방법 논문

IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종의 외식 배양을 위한 프로토콜

DOI:

10.3791/67260

⸱

2025년 5월 9일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Génomique Fonctionnelle, Université de Montpellier, CNRS, INSERM, 2Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of Chongqing, 3Department of Neurosurgery, Gui de Chauliac Hospital, Montpellier University Medical Center, 4Jingfeng laboratories of Chongqing

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종은 배양이 어려운 희귀 종양입니다. IDH1 돌연변이 단백질 발현을 보존하고 수개월 동안 배양을 유지하는 간단한 비효소 외식 방법을 소개합니다. 중요한 것은 이 기술이 동결 보존된 종양에 작용하여 신경교종 연구에 귀중한 자원을 제공한다는 것입니다.

초록

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가장 흔한 원발성 뇌종양인 미만성 신경교종은 조직병리학적 기준과 유전적 돌연변이에 따라 낮은 등급과 높은 등급으로 분류됩니다. 미만성 저등급 신경교종은 하위 집합을 구성하며, 주로 젊은 성인을 괴롭히고 높은 등급의 신경교종에 걸리기 쉽습니다. 미만성 저등급 신경교종에는 성상세포종(astrocytomas)과 희소돌기아교종(oligodendrogliomas)의 두 가지 주요 유형이 있으며, 각각 뚜렷한 유전적 및 조직학적 특징에 의해 정의됩니다. 이러한 종양은 특징적으로 대사 효소 IDH1의 돌연변이 변이를 보여 세포 분화를 방해합니다. 이들은 이질성이며, 증식성 줄기세포와 더 분화되고 정지된 신경교세포를 모두 포함합니다.

환자 특이적인 체외 종양 모델은 발암 메커니즘을 밝히고 맞춤형 치료를 위한 약물 선택을 맞춤화할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 IDH1 돌연변이 저등급 신경교종에 특화된 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델이 없기 때문에 기초 및 중개 연구에 차질이 빚어지고 있습니다. 여기에서는 효소 해리 없이 IDH1 돌연변이 종양을 정의된 배지에서 외식식물로 배양하는 간단한 방법을 제시합니다. 이러한 외식은 IDH1 돌연변이 단백질 발현뿐만 아니라 ASCL1(MASH1), OLIG1 및 OLIG2와 같은 희소돌기아교세포 전구 세포 및 성상세포(GFAP, SOX9)에 대한 마커를 유지하면서 장기간 지속될 수 있습니다. 또한 DMSO의 동결된 종양에서도 확립할 수 있습니다. 이러한 배양은 약물 스크리닝, 비디오 현미경 검사 및 유전자 연구를 위한 귀중한 플랫폼 역할을 할 수 있으므로 이러한 까다로운 종양을 이해하고 치료하는 데 있어 발전을 촉진할 수 있습니다. 또한 IDH1 돌연변이 세포주를 유도할 수 있는 잠재력을 제공합니다.

서론

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미만성 신경교종은 가장 흔한 원발성 뇌종양입니다. 이 종양은 매우 강도 높은 치료(수술, 방사선 및 화학 요법)에도 불구하고 현재 치료가 불가능합니다.1. 신경교종 형성이 뇌에 거주하는 성체 줄기 또는 신경교전구세포에서 유래한다는 가설을 뒷받침하는 증거가 증가하고 있습니다2. 교모세포종이 가장 공격적인 유형이지만, 미만성 저등급 신경교종(DLGG, 2등급 종양)도 널리 퍼져 있습니다(미만성 신경교종의 15%)1,3. DLGG는 천천히 성장하고 백질 관을 따라 이동하는데, 이는 이 '확산' 신생물의 특징4입니다. 이러한 DLGG는 치료에도 불구하고 재발하는 경우가 매우 많아 결국 높은 등급의 악성 종양(3등급 및 4등급)으로 진행됩니다5.

