이 프로토콜은 환경 조건을 사용하여 펩타이드가 하이드로겔로 자가 조립되도록 하는 세 가지 빠르고 간단한 준비 방법을 제시합니다. 또한 펩타이드 하이드로겔의 특성 분석이 설명되어 이러한 간단한 조건에서 기계적으로 안정적인 펩타이드 하이드로겔을 형성할 수 있음을 보여줍니다.
이 프로토콜은 환경 조건을 사용하여 펩타이드가 하이드로겔로 자가 조립되도록 하는 세 가지 빠르고 간단한 준비 방법을 제시합니다. 또한 펩타이드 하이드로겔의 특성 분석이 설명되어 이러한 간단한 조건에서 기계적으로 안정적인 펩타이드 하이드로겔을 형성할 수 있음을 보여줍니다.
펩타이드 하이드로겔은 나노섬유 또는 폴리머의 자체 조립에 의해 형성된 친수성이 높은 3차원 네트워크 겔로, 물 잠금 네트워크를 생성합니다. 그들의 형태는 세포외 기질의 형태와 매우 유사하여 펩타이드의 생물학적 기능과 반응성 겔화 특성을 모두 나타낼 수 있습니다. 이러한 고유한 특성으로 인해 조직 공학, 3차원 세포 배양, 암 치료, 재생 의학 및 기타 생물 의학 분야에서 광범위하게 적용되고 있습니다. 이 기사에서는 환경적으로 반응하는 겔화 공정과 함께 자가 조립 펩타이드를 사용하여 ECF-5 펩타이드 하이드로겔을 제조하는 세 가지 방법을 설명합니다: (1) pH 반응성 겔화: 다양한 pH 수준은 아미노산 잔기의 양성자화 또는 탈양성자화를 유도하여 펩타이드 분자 간의 정전기 상호 작용을 변경하고 하이드로겔로의 자체 조립을 촉진합니다. (2) 금속 이온 첨가: 음전하를 띤 아미노산 잔기가 있는 다가 금속 이온 킬레이트, 펩타이드 사이의 다리 역할을 하여 네트워크 하이드로겔을 형성합니다. (3) 용매 교환: 소수성 펩타이드는 처음에 비극성 유기 용매에 용해된 후 극성 수성 환경으로 전환될 때 하이드로겔로 자체 조립을 유도합니다. 이러한 방법은 기존의 실험 절차를 활용하여 펩타이드가 하이드로겔로 자체 조립되는 것을 용이하게 합니다. 특정 겔화 유도 조건에 맞게 펩타이드 염기서열을 설계함으로써 미세하게 조정된 미세/나노 구조 및 생물학적 기능을 달성할 수 있으며, 이는 생물의학 영역에서 펩타이드 하이드로겔의 상당한 잠재력을 강조합니다.
펩타이드 염기서열의 설계를 통해 펩타이드 간의 비공유 상호작용은 자기 조립을 유도하여 나노튜브, 나노리본, 나노섬유 및 구형 구조를 포함한 정렬된 마이크로미터 및 나노미터 구조의 형성으로 이어집니다1. 마이크로 및 나노미터 섬유/리본으로 자체 조립될 때 이러한 구조는 거시적으로 하이드로겔 특성을 나타냅니다. 펩타이드 자가 조립 하이드로겔은 비공유 상호작용을 통해 자체 조립되고, 겔 형태가 가역적이며, 용액과 겔 상 사이를 전환하기 위해 특정 조건에 즉시 반응한다는 점에서 폴리머 하이드로겔과 다릅니다2. 예를 들어, 방향족 아미노산 펩타이드는 용매 전환 3,4,5를 기반으로 젤라틴화되도록 유도할 수 있고, RADA16 펩타이드는 양이온 및 음이온 정전기 상호 작용6을 통해 겔을 형성하며, E1Y9 펩타이드는 Ca2+ 이온 7을 통해 하이드로겔을 형성하도록 유도될 수있습니다. 천연 아미노산은 인체에서 대사될 수 있으며 폴리머 하이드로겔이 달성할 수 없는 우수한 생체 적합성을 제공합니다8. 단백질은 생물학적 기능을 수행하는 분자이며, 펩타이드 서열의 차이는 특정 생물학적 기능을 생성합니다. 따라서 특정 생체 기능 펩타이드 서열을 내장하고 자체 조립 특성을 부여하면 고유한 생물학적 기능 및 형태를 가진 펩타이드 자체 조립 하이드로겔을 설계할 수 있습니다 9,10,11. 이 기사에서는 펩타이드 하이드로겔을 제조하는 세 가지 방법을 소개하며, 겔화 과정은 환경 반응에 의해 촉발됩니다. 또한 펩타이드 하이드로겔의 기계적 특성과 형태를 특성화하는 방법에 대해서도 간략하게 설명합니다.
