방법 논문

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules after Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy(생체 내 현미경을 통한 장간막 허혈-재관류 손상 후 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps in mesenteric venules after Mesenteric Ischemia-reperfusion injury)

DOI:

10.3791/67264

⸱

2024년 9월 27일

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 장간막 허혈-재관류 손상을 유도하고 생체 내 현미경을 사용하여 장간막 정맥의 호중구 세포 외 트랩(NET)을 시각화하는 방법을 제시합니다. 상장간막동맥의 혈류를 1시간 동안 제한한 후 재관류를 수행하여 백혈구 유착 및 NETosis를 직접 정량화할 수 있었습니다.

초록

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장 허혈-재관류(I/R) 손상은 장간막 혈관으로의 혈류 제한으로 인한 조직 손상을 특징으로 하는 급성 질환으로, 예후가 좋지 않은 국소 및 전신 병리학을 유발합니다. 허혈과 재관류는 모두 일련의 세포 및 분자 반응을 유발하며, 염증성 세포는 병리학의 핵심 조절자 역할을 합니다. 허혈성 내피와의 이러한 상호 작용은 다중 접착 수용체에 의해 매개됩니다. 이 병리학을 모방하고 관련된 분자 경로를 조사하기 위해 여러 동물 모델이 확립되었습니다. 이 연구에서는 I/R 손상의 미세수술 모델을 생체 내 현미경과 결합하여 백혈구 굴림, 접착 및 호중구 세포외 트랩(NET) 형성을 시각화합니다. 이 모델은 내피 PAR1(F2r)이 결핍된 형질전환 마우스에 적용하여 허혈 후 1시간 후 및 재관류 직후 백혈구 압연 및 NET 형성에 대한 PAR1의 영향을 평가합니다. 생체 내에서는 Acridine Orange 백혈구 염색을 사용하고, 핵산 염색을 사용하여 NET을 시각화했습니다. 흥미롭게도, 백혈구 부착 감소와 NET 형성이 내피 PAR1 수용체가 결핍된 마우스에서 관찰되었습니다. 이 모델을 사용하면 I/R 손상과 관련된 주요 조절 인자의 생체 내 분석을 수행할 수 있습니다.

서론

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급성 장간막 허혈(Acute mesenteric ischemia, AMI)은 사망 위험2이 높은 희귀 병리1로, 셀리악 축(celiac axis) 또는 상부 또는 하부 장간막 동맥(superior or lower interenteric artery)의 혈전으로 인해 장간막의 혈류가 감소하는 것이 특징이다. 60%-70%의 경우, 혈전증이나 색전술로 인한 상장간막동맥의 급성 폐색이 급성 장 허혈의 원인이다3. 반면, 5-15%의 사례에서 장간막 정맥 혈전증은 상장간막 정맥(superior mesenteric vein)과 관련된 장간막 허혈(mesenteric ischemia)을 유발하며, 드물게는 하부 장간막 정맥(lower mesenteric vein)과 관련된 허혈(mesenteric ischemia)을 유발한다4. 허혈로 인한 저산소증과 영양실조는 세포 수준에서 에너지 대사 장애를 유발한다5. 예를 들어, 손상된 미토콘드리아 기능은 여러 신호 경로를 활성화하여 세포 사멸 메커니즘을 시작합니다6. 빠른 재관류는 호기성 대사의 회복을 가능하게 하지만, 허혈 부위로의 혈류 회복은 종종 활성산소종(ROS) 생성7, 칼슘 과부하8, 내피 기능 장애9 및 염증 반응10으로 인해 광범위한 조직 손상을 유발한다.