DLGG는 isocitrate dehydrogenase 1 또는 2 유전자(IDH1 또는 IDH2)의 missense 돌연변이를 특징으로 하며, 이로 인해 온코메타볼라이트 2-하이드록시글루타레이트(2HG)가 비정상적으로 생성됩니다. 이것은 후성유전학적 장애를 통해 세포 분화를 방해합니다.regulations6. IDH1 돌연변이 신경교종은 더 아형으로 분류됩니다: 성상세포종은 일반적으로 ATRX 및 P53에 돌연변이가 있는 반면, 희소돌기아교종은 1p19q deletions7을 특징으로 합니다. 이러한 종양은 종양 세포의 이질성을 나타냅니다. 단세포 RNA 염기서열분석 및 면역 분석은 이러한 종양 내에서 줄기세포 유사, 성상세포 유사 및 희소돌기아교세포 유사 표현형을 나타내는 다양한 종양 세포 집단을 밝혀냈습니다8,9.

쉽게 구할 수 있는 장기 배양 및 세포주의 이점을 누리는 교모세포종과 달리, IDH1 돌연변이 종양을 조사하기 위해 맞춤화된 세포 도구가 현저히 부족합니다1. 이는 치료제 개발을 진전시키고 IDH1 돌연변이 신경교종 형성 및 질병 진행에 대한 이해를 심화하는 데 중요한 장애물이 됩니다. 전통적인 혈청 성장 세포주는 오랫동안 사용되었지만 원래 종양을 부적절하게 복제하여 변형된 전사 프로파일을 나타냅니다. 또는 2D 또는 3D 종양체 모델에 관계없이 무혈청 배양 조건은 종양 세포의 전사 프로필과 생체 내 표현형(예: 정상 뇌 조직으로의 침입)을 보다 효과적으로 보존합니다10,11.

또한 환자의 수술 표본에서 파생된 단기 세포 배양은 종양의 분자 프로필과 세포 다양성을 보존하므로 세포주에 비해 종양의 생물학적 특성을 더 잘 나타낼 수 있습니다12. 본 연구에서는 신경교종 연구 및 치료제 개발을 위한 개선된 in vitro model의 필요성을 해결하기 위해 IDH1 돌연변이 미만성 저등급 신경교종 배양을 신선 또는 냉동 환자 절제술에서 유래한 외식식물로 배양하는 간단한 비효소적 방법을 소개합니다. 또한 IDH1 돌연변이 세포주를 유도할 수 있는 잠재력을 제공합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜에 사용된 종양 조각은 환자의 동의하에 잘 특성화되고 윤리적으로 승인된 수집품에서 얻은 것입니다. 이 연구는 Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (프로젝트 번호. RECH/P722/1-5)를 개발했으며, 2023년 8월 28일 종양바이오뱅크(tumor biobank)의 과학위원회(Scientific Council)에서 승인되었다.

1. 배양 플레이트의 준비

참고: 멸균 조직 배양 층류 후드 아래에서 다음 단계를 수행합니다.

  1. 배양 최소 1시간 전에 폴리-D-라이신(PDL) 및 라미닌 코팅된 24웰 플레이트를 준비합니다.
    1. 100mL의 붕산염 완충액(pH 8.4)에 10mg의 PDL 분말을 희석하여 최종 농도 100μg/mL를 만듭니다. 용해되면 용액(0.22μm)을 여과하여 멸균 상태를 확인합니다. PDL을 사용할 준비가 되었습니다. 3mL의 부분 표본을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
    2. 겔 형성을 방지하기 위해 1-2 mg/mL 라미닌 튜브를 4 °C에서 해동합니다. 50 μL 분취량을 준비하고 -20 °C에서 보관합니다.
      알림: 해동과 동결을 반복하는 것은 피해야 합니다.
    3. 플레이트 코팅
      1. 선택 단계: 세포 배양 접시에 적합한 멸균 커버슬립 Ø, 13mm를 웰당 하나의 커버슬립인 24웰 플레이트에 넣습니다.
        참고: 이 단계는 신경교종 외식종의 추가 면역 염색을 위한 것입니다.
      2. 웰 코팅을 위해 3mL의 PDL 용액을 9mL의 1x PBS에 혼합하고 50μL의 라미닌을 첨가합니다. 이 용액 500 μL를 각 웰에 추가하여 1-2 μg/cm² 코팅 농도를 만듭니다. 코팅된 플레이트를 실온에서, 가급적이면 느린 흔들림(15 RPM)으로 최소 1시간 동안 배양합니다.
      3. 배양 직전에 PDL-라미닌 용액을 제거하고 멸균 1x PBS로 두 번 헹굽니다.
        알림: 우물이 마르지 않도록 하십시오.

