄스는 전압 의존성 이온 채널을 활성화하고 활동 전위(AP)를 트리거합니다. 그러나 더 높은 전기장에서는 세포의 원형질막이 투과화되고 기공/결함을 통한 추가 이온 전류가 발생합니다7. 이 추가 이온 전류는 여기(excitation)와 전기천공(electroporation) 사이의 복잡한 상호 작용에서 세포 흥분성에 영향을 미칩니다. 따라서 흥분성 및 비흥분성 조직의 전기천공법 기반 처리를 최적화하기 위해서는 흥분성 세포, 이온 채널 및 흥분성에 대한 전기 펄스의 영향을 in vitro에서 연구할 필요가 있습니다.

최근 연구8에서는 Cohen 등이 개발한 유전자 조작 인간 배아 신장(HEK) 세포를 탐구했습니다.9,10 이는 흥분성 세포의 전기천공을 연구하기 위한 귀중한 도구입니다. 이러한 그렇지 않으면 흥분할 수 없는 세포에서 흥분성에 필요한 나트륨 및 칼륨 채널(NaV1.5 및 Kir2.1)의 최소 보체가 발현됩니다. 이러한 세포에서 Kir2.1의 발현은 두 가지 세포 변이체, 즉 흥분성 스파이킹 S-HEK(NaV1.5 및 Kir2.1 포함) 및 비흥분성 비스파이킹 NS-HEK 세포(NaV1.5 채널만 포함)의 확립을 허용하는 독시사이클린 유도 tet-on 시스템에 의해 제어됩니다. 이를 통해 동일한 유형의 세포의 흥분성 및 비흥분성 변형에 대한 전기 펄스의 효과를 비교할 수 있습니다. 분리된 1차 흥분성 세포, 배아 또는 유도 만능 줄기세포에서 분화된 흥분성 세포, 흥분성 조직에서 유래한 세포주와 비교했을 때, S-HEK 세포는 다루고, 배양하고, 증식하기 쉽고, 나트륨 및 칼륨 채널이 잘 정의되어 있으며, 강력한 AP를 생성한다는 등 여러 가지 장점이 있다8.

우리는 형광 전위차 염료를 사용하여 다양한 진폭의 전기 펄스에 의해 트리거되는 막횡단 전압(TMV)의 변화를 모니터링하기 위한 프로토콜을 설계했습니다. 이러한 방식으로 전기천공법이 S-HEK 세포의 AP 생성에 어떤 영향을 미치고 S-HEK 및 NS-HEK 세포 모두에서 TMV의 다른 변화에 영향을 미치는지 연구할 수 있습니다. 간단히 말해서, S-HEK 또는 NS-HEK 셀은 2분마다 단일 100μs 전기 펄스에 노출되며, 각 펄스 응용 분야에서 약 3초 동안 형광의 상대적 변화가 기록됩니다. 적용된 펄스는 전압이 증가하여 먼저 셀에서 AP를 트리거하고 더 높은 전기장에서 전기천공을 유발합니다. 펄스 적용 사이의 2분 간격은 연속 펄스의 가능한 누적 효과를 최소화하는 동시에 실험을 세포를 악화시키지 않을 만큼 충분히 짧게 유지하기 위해 선택되었습니다. 이미지 처리는 맞춤형 MATLAB 응용 프로그램으로 자동화되어 전위차 염료의 형광 반응의 관련 매개변수를 추출하여 S-HEK 및 NS-HEK 세포에서 TMV(AP 및 전기천공으로 인한 지속적인 탈분극)의 변화를 평가했습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 시약 준비 및 세포 배양