pH는 아미노산의 전하를 조절하여 일부 펩타이드의 겔화를 유발합니다. 예를 들어, 양전하를 띤 아미노산(예: 아르기닌, 라이신, 히스티딘)은 pH에 의해 조절되어 양성 또는 중성 상태에 도달합니다. 음전하를 띤 아미노산은 pH에 의해 조절되어 음수 또는 중성 상태를 달성하고 등전점에서 멀어짐으로써 수용액에서 친수성을 변경합니다. 따라서 펩타이드 사이의 정전기 및 소수성 상호 작용을 제어하면 질서 있는 자체 조립을 용이하게 할 수 있습니다. Zhang et al.은 in vitro 및 in vivo 모두에서 약산성 환경에 반응하여 졸에서 겔로의 상전이를 가능하게 하는 양친매성 pH 반응성 자가 조립 펩타이드인 메토트렉세이트 결합 KKFKFEFEF를 설계했습니다. 이는 효율적인 세포 흡수 및 세포내이입(endocytosis)으로 이어져 항암제를 전달하고 화학요법 효과를 향상시킵니다12. Shen et al.13 은 pH 9.4 이상에서 섬유로 쉽게 자체 조립되는 FF8(KRRFFRRK) 펩타이드를 설계했습니다. 중성 조건에서 미생물은 음전하를 띤 인지질막과의 정전기 상호 작용으로 인해 양전하를 중화하고 인지질 분자와 협력하여 자가 조립하여 막 파열을 일으키고 살균 효과를 향상시킵니다13.
배위 금속을 사용하여 펩타이드 초분자 자가 조립을 하이드로겔로 트리거하는 것은 비교적 드문 방법이다14. 금속 이온이 펩타이드와 정전기로 상호 작용할 때 펩타이드 분자를 연결하는 소금 다리를 형성하여 비공유 상호 작용 및 자체 조립을 일으켜 겔화 특성을 생성합니다. 예를 들어, Abul-Haija et al.15 은 구리 이온을 첨가하면 액체에서 하이드로겔로 전환되는 트리펩타이드 FFD를 설계했습니다. Tao et al.16 은 글루탐산과 페닐알라닌이 풍부한 펩타이드 E3F3를 개발했는데, 이 펩타이드는 아연 이온이 있는 상태에서 섬유질 하이드로겔로 자가 조립되어 전립선 약물 전달에 사용됩니다.
펩타이드 하이드로겔의 용매 교환 형성은 가장 일반적인 초분자 자기 조립 유발 조건입니다. 소수성 펩타이드가 유기 용매에 용해된 후, 소수성 펩타이드는 완전히 노출됩니다. 수성상으로 이동하면 소수성 그룹이 서로 접근하고 물 분자는 펩타이드 수소 결합의 형성을 촉진하여 빠른 자기 조립과 하이드로겔의 쉬운 형성을 가능하게 합니다. 예를 들어, Zhang et al.17 은 극성 유기 용매에 고농도로 안정적으로 용해될 수 있는 펩타이드를 설계했으며, 물로 희석하면 β장 구조로 자체 조립하여 펩타이드 섬유 하이드로겔을 형성할 수 있습니다. Shen et al.13 은 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 미리 용해된 후 수성상에 주입하여 환원성 하이드로겔을 형성하고, 허혈 재관류에 의해 생성된 활성 산소 종의 표적 제거에 사용되며, 이는 이후 소거 후 용액으로 분해되었습니다.