2. 미디어

  1. 배양 IDH1-돌연변이는 비타민 A가 없는 N2 및 B27로 구성된 혈청 대체 혼합물과 함께 L-글루타민이 보충된 DMEM/F12로 구성된 정의된 배지에 이식합니다.박테리아 및 곰팡이 오염을 방지하기 위해 시프로플록사신, 겐타마이신 및 곰팡이를 포함한 항생제를 사용합니다. 또한 성장 인자 헤파린, EGF 및 FGF2를 배지에 통합하고 여과(0.2μm)한 다음 4°C에서 최대 2주 동안 보관합니다.
    알림: 미디어 성분 및 준비에 대한 자세한 내용은 표 1 및 재료 표를 참조하십시오.

3. 외식 준비

  1. 검체 처리 전에 그림 1A에 표시된 대로 작업 공간과 멸균 도구를 준비합니다. 쿨 팩에 70% 에탄올을 뿌려 소독하십시오. 가위와 집게를 70% 에탄올에 담그고 PBS로 헹궈 살균합니다.
  2. 이상적으로는 수술 적출 후 2시간 이내에 얼음 배양을 위해 종양 절제술을 즉시 이송합니다(그림 1B).
    참고: 종양 샘플은 더 나은 결과를 보장하기 위해 최소 9-10mm의 직경을 가져야 합니다. 조직은 배양 배지 없이 운반되는데, 이 방법은 조직학적 목적으로 선호되기 때문입니다. 액체가 없으면 급속 냉동 중에 얼음 결정이 형성되는 것을 방지하여 필요한 경우 후속 조직학적 검사를 위해 조직의 무결성을 보존
    3. 할 수 있습니다.
  3. 종양 표본과 함께 배양 접시를 쿨 팩 위에 놓고 1X PBS로 부드럽게 헹구어 과도한 혈액을 제거합니다.
  4. 절제된 종양은 종양 덩어리, 침윤된 조직 및 비종양 구성 요소로 구성된 상당한 크기와 이질성을 나타내는 경우가 많습니다(그림 1C). 종양 세포를 더 많이 포함하는 경향이 있으므로 종양 세포 격리를 위해 부드럽거나 젤리 같은 질감의 회색을 표시하는 부분을 선택하십시오. 반대로, 단단하고 하얀 영역은 배양에 적합한 종양 세포가 더 적을 수 있으며(그림 1D) 검게 변한 영역은 전기 소작의 결과일 가능성이 높고 분석을 위한 신뢰할 수 있는 결과를 제공하지 못할 수 있으므로 피하십시오.
  5. 선택한 샘플을 다지기를 위해 1.5mL 마이크로튜브 또는 cryovial로 옮깁니다. 1.5mL 마이크로튜브 또는 cryovial에 1mL의 멸균 매체를 추가하고 작은 조각(1-2mm3)이 얻어질 때까지 멸균 가위로 샘플을 자릅니다.
    알림: 일반적으로 1-2mm1mm 크기의 작은 조각을 얻으려면 약 2-2분 동안 다지는 것이 필요합니다(그림 1E).
  6. 멸균 가위를 사용하여 파란색 1,000μL 피펫 팁의 끝을 조심스럽게 다듬어 직경이 약 3-4mm인 넓은 구멍을 만듭니다. 이 변형된 팁을 사용하여 다진 조직 조각을 50-200μL로 피펫팅하고 각 웰에 고르게 분포시킵니다. 더 작은 조각은 빠르게 침전되는 경향이 있기 때문에 균일한 분포를 보장하기 위해 각 웰에서 현탁액을 부드럽게 재균질화합니다.
    참고: 각 웰에 과도한 수의 단편을 도입하지 않음으로써 과밀을 피하고 균형을 유지합니다(그림 1F).
  7. 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 100% 습도의 종양 조각을 배양합니다. 종양의 대사 활동(배지의 급격한 황변으로 표시됨)과 각 웰의 단편 수에 필요한 경우 매일 배지를 교체하십시오. 배지를 교체하는 동안 200μL 팁이 장착된 피펫을 사용하여 배지를 섬세하게 흡인하여 부착된 종양 조각을 방해하지 않도록 주의하십시오.