  1. Dulbecco의 Modified Eagle's Medium-high glucose에 10% 소 태아 혈청, 2mM 글루타민, 페니실린-스트렙토마이신(페니실린 100 U/mL, 스트렙토마이신 100 μg/mL), 2 μg/mL 푸로마이신, 5 μg/mL 블라스티시딘 및 200 μg/mL 게네티신을 보충하여 세포 배양 배지를 준비합니다.
  2. 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4 및 1.8mM KH2PO4, pH 7.4로 인산염 완충 식염수(PBS) 용액을 준비합니다. 0.22μm 공극 크기의 멸균 멤브레인 필터를 통해 필터링합니다.
  3. 2mM KCl, 125mM NaCl, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM HEPES, 30mM 포도당, pH 7.3으로 Tyrode 용액을 준비합니다. 0.5 mM KCl, 126.5 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 30 mM 포도당, pH 7.3으로 저칼륨 Tyrode 용액을 준비합니다. 0.22μm 공극 크기의 멸균 멤브레인 필터를 통해 두 용액을 모두 여과합니다.
  4. 5mg의 폴리-L-라이신이 들어 있는 바이알에 PBS 5mL를 첨가하여 1mg/mL 폴리-L-라이신 원액을 준비합니다.
  5. 증류수에 2mg/mL 독시사이클린 원액을 준비하고 0.22μm 공극 크기의 멸균 멤브레인 필터를 통해 여과합니다.
  6. 순수 에탄올에 4mM 전위차 염료 ElectroFluor630 원액을 준비합니다(100nM - 73μg의 염료가 포함된 튜브에 25μL의 순수 에탄올 추가).
  7. 앞서 설명한 바와 같이 6mL의 세포 배양 배지의 T25 플라스크에서 HEK 세포를 유전적으로 조작하여 배양했습니다8. 배양 배지의 성분은 빛에 민감합니다. 따라서 매체를 빛으로부터 보호하고(매체 플라스크를 알루미늄 호일로 감쌉니다) 저조도 조건에서 통과 태동을 수행합니다.
  8. 3 x 105 또는 5 x 105 세포를 새로운 T25 플라스크에 파종하여 3-4일마다 세포를 계대배양합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 마스터 플라스크의 세포는 지속적인 Kir2.1 발현을 허용하지 않기 때문에 독시사이클린이 첨가되지 않은 비흥분성 NS-HEK 세포로 유지합니다. 실험에서 14 미만의 계대에서 추출한 세포를 사용합니다.

2. 시료 준비

  1. 커버 유리 챔버 슬라이드의 Poly-L-lysine 코팅
    1. 2-well cover glass chamber slides의 1 well에 PBS 1 mL를 피펫팅하고, 10 μL의 멸균 1 mg/mL poly-L-lysine 용액을 첨가한 후 피펫과 잘 혼합합니다.
    2. 층류 후드에서 멸균 상태로 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다. 더 이상 세탁하지 않고 폴리-L-라이신이 함유된 PBS를 제거합니다.
  2. 세포 파종
    1. 1.5mL 튜브의 배양 배지에 1:10 희석된 독시사이클린 원액을 준비합니다. 각 웰에 대해 30μL의 1:10 독시사이클린 희석액(3μL의 독시사이클린 원액 및 27μL의 배양 배지)이 필요하며, 총 실험 웰 수에 따라 최종 부피를 준비합니다.
    2. T25 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 37°C에서 2분 동안 CO2 인큐베이터에서 2.5mL의 트립신-EDTA 용액으로 세포를 트립신화합니다.
    3. 2.5mL의 신선한 배양 배지를 추가하고 부드러운 피펫팅으로 표면에서 세포를 분리합니다. 세포 현탁액을 잘 혼합합니다.
    4. 혈구계(hemocyometer)로 세포를 계수하고 현탁액 세포의 밀도를 측정합니다.
    5. 배양을 확립하는 데 필요한 트립신화된 세포 현탁액의 부피를 계산합니다. 2일 배양의 경우 웰당 2.5 x 105 세포를 파종하고, 3일 배양의 경우 웰당 1 x 105 세포를 파종합니다. 필요한 경우 정확한 셀 수를 조정합니다.
    6. 1470 μL에서 이전에 계산된 세포 현탁액을 빼서 배양 배지의 부피를 계산합니다. 나머지 30μL는 1:10 독시사이클린 희석의 부피를 나타냅니다. 각 웰의 총 부피는 1500μL(세포, 독시사이클린 및 배양 배지)입니다.
    7. 흥분성 S-HEK 세포가 있는 시료를 준비하기 위해 계산된 부피의 배양 배지와 트립신화된 세포 현탁액을 하나의 웰에 피펫팅하고 30μL의 1:10 독시사이클린 희석액을 추가합니다. 실험에 오랜 시간(약 40분)이 걸리므로 2웰 챔버 중 하나의 웰만 사용하십시오. 챔버를 CO2 인큐베이터에 넣기 직전에 부드러운 피펫팅으로 잘 혼합합니다.
    8. non-excitable NS-HEK cell이 포함된 샘플을 준비하기 위해 계산된 부피의 배양 배지를 웰에 피펫팅하고 doxycycline이 없는 S-HEK 세포에 대해 계산된 세포 현탁액 부피의 90%를 추가합니다. NS-HEK 세포는 S-HEK 세포보다 약간 더 빨리 성장합니다.
    9. 실험 전 2-3일 동안 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 챔버를 배양합니다. 독시사이클린이 함유된 샘플의 경우, 이 배양 시간은 세포를 흥분시키기에 충분합니다.
  3. 세포에 라벨링
    1. 실험 전에 3μL의 전위차 염료 원료 용액을 1.5mL 튜브에 피펫팅하고 열린 튜브를 층류 후드에 넣어 실온에 두어 에탄올이 증발하고 전위차 염료가 건조될 수 있도록 합니다(약 15분). 997μL의 저온 배양 배지(4°C의 냉장고에서 추출)를 튜브에 추가하고 염료를 12μM의 최종 농도로 용해합니다.
    2. 웰에서 배양 배지를 제거하고 전위차 염료 용액 1mL를 세포에 추가합니다. 4 °C에서 냉장 보관하고 20 분 동안 배양하십시오.
    3. 전위차 염료 용액을 제거하고 추가 재사용을 위해 튜브에 보관합니다(1일에 최대 6개의 순차적 실험).
    4. Tyrode 용액으로 세포를 3x 부드럽게 씻고 마지막 세척 후 저칼륨 Tyrode 용액 1mL를 우물에 피펫으로 넣습니다.