이 연구는 이전 경험을 바탕으로 간단하고 빠르며 일반화 가능한 세 가지 펩타이드 하이드로겔 제조 전략을 선택했습니다: (1) pH 반응 방법: 펩타이드를 등전점에서 멀리 떨어진 pH를 가진 용액에 용해시킨 다음 pH를 등전점 근처로 조정합니다. 이러한 변화를 통해 특정 자체 조립 펩타이드가 섬유를 형성하고 펩타이드 하이드로겔을 생성할 수 있습니다. (2) 금속 이온 첨가 방법: 배위 양이온을 수용성, 음전하를 띤 자체 조립 펩타이드에 첨가합니다. 펩티드 사이의 금속 배위 킬레이트화는 하이드로겔로의 자체 조립으로 이어집니다. (3) 용매 교환 방법 : 고농도 펩타이드를 유기 용매에 용해시킨 후 수성상으로 희석하여 겔화 거동을 유도합니다.
이 연구에 사용된 플라스미드, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 Table of Materials에 나열되어 있습니다.
1. pH 반응 방법
2. 금속 이온 첨가 방법
3. 용매 교환 방법
4. 하이드로겔의 유변역학적 특성 분석
5. 섬유 형태의 원자력 현미경(AFM) 특성화
이 기사에서 설명하는 펩타이드 하이드로겔을 제조하는 세 가지 방법을 사용하면 빠르고 저렴하며 간단한 생산이 가능합니다. 하이드로겔의 기능은 펩타이드 서열과 관련이 있습니다. 여기서, ECF-5 펩타이드는 미세한 형태 및 기계적 특성을 포함한 물리적 특성을 입증하기 위한 대표적인 예로 사용됩니다.
그림 1A 및 보충 그림 1에서 볼 수 있듯이 ECF-5 펩타이드에는 글루타치온 유사 서열과 페닐알라닐 디펩타이드 서열이 포함되어 있어 글루타치온의 환원 특성과 자체 조립 능력을 부여합니다. ECF-5 펩타이드를 DMSO에 미리 용해시킨 후 수용액과 빠르게 혼합했습니다. 이 단계에서 펩타이드는 신속한 자체 조립을 거쳐 몇 분 내에 고체 겔을 형성했습니다. 최종 펩타이드 농도가 1%를 초과하면 핀셋으로 겔을 집어낼 수 있습니다.
겔 표면의 원자력 현미경(AFM) 이미징 결과, 물을 가두는 조밀한 기공이 있는 수많은 펩타이드 섬유 네트워크가 드러났습니다. 희석 시 그림 1D와 같이 개별 섬유의 형태는 약 3.5nm의 높이를 표시하여 매우 일관된 더 넓은 섬유 띠를 형성합니다. 이는 겔 네트워크에서 관찰된 섬유 형태와 일치합니다. 또한 중성 조건에서 칼슘 금속 이온은 펩타이드가 하이드로겔을 형성하도록 유도할 수도 있지만, 이 과정은 상대적으로 느리고 더 부드러운 겔을 생성합니다.
pH 반응, 금속 첨가 및 용매 교환의 세 가지 방법을 사용하여 제조된 하이드로겔의 거시적 거동은 그림 2A에 설명되어 있습니다. 탈이온수와 비교하여 모든 하이드로겔은 반고체 특성을 나타냈습니다. 유변학은 일반적으로 하이드로겔과 졸을 구별하는 데 사용됩니다.