허혈-재관류(I/R) 손상 중 분자 메커니즘을 규명하기 위해 상장간막동맥의 일시적인 혈관 폐색을 사용하는 많은 실험 동물 모델이 확립되었습니다11. 이러한 모델을 생체 내 현미경(IVM)과 함께 사용하는 것은 기저 세포 상호 작용 및 질병 진행에 대한 통찰력을 얻기 위한 기본 요소입니다11. 허혈 직후 장 장벽 기능 장애가 관찰되며12 상피가 무결성을 잃고13 장간막 림프절, 비장, 간, 신장과 같은 장 외 부위로 세균 전좌가 발생합니다12,14. 재관류는 점막 손상을 더욱 악화시킨다15. 세동맥의 염증 반응은 L-selectin16, P-selectin (CD62P)17, 혈소판 GPIIb/IIIa 및 fibrinogen18과 같은 분자에 의존하는 내피 세포층에 백혈구가 굴러가고 단단히 접착되는 것에 의해 나타납니다. 흥미롭게도, 장간막 정맥에 대한 백혈구 부착은 장내 미생물총(microbiota)19 및 톨 유사 수용체(Toll-like receptor 4) 신호10의 존재에 의해 영향을 받습니다. I/R 손상은 또한 호중구 세포외 트랩(NET) 형성을 유발합니다10. 호중구와 같은 활성화된 백혈구에서 유래한 세포외 DNA의 치료적 표적화는 장 I/R 손상의 결과를 개선한다20. 간에서 I/R 손상은 상주 마이크로파지에 의해 발화되며(21), 마이크로RNA 억제(microRNA inhibitor)는 세포사멸(apoptosis)을 현저하게 약화시킨다22. 주목할 점은 장간막의 I/R 손상은 장 세균 불균형(gut dysbiosis)을 초래하며, 이는 혈관 재생술 후 되돌릴 수 있고 해결된다는 것이다23.

내피는 또한 I/R 손상의 손상 효과에 의해 영향을 받으며, ROS는 이 과정에서 중추적인 역할을 합니다24. 백혈구가 내피 세포층에 부착, 내피 손상 및 산화질소(NO) 대사의 변화가 관찰됩니다9. 그러나 관련된 분자 경로는 아직 완전히 조사되지 않았습니다.

프로테아제 활성화 수용체 1(Protease-activated receptor 1, PAR1, F2r)은 내피 세포를 포함한 다양한 세포에 의해 발현되는 막 수용체(membrane receptor)로, 염증성 질환 중에 활성화된다25. 세린 프로테아제(serine protease)가 N-말단(N-terminus)에서 수용체를 절단하여 테더링된 리간드(tethered ligand)를 노출시킬 때 활성화가 발생하며, 이 리간드는 분자의 두 번째 세포외 루프(extracellular loop)에 결합하여 수용체를 활성화합니다26. 내피 단백질 C 수용체(EPCR)-PAR1 신호전달 경로는 내피 NO 항상성에 영향을 미치고 말초 허혈에서 혈류 회복을 촉진한다27.

본 연구에서는 백혈구 롤링, 접착 및 NET 형성을 시각화하기 위해 내피 세포 특이적 PAR1 결핍을 특징으로 하는 유전자 마우스 모델에 I/R 손상을 적용했습니다. I/R 미세수술 후 유전자 마우스 모델과 생체 내 현미경 검사의 조합은 질병 진행과 관련된 특정 세포 유형을 강조함으로써 귀중한 통찰력을 제공합니다. 유전자 마우스 모델에 I/R 손상을 적용하는 것은 질병의 진행을 개선하는 데 사용할 수 있는 잠재적인 치료 표적을 식별하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, NETosis에서 내피 PAR1의 중요성이 밝혀졌다.

프로토콜

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쥐와 관련된 모든 절차는 동물 입법에 관한 지역 위원회(Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz, Koblenz, Germany; G21-1-041). 6-8 주 된 수컷과 암컷 B6. FVB-F2rtm1a(EUCOMM) Tg/Cdh5-cre)7Mlia/Tarc 마우스를 사용하여 연구를 진행했습니다. F2r(PAR1)의 내피 세포 특이적 조절은 VE-Cadherin Cre 프로모터28을 통해 발생합니다. 본 연구에서 flox-F2r x VE-Cadherin Cre+(F2RΔEC)는 내피 세포에서 F2r(PAR1) 발현이 감소했으며, flox-F2r x VE-Cadherin Cre-(WT)는 정상 내피 F2r(PAR1) 수치를 나타냅니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 수술 준비

  1. 필요한 수술 도구(매우 좁은 가위, 곧은 가위, 집게, 혈관 클램프 등)를 소독하십시오.
  2. 콧방울과 가열판으로 산소 및 이소플루란 기반 마취 시스템을 준비합니다.