3. Electrostimulation 및 electroporation

  1. 펄스 발생기를 트리거하는 현미경 시스템의 TTL 신호를 사용하여 이미지 획득과 펄스 전달의 동기화를 구성합니다. 고전압 펄스를 생성하려면, 맞춤형 펄스 발생기11 또는 TTL 신호로 외부에서 트리거할 수 있는 펄스 발생기를 사용하십시오.
    참고: 제시된 실험 구성에서 LAS X 소프트웨어는 이미지 획득에 사용되며, 타임랩스 획득 중에 미리 선택된 시간에 TTL 신호를 보내도록 구성할 수 있습니다.
  2. 챔버 바닥에 직경 0.8mm, 내부 가장자리 사이에 5mm 거리의 평행한 Pt/Ir 와이어 전극 2개를 놓고 챔버를 현미경 아래에 고정합니다.
  3. 전극을 펄스 발생기에 연결합니다. 전압 및 전류 프로브를 사용하여 펄스 발생기의 출력을 오실로스코프에 연결하면 실험 중에 펄스가 올바르게 전달되었는지 확인할 수 있습니다.
  4. 명시야에 있는 세포에 초점을 맞춥니다. 전극 사이의 대략 중간에 위치한 세포를 이미지화합니다.
  5. 40x 대물렌즈로 타임 랩스 모드에서 형광 이미지의 첫 번째 획득을 시작하여 전체 시야에서 형광 신호를 기록합니다. 카메라는 활동 전위의 명확한 시간 경과를 획득할 수 있을 만큼 충분히 빨라야 합니다(이상적으로는 25프레임/초 이상).
    1. 타임랩스 모드에서 최소 25프레임/초의 80개의 이미지를 획득하여 활동 전위의 실시간 과정을 해결합니다. 총 이미지 획득 시간은 약 3초입니다. 이미지 획득 중에 635nm의 excitation 파장, 10ms의 노출 시간으로 셀을 비추고 약 700nm에서 방출을 감지합니다. 이 첫 번째 획득에서는 펄스를 적용하지 마십시오 - 이 획득은 염료 광표백을 위한 후속 획득을 수정하는 데 사용됩니다. 이 획득 후 2분 동안 기다립니다.
      참고: 이 실험은 27.8 frames/s, 즉 36ms 기간을 사용하며, 이는 첫 번째 이미지 획득 시작부터 타임랩스 기록에서 다음 이미지 획득 시작까지의 시간입니다.
  6. 2분마다 3.5단계와 같은 방식으로 타임랩스를 기록합니다. 이러한 획득의 경우 10번째 이미지를 획득할 때(324ms에서) 단일 100μs 펄스를 적용합니다. 펄스 전압이 63V, 75V, 88V, 100V, 125V, 150V, 175V, 200V인 이미지를 획득합니다. 셀이 노출되는 전기장을 적용된 전압 대 전극 거리 비율(E = 126, 150, 176, 200, 250, 300, 350 및 400V/cm)로 추정합니다.
    알림: 더 낮은 전기장에서 펄스는 활동 전위를 트리거합니다. 더 높은 전기장에서는 전기천공을 유발하며, 이는 장기간의 탈분극으로 나타납니다. 각 세포 샘플에 대한 실험 시간은 약 40분(라벨링 20분, 현미경 20분)입니다.