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그림 1: 종양 이식 배양 절차. WHO 2021 분류에 따라 II등급 성상세포종 진단을 받은 44세 환자로부터 미만성 저등급 신경교종 절제술을 받았습니다. 종양은 ATRX 염색이 없는 것과 함께 IDH1 돌연변이(Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His) 및 TP53 돌연변이(Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis)를 보였습니다. TERT 유전자의 Ets/TCF 결합 부위(C250T 및 C228T)에서는 돌연변이가 검출되지 않았습니다. (A) 작업 표면은 냉각 팩으로 구성되어 샘플 분해를 최소화하고 생물학적 구성 요소의 생존력을 유지하는 환경을 제공합니다. 이러한 예방 조치는 조직의 품질과 무결성을 유지하는 데 중요합니다. (B) 병원에서 실험실로의 샘플 운송은 얼음 위에서 이루어져야 합니다. (C) 종양 절제 절제 단편. 화살표는 문화에 가장 적합한 부분을 보여줍니다. (D) 다지기를 할 가장 관련성이 높은 부분을 선택하기 위해 종양 절개를 수행합니다. 우리의 경험에 따르면 백질은 일반적으로 성공적인 외식을 생성할 가능성이 적습니다. (E) 가위로 기계적으로 다진 후 15mL 튜브에 약 1-2mm³ 직경의 종양 조각. (F) 적절한 파종에 필요한 종양 조각의 수는 24웰 플레이트의 웰에 대해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 다진 종양 동결 보존 및 해동

참고: 냉동 보존은 오염 및 외식 배양 손실의 경우 또는 나중에 종양 샘플을 처리할 수 있도록 백업을 보장합니다.

  1. 동결 보존: 8mL의 세포 배양 배지에 2mL의 DMSO를 첨가하여 동결 배지(20% v/v DMSO 용액)를 준비합니다.
  2. 다진 종양 현탁액 1부피와 동일한 부피의 20% DMSO 동결 배지를 결합하여 10% DMSO의 최종 농도를 달성합니다. 혼합물을 위아래로 조심스럽게 피펫팅하여 철저하게 혼합한 다음 약 1mL를 cryovials에 분주합니다.
  3. 점진적인 온도 감소를 위해 극저온 용기에 극저온 용기를 빠르게 옮긴 다음 액체 질소에 최종 보관하기 전에 -80°C에서 하룻밤 배양합니다.
    참고: DMSO와 같은 특정 동결 보호제는 세포가 실온에서 필요한 것보다 더 오래 노출되면 해로울 수 있으므로 세포를 동결 매체에 넣은 직후에 이 단계를 수행해야 합니다.
  4. 해동: 액체 질소에서 냉동 물질을 제거하고 세포의 약 80%가 해동될 때까지 즉시 37°C 수조에 넣습니다.
  5. DMSO를 제거하려면 5mL의 예열된 1x PBS가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브에 현탁액을 빠르게 피펫팅하고 300×g에서 5분 동안 원심분리합니다.
  6. 상층액을 제거하고 1X PBS로 세척한 후 원심분리를 반복합니다(4.5단계). 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 상층액을 흡입하고 적절한 양의 배지를 추가하여 사전 코팅된 PDL-Laminin 24-well 플레이트에 전달하고 인큐베이터에 넣습니다.
  7. 24시간 후에 셀이 연결되었는지 확인합니다. 며칠 후 배양 배지를 교체하여 부착되지 않은 단편을 제거합니다.