2. 동물 준비

  1. 동물의 무게를 잰다.
  2. 마취 수행: 미다졸람(5mg/kg), 메데토미딘(0.5mg/mL) 및 펜타닐(0.5mg/kg)이 포함된 용액의 복강내(IP) 주사를 통해 마우스를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
  3. 목과 복부 수술 부위의 털을 작은 동물용 전기면도기로 제거합니다.
  4. 마우스를 가열 패드의 등쪽 누운 자세에 놓고 노즈 콘을 통해 산소 시스템에 연결합니다. 수술용 테이프로 가열된 패드에 마우스의 팔다리를 고정합니다. 라텍스 노즈콘 멤브레인이 마우스 머리에 단단히 맞는지 확인합니다. 설치류 전용 온도계를 사용하여 동물의 체온을 직장에서 모니터링합니다.
  5. 제모 크림을 바르고 목 수술 부위에 남아 있는 털을 제거하고 수술 부위의 피부를 70% 에탄올로 닦습니다.
  6. 발가락 꼬집음 테스트(페달 반사)를 수행하여 동물이 완전히 마취되었는지 확인합니다.

3. 외과적 절차

  1. 경정맥에 카테터 이식
    1. 기관을 가로로 절개(~0.5cm)하고 목을 덮고 있는 피부를 제거하고 오른쪽 경정맥을 분리합니다.
    2. 5cm 정도의 명사를 사용하여 정맥의 말단 끝을 닫고 수술 겸자로 고정합니다. 정맥 아래 약 2cm에 3 개의 명주실을 놓습니다 : 하나는 원위 끝 부분에, 다른 두 개는 경정맥의 근위 끝 부분에 가깝습니다. 수술 매듭을 묶되 혈관을 닫지 마십시오.
    3. 0.9% NaCl로 채워진 폴리에틸렌 카테터(0.28mm ID, 0.61mm OD)를 준비하고 1mL 주사기로 막습니다. 가위를 사용하여 두 번째와 세 번째 매듭 사이에 구멍을 뚫고 카테터를 경정맥에 이식합니다. 주사기를 흡인하여 카테터에 혈액이 있는지 확인합니다.
    4. 명주실을 묶어 카테터를 정맥에 고정하고 단단히 고정되었는지 확인합니다. 의료용 테이프를 사용하여 주사기를 고정합니다.
    5. 아크리딘 오렌지 준비: 1mL 주사기에 2mg/mL 스톡 용액을 멸균 식염수(0.5mg/mL 최종 농도)로 1:4 희석합니다. 주사기를 어두운 곳에 두고 마우스에 50μL를 주입합니다.
    6. 핵산 염료 준비: 1mL 주사기에 5mM 원액을 멸균 식염수(5μM 최종 농도)로 1:1000으로 희석합니다. 주사기를 어두운 곳에 두고 마우스에 50μL를 주입합니다.
    7. 경정맥 카테터를 통해 생체 내 아크리딘 오렌지(50 μg/μL, 마우스당 50 μL)를 주입하여 염색 호중구 세포외 트랩(NET)(5 μM, 마우스당 50 μL)과 유사하게 염색된 백혈구 및 세포외 DNA 형광 염료를 시각화합니다. NET과 백혈구는 동시에 이미지화됩니다.
  2. 장간막 I/R 부상 모델
    1. 70% 에탄올로 복부 피부를 소독합니다.
    2. 수술용 가위를 사용하여 알바 선을 따라 3-5cm 개복술을 수행합니다.
    3. 식염수에 적신 두 개의 면 팁을 사용하여 장을 부드럽게 제거하고 지방이 최소한으로 덮인 위치를 식별합니다. 검은 반죽 위에 작은 장 가지를 놓아 배경 신호를 줄입니다.
    4. I/R(허혈 전) 전에 비디오를 획득합니다.
    5. NaCl로 수분을 찜질하고 그 안에 장을 넣으십시오. 장이 압박으로 둘러싸여 있고 5.6단계에서 수분을 유지하는지 확인합니다.
    6. 작은 혈관 클램프로 상장간막 동맥을 폐색합니다.
    7. 식염수에 적신 면봉을 사용하여 장을 복강 안으로 부드럽게 밀어 넣고 7-0 봉합사를 사용하여 복벽을 닫아 수분과 온도의 손실을 방지합니다. 60분 동안 허혈 상태를 유지하고 최소 20분마다 마취를 확인합니다.
    8. 1시간 후 클램프를 제거하여 재관류를 시작합니다.
      참고: 허혈 절차를 적절하게 실행하면 눈에 띄는 변화가 나타납니다. 처음에는 혈류 부족으로 인해 해당 부위가 창백하거나 하얗게 보일 수 있습니다. 클램프를 제거하면 혈류가 점차 허혈 부위로 돌아가 정상적인 색을 되찾아 성공적인 폐색을 의미합니다. 허혈 단계 전반에 걸쳐 마우스를 지속적으로 면밀히 관찰하는 것이 필수적입니다.
    9. 허혈 기간이 지나면 잘린 부위에 식염수 몇 방울을 떨어뜨린 다음 클립 어플리어를 사용하여 미세혈관 클립을 부드럽게 제거합니다.
    10. 식염수에 적신 면봉을 사용하여 다시 부드럽게 장을 제거하고 정맥의 작은 가지를 검은 반죽에 놓고 다시 50μL의 아크리딘 오렌지를 주입하고 같은 위치(허혈 후)에서 동일한 정맥의 비디오를 캡처합니다.