4. 데이터 분석

  1. 타임랩스 녹화를 tiff 형식으로 내보냅니다.
  2. 개별 실험 중에 적용된 모든 전압의 타임랩스 기록을 배치합니다(하나의 세포 샘플)를 단일 폴더에 넣습니다. MATLAB 응용 프로그램에서 전기장 E를 인식할 수 있는 형식으로 타임랩스 기록의 이름을 바꿉니다: Vcm(예: 126V/cm의 경우 126Vcm). 이름의 나머지 부분은 임의로 지정할 수 있습니다. 펄스가 적용되지 않는 실험 시작 시 획득의 경우 000Vcm이라는 문구를 사용하여 이름을 바꿉니다. 타임랩스 녹화 이름의 예: 2022_1_20 1DOX 000Vcm, 2022_1_20 1DOX 126Vcm, 2022_1_20 1DOX 150Vcm 등
  3. 에서 다운로드할 수 있는 응용 프로그램을 엽니다.
    https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. 데이터 폴더 선택을 클릭하여 한 실험의 타임랩스 기록이 포함된 폴더를 선택합니다.
  4. 추가 데이터 분석에 사용할 픽셀을 선택합니다. 이렇게 하려면 두 개의 슬라이더를 사용하여 멤브레인의 선명한 이미지에 대한 낮은 임계값(자주색)과 분석에서 파편(형광이 높은 큰 점)을 제거하기 위한 높은 임계값(녹색)을 결정합니다.
  5. 데이터 분석을 선택합니다. 분석(Analysis) 탭에 추출된 매개변수가 있는 테이블이 나타납니다. 표의 오른쪽에는 사용된 각 E에 대해 시간에 따른 상대 형광 그래프가 나타납니다. 표 위의 왼쪽에 있는 드롭다운 메뉴에서 지정된 E에 대한 그래프를 선택합니다.
  6. 모든 그래프를 검사하고 거짓 피크 검출의 경우 수동 보정을 수행합니다. Analysis 탭의 아래쪽에 있는 Clear AUTO Peaks 를 선택하면 자동으로 감지된 피크가 지워집니다. 그래프 를 클릭하여 새로운 피크 시점을 수동으로 결정합니다.
  7. Analysis(분석) 탭의 하단에서 Rerun AUTO Peak Detection(자동 피크 검출 재실행 )을 선택하여 자동 피크 검출을 다시 수행합니다. 추출된 매개변수는 이제 새로운 피크로 조정됩니다.
  8. 분석 탭의 오른쪽 하단에 있는 데이터 내보내기 를 선택하여 사용된 각 E에 대해 .mat 파일, 스프레드시트 파일 및 PNG 이미지 형식으로 동일한 폴더로 데이터를 내보냅니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

전기 펄스에 의해 트리거된 체 외 흥분성 세포의 TMV 변화는 이 프로토콜을 사용하여 광학적으로 모니터링할 수 있으며, 형광 신호를 분석하여 관련 매개변수를 추출할 수 있습니다.