5. 문화의 통과

참고: 일단 확립되면 외식은 비디오 현미경 검사 또는 면역 염색에 사용할 수 있습니다. 또는, 종양 세포가 외래 세포로 이동하여 건강해 보이는 경우, 효소 해리를 통해 외식을 통과시키고 추가 실험을 위해 웰에서 다시 파종할 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜은 반복적인 통과를 위해 설계되지 않았다는 점에 유의해야 합니다. 일반적으로 종양 세포가 노화되거나 사멸하기 전에 단일 계대만 시도할 수 있습니다. 모든 외식 배양이 성공적인 통과로 이어지는 것은 아닙니다.

  1. 통과시키려면 오래된 배지를 제거하고 1X PBS로 헹구고 웰에 (125 μL) 0.05% 트립신-EDTA를 추가하고 37°C에서 3-4분 동안 배양한 다음 6.5 μL의 트립신 억제제, 12 μL의 20 mM CaCl2(2mM로 최종 희석) 및 1 μL의 DNAse I.
    를 추가합니다. 참고: 해리에 필요한 배양 시간은 배양에 따라 다를 수 있습니다. 최소 3분 후에 셀이 분리되었는지 확인하는 것이 중요합니다. 일반적으로 외식은 단일 세포 현탁액으로 완전히 해리되지 않을 수 있으며 작은 클러스터가 유지되는 경우가 많아 새로운 외식 배양이 생성될 수 있습니다.
  2. p1000을 500-600 μL로 설정하고 부드럽게 플러시하여 외식식물을 분해합니다. 거품 형성을 피하십시오.
  3. 1x PBS 5mL를 넣고 300g에서 5분 동안 원심분리×. 상층액을 흡인하고, 미리 예열된 신선한 배지에 펠릿을 재현탁하고, 파종을 위해 계산합니다.
  4. 위상차 현미경으로 분열하는 세포를 관찰하여 세포주를 생성할 가능성이 있는 배양물을 식별합니다. 이러한 분열 세포는 일반적으로 그림 2A에서 볼 수 있듯이 둥근 형태와 눈에 보이는 염색체를 가지고 있습니다.

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결과

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며칠 후 일부 종양 조각이 웰 표면에 부착되어 외식에서 세포의 성장을 시작합니다. 초기 도금과 종양 성장 세포의 출현 사이의 시간은 샘플마다 다릅니다. 초기 배양에는 종종 상당한 세포 파편이 포함되어 있어 생존 가능한 세포의 존재를 평가하기 어렵습니다. 따라서 배양은 최소 4주 동안 유지되어야 합니다. 세포가 성장하기 시작하면 양극성 또는 다극성 모양을 가진 길쭉한 세포가 관찰됩니다(그림 2B,C).

냉동 보존된 다진 종양을 해동할 때 외식 배양의 성공률이 약간 감소할 수 있습니다. 냉동 보존의 영향을 정확하게 정량화하지는 않았지만 성공률의 감소는 미미한 것으로 보입니다. 그림 2D에 나타난 세 가지 사례에서 알 수 있듯이 새로운 종양에서 유래한 세포와 동결 보존된 종양에서 유래한 세포 간의 세포 형태에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다. ...

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토론

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IDH1 돌연변이 저등급 신경아교종에 대한 시험관 내 및 전임상 모델을 개발하는 것은 이러한 종양의 느린 성장과 IDH 돌연변이로 인한 광범위한 게놈 및 후성유전체 변형을 복제하는 복잡성으로 인해 특히 어렵습니다. 더욱이, 이러한 침윤성 종양 세포는 면역, 내피, 신경교 및 신경 세포를 포함한 주변 세포와 적극적으로 상호 작용하여 잠재적으로 생존을 위해 이에 의존합니다. 이러한 복잡한 상호 작용은 실험실 환경에서 복제하기 어렵습니다.