4. Intravital 고속 비디오 epifluorescence 현미경 검사

  1. 장거리 콘덴서, 모노크로메이터, 10배 침수 대물렌즈 및 전하 결합 장치 카메라가 장착된 고속 광시야 형광 현미경으로 백혈구 및 NET을 시각화합니다. 이미지 획득은 30ms 노출 시간과 Alexa Fluor 488(495/519) 및 Rhodamine Red(570/590) 필터로 수행되었습니다.
  2. 이미지 획득 및 분석을 위해 이미징 소프트웨어를 사용할 수 있습니다.
  3. 0.06 mm² 관심 영역 내에서 세포 동원을 정량화합니다.
  4. 부착 백혈구를 20초 관찰 기간 동안 내피 내막에 고정되어 있거나 부착된 세포로 정량화합니다.
  5. NET을 백혈구 및 세포외 핵산 형광 염료로 표지된 세포 외 구조로 식별합니다.
  6. 실험이 끝날 때 자궁경부 탈구로 동물을 안락사시킵니다(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름).

5. 간 내피 세포(LEC) 분리 및 정량적 RT-PCR

  1. 자기 세포 분류(MACS) 를 통한 LEC 분리29.
  2. 전체 RNA를 분리합니다.
  3. 총 RNA 2 μg과 RT 완충액 2 μL, dNTP 믹스 0.8 μL, RT 랜덤 프라이머 2 μL, 역전사 효소 1 μL, 멸균 증류 H2O 4.2 μL를 혼합하여 상보적 DNA(cDNA) 합성27을 수행합니다.
  4. cDNA 전사는 다음 조건에 따라 수행하였다: 25°C 10분, 37°C 120분, 85°C 5분 동안.
  5. qPCR에는 cDNA 20ng을 사용합니다.
  6. F2r(정방향): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC, F2r(역방향): CCAGCAGGACGCTTTCATTTTT, L32(전방향): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC, L32(역방향): TCTGGGTTTCCGCCAGTTTTT. 다음 조건을 사용하십시오 : 95 ° C 30 초, 45 사이클 (95 ° C 10 초, 60 ° C 25 초), 60 ° C에서 95 ° C 6 초 동안 ΔΤ 1 ° C.