실험 설정은 그림 1A에 나와 있습니다. 실험에 사용되는 100μs 전기 펄스의 일반적인 신호는 그림 1B에 나와 있습니다. 현미경 아래에 배치된 챔버의 세포는 일반적으로 그림 1C (명시야 이미지) 및 그림 1D (형광 이미지)의 세포와 비슷합니다. 우리는 2분마다 전압이 증가하는 전기 펄스가 동일한 셀에 적용되는 실험을 수행합니다. 2분의 인터펄스 시간은 특히 눈에 띄는 전기천공법과 관련된 가장 높은 진폭의 펄스를 사용할 때 세포막의 완전한 재밀봉 및 복구를 허용하기에 충분히 길지 않을 수 있습니다. 따라서, 펄스의 일부 누적 효과를 기대할 수 있습니다. 이러한 누적 효과를 피하기 위해 인터펄스 지연을 연장할 수 있지만, 테스트된 펄스 진폭의 수를 줄이고 셀을 현미경에 너무 오래 유지하는 것을 방지할 수 있습니다.

실험에서 형광 이미지를 캡처한 후 사용자 지정 MATLAB 응용 프로그램으로 분석할 수 있습니다. 먼저 픽셀 임계값을 결정합니다(그림 2A). 낮은 임계값을 조정하면 세포 주변의 멤브레인에 대한 선명한 이미지(보라색)를 얻을 수 있고, 높은 임계값을 조정하면 파편 신호(녹색)를 제거할 수 있습니다. 그런 다음 애플리케이션은 전달된 각 연속 펄스에 대한 모든 임계값 픽셀의 평균 형광 강도를 측정하여 형광 F/F0의 상대적 변화에 대한 시간 종속 신호를 얻습니다. 이 신호는 펄스가 적용되지 않은 제어 타임 랩스 기록에서 결정된 F의 선형 감소의 기울기를 빼서 염료 광표백을 위해 보정됩니다(그림 2B). 신호를 보정한 후 응답의 매개변수는 인앱 테이블과 보정된 형광 신호의 그래프 형태로 추출됩니다(그림 2C). 드문 경우지만, 알고리즘이 명백한 피크를 감지하지 못하거나 스퓨리어스 잡음 신호를 거짓양성(false positive)으로 검출합니다. 이러한 경우, 사용자는 형광 신호의 해당 지점을 피크로 수동으로 선택하거나 감지된 거짓 피크를 제거할 수 있습니다(그림 2D - 전기 펄스가 적용되기 전에 비정상적으로 감지된 작은 피크의 제거).

MATLAB 응용 프로그램을 사용하면 여기 가능한 S-HEK(그림 3A) 및 비여기 NS-HEK 셀(그림 3B) 모두에서 전기 펄스에 대한 TMV 반응 이미지를 얻을 수 있습니다. 피크 수(NoPeaks), 평균 피크 간 시간(두 개 이상의 피크가 검출된 경우, MPPT), 최대 응답(MR), 첫 번째 피크까지의 시간(TtFP) 및 피크에서 25%, 50%, 75% 및 90% 회복까지의 시간(각각 T25, T50, T75, T90)과 같은 응답 매개변수가 추출됩니다. 이러한 매개변수를 통해 서로 다른 전기 펄스에 대한 반응을 평가할 수 있으며(예: 서로 다른 E의 전기 펄스에 의해 트리거된 피크 수 결정, 그림 3C) 여기와 전기천공법 간의 상호 작용을 평가할 수 있습니다.

figure-results-1
그림 1: 설정, 파형 및 S-HEK 셀. (A) 현미경 스테이지의 챔버 이미지. (B) 연구에 사용된 펄스의 파형의 예(시간 경과에 따른 전압(U)). (C, D) S-HEK 세포((C): 명시야, (D): 형광), 눈금 막대: 100μm의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 데이터 분석 애플리케이션. (A) 애플리케이션 인터페이스의 이미지 - 임계값. (B) 형광 변화의 원시 및 보정된 신호의 그래프. (C) 응용 프로그램 인터페이스의 이미지 - 추출된 데이터. (D) 피크 검출의 수동 보정(전기 펄스가 적용되기 전에 비정상적으로 감지된 작은 피크 제거, 빨간색 화살표로 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 대표적인 결과. (A, B) (A) 서로 다른 진폭의 100μs 전기 펄스를 가진 (A) 흥분성 S-HEK 및 (B) 비흥분성 NS-HEK에서 TMV의 변화를 유발하는 것은 대표적인 실험의 결과입니다. 명확성을 위해 적용된 펄스 시퀀스에서 선택한 펄스에 대한 응답만 표시됩니다. (C) 서로 다른 진폭의 100μs 펄스에 의해 트리거된 TMV 응답의 매개변수: 예는 피크 수를 보여줍니다. 결과는 평균 ± SE, 실험 횟수 : N = 13으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