IDH1 돌연변이 저등급 신경아교종에 대한 새로운 생물학적 통찰력을 발견하고 혁신적인 치료법 개발을 발전시키려면 인간 질병의 복잡성을 충실하게 복제하는 모델을 확립하는 것이 필수적입니다. 교모세포종과 같은 고급 신경아교종과 비교할 때 현재 IDH 돌연변이 신경아교종에 사용할 수 있는 시험관 내 모델은 상대적으로 적습니다. 대부분의 IDH1 돌연변이 세포주는 역형성 핍지교종(예: BT260 및 BT237)과 같은 고급 신경아교종에서 파...

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공개 사항

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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여기에 사용된 종양 조각은 몽펠리에 대학 병원(CRB@chu-montpellier.fr)의 생물 자원 센터에서 관리하는 신선한 조직 샘플의 신경학 컬렉션의 일부입니다. 이 연구는 J. P. Hugnot 교수(프로젝트 번호. RECH/P722/1-5). 이 연구는 La ligue contre le cancer, ARC(Association for Cancer Research), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA의 지원을 받았습니다. K.A.C는 멕시코 국립인문과학기술위원회(CONAHCYT)와 프랑스 뇌종양연구협회(ARTC)의 지원을 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Anti-ASCL1BD Pharmingen™556604 희석 1:500
Anti-ATRXSigma-AldrichHPA001906희석 1:100
Anti-CD68AgilentM081401-2희석 1:500
Anti-GFAPAves LabsAB_2313547희석 1:500
Anti-IBA1Fujifilm Wako 항체019-19741Dilituion 1:1000
Anti-IDH1 (R132H) 마우스 단클론 항체DianovaDIA-H09
Anti-Ki67BD Pharmingen™556003딜리투이온 1:1000
안티 올리그1R& D 시스템®AF2417Dulituion 1:300
Anti-OLIG2Sigma-AldrichMABN50희석 1:250
Anti-SOX9Abcam®EPR14335-78희석 1:100
B-27 보충제 (50개), 비타민 A 뺀값 Thermo Fisher Scientific12587010
소 혈청 알부민 (BSA)CiteAbA-421-100
Ciprofloxacin HClSigma-AldrichPHR1044-1G
CoolCellCorning®432000세포 동결 용기, 12 x 1 mL 또는 2 mL 극저온 바이알용
커버 슬립 Ø, 13 mmKarl Hecht™ 보조&거래;
디메틸 설폭사이드 (DMSO)시그마-알드리치D8418
DMEM/F-12, 글루타민 없음Thermo Fisher Scientific21331020
DNAse I시그마-알드리치10104159001
둘베코&프라임; s 인산염 완충 식염수(PBS) 1xSigma-AldrichD8537
Falcon 100mm TC 처리 세포 배양 접시Corning®
Falcon 24-웰 클리어 플랫 바텀Corning®353047TC 처리된 멀티웰 세포 배양 플레이트, 뚜껑 포함, 멸균 
FunginInvivoGenant-fn-1
GentamicinThermo Fisher Scientific15750-037
HeparinSigma-AldrichH3149-100KU
HEPESSigma-AldrichH-3375
Human EGFPeproTechAF-100-15-1MG
Human FGF-basicPeproTech100-18B-1MG
LamininSigma-AldrichL2020
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030-024
N-2 보충제 (100x)Thermo Fisher Scientific17502-048
PDLSigma-AldrichP7886
Serum acrodisc 37 mm 주사기 필터 GF/0.2 µ m SuporPALL Corporation4525
트립신 억제제Thermo Fisher Scientific17075-029
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드Thermo Fisher Scientific25300054
Zeiss Z1 Apotome 3 현미경Zeiss직선 광시야 형광 현미경
328017353003

참고문헌

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