결과

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백혈구 롤링 및 접착 및 NET 형성에 대한 내피 세포 의존적 효과를 연구하기 위해 처음에는 내피 세포에서 VE-Cadherin Cre 유도 F2r 결핍의 효능을 조사했습니다. 간 내피 세포를 분리하기 위해 자기 세포 분류가 사용되었습니다. 그 후, RNA를 분리한 후 정량적 real-time PCR(qRT-PCR)을 수행했습니다. VE-Cadherin promoter의 제어하에 발현된 Cre 재조합효소가 없는 F2rΔEC 마우스는 WT 대조군에 비해 F2r (PAR1) mRNA 수치가 현저히 감소(약 1/3)된 것으로 나타났습니다(그림 1).

마우스 라인의 결핍을 확인한 후, 장간막 I/R 손상을 수행하여 혈관 내피 세포가 발현하는 PAR1이 생체 내 현미경으로 시각화된 백혈구 롤링 및 접착에 미치는 영향을 조사했습니다(그림 2A, B). 허혈 1시간 후, 클램프를 제거하고 혈관을 재관류시켰습니다. 백혈구 굴림과 유착이 관찰되고 기록되었습니다(녹색으로 염색되고 흰색 화살표로 표시). 두 그룹 모두 I/R 손상 후 부착 백혈구 수가 증가한 것으로 나타났지만, 내피 F2r (PAR1)의 결핍으로 인해 I/R 활성화 장간막 내피에 대한 백혈구 접착력이 현저히 감소하지는 않았으며, 이는 허혈성 장간막 정맥에 대한 백혈구 동원에서 내피 PAR1 활성화의 적극적인 역할을 시사합니다(그림 2C).

다음 목표는 내피 PAR1 발현이 I/R 손상으로 인한 NET 형성을 조절하는지 여부를 조사하는 것이었습니다. 그러므로, 세포외 핵산을 세포 불투과성 염료(30)로 염색하고, 생체 내 현미경(검은색 화살표로 표시)을 사용하여 생성된 NET을 시각화하였다(그림 2A,B). I/R 손상 후, NET은 내피 세포에서 정상 수준의 PAR1을 발현하는 WT 그룹에서만 관찰되었으며, 이는 NETosis에서 PAR1의 조절 역할을 나타냅니다(그림 2C, D). 특히, 내피 F2r 발현이 억제되었을 때, I/R로 손상된 장간막 정맥에는 NET이 존재하지 않았다.