색인E-강점
(V/cm)		피크 없음
(-)		MPPT (영문)
(밀리초)		씨
(-)		TTFP
(밀리초)		T25
(밀리초)		T50
(밀리초)		T75
(밀리초)		T90
(밀리초)
10
212692240.10436072108144180
315063540.09710872108144180
417621440.0893672108144180
520010.0750108144180252
625023960.06401082164322052
730010.059018011882448
835010.053010082340
940010.04701512

표 1: 서로 다른 진폭의 100μs 펄스에 의해 트리거되는 TMV 응답의 매개변수.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S-HEK 세포는 나트륨 및 칼륨 채널이 잘 정의된 단순한 흥분성 세포 모델로, NaV1.5 및 Kir2.19 입니다. 이를 통해 여기성 세포가 적용된 전기 펄스에 어떻게 반응하는지에 대한 심층적인 연구를 수행하고 S-HEK 세포에서 발현된 채널의 잘 알려진 이론적 특성을 기반으로 하는 수학적 모델을 기반으로 실험 데이터를 수학적 모델과 연결할 수 있습니다. 이전 연구8에서 우리는 E가 증가하는 100μs 펄스에 대한 이러한 세포의 반응을 실험적으로나 이론적으로 설명했습니다. E가 낮을수록 S-HEK 세포는 단일 또는 다중 활동 전위로 반응하는 반면, E가 높을수록 AP가 연장되어 지속적인 탈분극으로 변환됩니다. 지속적인 탈분극은 이러한 세포의 비흥분성 버전(NS-HEK)에서도 명확하게 볼 수 있기 때문에 전기천공법 및 이와 관련된 비선택적 이온 전류의 증가에 기인합니다.

형광 전위차 염료의 사용은 흥분성 세포에서 AP 및 전기천공을 연구하는 매우 효과적인 방법임이 입증되었습니다. 패치 클램프와 같은 고전적인 전기 생리학적 방법과 비교할 때 광학 측정은 훨씬 더 편리하고 시간 효율적이며 특별한 기술이 필요하지 않습니다. 또한, 고전압 전기 펄스의 사용은 측정을 방해하지 않으며, 이는 패치 클램프 측정12에서 문제가 될 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜의 주요 단점은 염료의 특성과 관련이 있습니다. 광표백으로 인해 캡처된 형광 신호는 보정이 필요합니다. 염료는 자발적으로 세포 속으로 확산되므로 막의 신호는 시간이 지남에 따라 감소합니다. 이러한 이유로 염료는 TMV의 활동 전위 및 기타 단기 변화를 모니터링하는 데 적합합니다(이 실험에서는 ~3초). 염료는 비율계량적 이미징(ratiometric imaging)13을 가능하게 하기 때문에, 이러한 이미징은 염료 확산에 대한 몇 가지 문제를 피할 수 있지만, 달성 가능한 이미징 속도를 낮추는 대가를 치르게 된다. 이 실험 구성에서 비율계량적 이미징은 활동 전위의 모양을 올바르게 캡처하기에는 너무 느립니다. 또한, 염료 형광의 측정된 변화는 TMV의 변화에 대한 정성적 정보를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 염료를 보정하여 정량적 측정이 가능하도록 할 수 있습니다.