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그림 1: F2r(PAR1) mRNA 발현. L32 하우스키핑 유전자에 상대적인 WT(n = 6) 및 F2rΔEC(n = 9) 마우스의 F2r 간 내피 세포 발현. 데이터는 95% 신뢰 구간의 중위수로 표시됩니다. Mann-Whitney 검정은 두 개의 독립 그룹 *p < 0.05를 비교하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 내피 PAR1은 I/R 손상 장간막 정맥에서 백혈구 접착 및 NET 형성에 영향을 미칩니다. I/R 부상 전(사전) 및 후(사후) (A) 10배 및 (B) 20배 배율의 WT 및 F2rΔEC 마우스의 Acridine 주황색(흰색 화살표)으로 염색된 부착 백혈구 및 Sytox 주황색(검은색 화살표)으로 염색된 NET의 대표적인 생체 내 현미경 이미지. 눈금 막대 : A, 50 μm; B, 20 μm. (C) 백혈구 접착 및 (D) WT (n = 7) 및 F2rΔEC (n = 4) 마우스의 mm2 당 NETs (전) 및 후 I / R 부상 후. 모든 데이터는 95% 신뢰 구간에서 중앙값으로 표시되었습니다. Two-way ANOVA test, **p< 0.01 및 Sídák의 다중 비교 테스트를 사용하여 통계적 비교를 수행하여 모든 시점(허혈 전후 및 후)에서 서로 다른 유전자형의 평균을 비교했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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생체 내 현미경 검사와 결합된 장간막 I/R 손상은 허혈 1시간 후 백혈구 및 NET의 생체 내 분석을 위해 내피 세포의 F2r(PAR1) 결핍에 대한 유전자 마우스 모델에 적용되었습니다. 장간막 I/R 손상 모델은 허혈과 재관류 시간이 몇 분에서 몇 시간까지 다양한 설치류에서 자주 사용되며, 23,31 염증 결과32 및 폐사율33에 영향을 미칩니다. 이 모델은 또한 미생물군19,34, 면역 수용체 10,35,36,37, 성별38,39,35세 등 여러 요인에 따라 달라집니다. 다양한 I/R 시간 외에도 이 모델의 또 다른 변수는 소장이 결장보다 더 큰 점막 손상을 보이는 부상에 대한 장의 다른 부분의 차등 반응입니다40. 허혈 영역에 영향을 미치는 미세혈관 클립의 위치는 방법32,33의 재현성에 중요합니다. 중요한 것은, 부수적 흐름 중단과 결합된 우수한 장간막 동맥 폐색은 허혈의 지속 기간과 일관되게 관련된 사망률을 산출한다는 것입니다41.

본 연구에서는 생쥐를 대상으로 1시간 동안 허혈을 실시하고, 재관류 직후 생체 내 백혈구 부착 및 NET 형성을 시각화하여 내피 F2r 발현이 없는 상태에서 허혈 상태에 의해 유발되는 조기 염증 반응을 조사했습니다. 이러한 방법을 유전자 마우스 모델에 적용하면 특정 표적 분자가 허혈 후와 재관류 중 세포 행동과 염증 반응에 어떤 영향을 미치는지 조사할 수 있습니다.

프로토콜에는 장 무결성 유지를 포함하여 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 장 만지는 것은 조직 손상을 방지하기 위해 부드럽게 이루어져야 합니다. 이를 위해 촉촉한 면봉은 복강에서 장을 일시적으로 분리하는 데 적합한 도구입니다. 장이 복부로 재배치될 때까지 촉촉한 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 경미한 취급 부상은 혈소판 및 내피 세포와 같은 다양한 세포 유형의 활성화를 유발할 수 있으며, 이는 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

일관성을 위해 허혈 전후의 동일한 장 분절 부위를 시각화하는 것이 중요합니다. 이는 허혈 후 장이 복강 내에서 재배치되기 때문에 어려울 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 방법은 허혈 전에 시각화된 장 부분에 작은 촉촉한 압박 붕대 조각을 놓는 것입니다.

생체 내에서 백혈구 롤링 및 접착력과 NET 형성을 시각화하기 위해 마우스에 경정맥을 통해 백혈구와 핵산 형광 염료를 모두 주입했습니다. 백혈구 염료 (재료 표 참조)는 백혈구에는 결합하지만 적혈구에는 결합하지 않는 세포 투과성 변색 형광 염료이며 생체 내 백혈구 염색에 널리 사용되었습니다 17,42. 염료는 정맥 주사로 도포되며 몇 초 내에 강력한 백혈구 염색을 제공합니다. 그러나 특이성은 내피 세포와 같은 다른 핵 세포도 염색하기 때문에 제한이 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 순환 세포는 세척 효과(washout effect)로 인해 염색을 더 오래 유지한다43. 핵산 형광 염료 (재료 표 참조)는 NET 형성30 , 44 , 45 를 시각화하는 데 일반적으로 사용되는 세포 불 투과성 핵산 염색입니다. 또한 정맥 주사로 적용할 수 있고 친화력이 높으며 빠르고 사용하기 쉽습니다. 다시 말하지만, 특이성은 염료가 손상되지 않은 막이 있는 모든 세포에 결합하기 때문에 단점입니다. 이상적으로는 호중구 마커(예: CD15, CD11b) 또는 NETosis 마커(예: 항-citH3 항체)와 결합하여 특이성을 향상시켜야 합니다. 이러한 염료는 실험실 동물의 장간막 정맥에서 백혈구의 생체 내 이미징을 가능하게 합니다.

이 기술의 주요 한계는 내장 지방이 존재한다는 것인데, 이는 장 모세혈관의 시각화를 제한하고 이미지 획득을 크게 방해합니다. 이러한 합병증을 피하려면 내장 지방 형성이 감소한 어린 실험 동물(6-8주령)을 사용해야 합니다. 또한 체외 조직학적 분석은 in vivo 염색의 사용으로 인해 방해를 받습니다. 또 다른 한계는 장내 미생물총(microbiota)과 식단이 이 모델에 미치는 영향인데, 이는 서로 다른 마우스 사육 방식에 따라 크게 다를 수 있다46. 이러한 한계를 해결하기 위해 gnotobiotic 마우스 모델에 대한 연구를 고려할 수 있습니다10.

본 연구에서는 허혈 후 즉각적인 세포 반응을 조사하고, 활성화된 장간막 내피에 대한 백혈구 침착 감소 및 NET 형성을 in vivo에서 관찰했습니다. 허혈 후 1시간 후에 DNase를 정맥 투여하여 분해하면 조기 전염증 반응이 감소하고 장 장벽 파괴가 개선된다47. 주목할 점은 트롬빈 활성을 억제하는 막관통 당단백질인 트롬보모듈린(thrombomodulin)을 사용한 치료48는 심각한 장 I/R 손상이 있는 마우스의 생존을 개선하여 내피 기능 장애의 염증 반응을 약화시키고 원격 장기에서 강렬한 히스톤 축적을 감소시켰다는 것입니다49. 여기서, 내피 트롬빈 수용체는 I/R 결과에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 질병 병리학의 중요한 매개체를 조사하기 위해 유전자 조작 마우스에서 장 I/R 손상 모델과 생체 내 현미경 검사를 결합하는 것의 중요성을 강조했습니다.

공개 사항

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저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.

감사의 글

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C.R.은 Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz and ReALity(프로젝트 MORE), BMBF Cluster4Future CurATime(프로젝트 MicrobAIome, 03ZU1202CA), Wilhelm Sander-Stiftung(Nr. 2022.131.1) 및 Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung(DZG) 혁신 기금 "마이크로바이옴"(81X2210129)의 자금 지원을 인정합니다. C.R.은 독일 심혈관 연구 센터(DZHK)의 과학자입니다. C.R.은 CTVB(Center for Translational Vascular Biology), FZI(Research Center for Immunotherapy) 및 요하네스 구텐베르크 대학교 마인츠(Johannes Gutenberg-University Mainz)의 Potentialbereich EXPOHEALTH의 회원입니다. C.R.은 DFG Research Unit 5644 INFINITE(RE 3450/15-1)의 구성원입니다. C.R.은 마인츠 요하네스 구텐베르크 대학의 구텐베르크 연구 대학으로부터 펠로우십을 받았습니다. K.K.는 DZHK "Promotion of Women Scientists" Excellence Programme의 지원을 받고 있으며 Young DZHK의 회원입니다. Z.G.와 O.D.는 마인츠 중개 생물 의학 연구 학교(TransMed)의 박사 과정 학생입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아크리딘 오렌지시그마-알드리치   A-6014
96웰 플레이트 곱하기 PCR-플래튼 Sarstedt721977202.00
설치류용 마취 시스템GROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
black doughStaedtler모델링 클레이
CD146 Microbeads, 마우스Miltenyi Biotec130-092-007
cellSens올림푸스올림푸스, cellSense, Dimension, Desktop 2.3소프트웨어
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