맞춤형 MATLAB 응용 프로그램을 사용한 자동화된 이미지 분석을 통해 많은 양의 데이터를 분석하고 단기간에 TMV 반응의 중요한 특성을 효율적으로 추출할 수 있습니다. 이 응용 프로그램은 시야에 있는 모든 세포의 멤브레인에서 형광 신호를 캡처하도록 구성되어 있습니다. 이것은 신호 대 잡음비를 개선하지만 TMV가 개별 세포 수준에서 어떻게 변화하는지에 대한 정보를 잃게 됩니다. 주어진 실험 구성에서 개별 세포의 신호에 노이즈가 너무 커서 유용한 측정이 불가능했습니다. 더욱이, 인접한 세포의 막은 구별하기가 어려웠다. 그럼에도 불구하고 HEK 셀은 전기적으로 연결된 간극연접을 내인성으로 발현합니다. 이전 연구8에서 제시된 수학적 모델링은 전기적 연결로 인해 시야 내의 셀이 AP를 동시에 트리거할 수 있을 만큼 충분히 가깝다는 것을 보여주었습니다. 또한, AP는 세포 단층을 따라 고속으로 증식됩니다(약 34mm/s, 5x 대물렌즈 배율의 이미징을 기반으로 추정)8,9. 시야의 측면 길이(~0.33mm)를 고려할 때 AP는 이 길이를 약 10ms 내에 이동하며, 이는 이미지 획득 기간보다 짧습니다. 따라서 AP 전파 효과는 이 배율 및 기록 속도로 볼 수 없습니다. 그럼에도 불구하고 전극에서 시야로 AP가 전파되면 적용된 펄스와 캡처된 AP8 사이에 지연이 발생할 수 있습니다.

이전 연구8과 이 간행물에서는 100μs 지속 시간의 펄스가 여기성과 전기천공법 사이의 상호 작용에 미치는 영향에 대해 설명합니다. 그러나 이 프로토콜은 다른 매개변수(다른 기간, 전압, 수, 반복률 또는 모양) 또는 다른 흥분성 세포를 가진 전기 펄스를 연구하는 데 적용할 수 있습니다.

Disclosures

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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이 작업은 슬로베니아 연구 혁신국(ARIS)의 연구 프로그램 P2-0249, 인프라 프로그램 I0-0022 및 연구 프로젝트 J2-2503의 지원을 받았습니다. 이 연구는 ARIS와 류블랴나 대학교(University of Ljubljana)가 스타트업 연구 프로그램에 대한 자금 지원을 통해 부분적으로 지원했습니다. 이 작업은 MN-0023 프로젝트 내에서 NextGenerationEU 및 NOO 자금 지원을 통해 유럽 연합과 ARIS의 일부 지원을 받았습니다. 이 작업은 ERC Starting Grant(No. 101115323 - REINCARNATION)와 Marie Skłodowska-Curie 펠로우십(No. 893077 - EPmIC)을 통해 유럽 연합의 일부 지원을 받았습니다. 그러나 표현된 견해와 의견은 저자의 견해일 뿐이며 반드시 유럽 연합 또는 유럽 연구 위원회의 견해와 의견을 반영하는 것은 아닙니다. 유럽 연합이나 부여 기관은 이에 대해 책임을 지지 않습니다. 저자는 텟온 스파이킹 HEK 세포를 친절하게 제공해 준 하버드 대학의 Adam E. Cohen 그룹과 세포 배양 실험실에서 도움을 준 Duša Hodžić 그룹에 감사드립니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL 튜브Ratiolab 5615000
2-well Nunc Lab-Tek II 챔버 #1.5 독일 커버글라스 시스템Thermo Fisher Scientific 
ADP305 차동 전압 프로브Teledyne LeCroy
AP015 전류 프로브Teledyne LeCroy
Blasticidin 써모 피셔 사이언티픽 
CO2 인큐베이터 PHCbi MCO -230AICUV
독시사이클린 시그마-알드리치/머크D9891
둘베코 s 모디피드 이글' s 중간 고포도당 성장 매체Sigma-Aldrich/MerckD5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ(F)PTEA)potentiometric probes31795
Fetal bovine serumSigma-Aldrich/MerckF2442
GeneticinThermo Fisher Scientific 
글루타민시그마-알드리치/머크G7513
층류 후드Ikra Pio MC 15-2
MATLABMathworks
페니실린– 스트렙토마이신시그마-알드리치/머크P07681
폴리-L-라이신 하이드로브로마이드 시그마-알드리치/머크P9155-5MG   
펄스 발생기 맞춤 제작참조 참조11
PuromycinThermo Fisher Scientific 
T25 25cm² 조직 배양 플라스크TPP 90026
Tet-on 스파이킹 HEK 세포American Type Culture Collection ATCCCRL-3479
Thunder Imager Live Cell system for fluorescence microscopyLeica Microsystems 
트립신-EDTA 솔루션Sigma-Aldrich/MerckT3924
WavePro 7300A 오실로스코프Teledyne LeCroy
155379A111390310131035A1113803

References

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