이 세 가지 겔화 방법을 통해 얻은 ECF-5 하이드로겔의 거시적 점탄성을 유변학 기술을 사용하여 비교했습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 ECF-5 하이드로겔은 일반적인 하이드로겔의 점탄성 특성을 나타냈습니다. 0.3%의 변형률에서 서로 다른 주파수에서 저장 계수(G')와 손실 계수(G'') 사이의 관계가 표시됩니다. ECF-5 하이드로겔은 빈도와 약한 상관관계를 보였다. 세 가지 방법으로 얻은 하이드로겔의 저장 탄성률(G')은 약 10kPa였으며, 이는 손실 탄성률(G'')보다 약 10배 더 크며 전형적인 반고체 하이드로겔 특성을 보여주었습니다(그림 2B). 이는 ECF-5 하이드로겔이 제조 방법에 관계없이 전형적인 하이드로겔 점탄성을 나타낸다는 것을 나타냅니다.
10rad/s에서의 변형률 수준과 저장 탄성률(G') 및 손실 탄성률(G'')의 플롯(그림 2C)은 G'와 G''가 0.1%에서 10%의 변형 범위에서 거의 일정하게 유지되는 것을 보여주었으며, G'는 G''보다 약 10배 더 높았습니다. 이는 ECF-5 하이드로겔이 응력을 견딜 수 있는 전형적인 점탄성 하이드로겔임을 시사합니다.

그림 1: ECF-5 펩타이드 하이드로겔. (A) ECF-5의 화학 구조. (B) 1% 농도에서 ECF-5 펩타이드 하이드로겔의 거시적 형태. (C) 하이드로겔 표면의 미세구조. (D) ECF-5 펩타이드 섬유의 미세한 형태. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 하이드로겔의 거시적 형태 및 유변학적 특성화. (A) ECF-5 펩타이드의 최종 농도가 3mg/mL인 세 가지 다른 유도 하이드로겔 조건에서 하이드로겔의 거시적 형태. 1% 농도의 세 가지 유도 조건에서 ECF-5 하이드로겔의 저장 탄성률(G') 및 손실 탄성률(G'')의 빈도(B) 및 변형률(B) 의존성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 펩타이드 ECAFF의 LC-MS 분석. (A) 머무름 시간 13.238분의 피크가 제품 피크입니다. 용리액 컬럼은 220nm에서 100% 아세토니트릴에서 0.1% 트리플루오로아세트산을 사용하여 1mL/분의 유속으로 모니터링했습니다. ECF-5 수율은 97.33%입니다. (B) ESI/질량 분석법은 ECF-5의 분자량이 616.1임을 확인합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
지난 수십 년 동안 아밀로이드 단백질에서 유래한 자가 조립 펩타이드 서열의 발견 이후, 수많은 자가 조립 펩타이드가 그 특성을 기반으로 설계되어 생물 의학 및 재료 과학 분야의 응용 분야에 대한 상당한 잠재력을 입증했습니다19. 펩타이드 하이드로겔은 조직 배양, 약물 전달 및 종양 치료에서 고유한 생체 기능화 능력을 보여주었습니다20.
이 기사에서는 세 가지 유형의 펩타이드 하이드로겔에 대한 간단하고 빠른 준비 방법(pH 반응, 금속 이온 첨가 및 용매 교환)에 대해 설명합니다. 자기 조립 펩타이드는 서열 특성에 따라 다양한 비공유 상호작용을 생성하며, 소수성 상호작용이 주력이고 그 다음으로 정전기 상호작용이 발생합니다. 이러한 상호 작용은 다양한 자체 조립 특성을 초래하고 용해성 상태에서 불용성 상태로의 전환을 촉진합니다. 예를 들어, 아미노산과 펩타이드는 모두 용해도가 최소인 특정 등전점을 가지고 있습니다. pH가 등전점에서 크게 벗어나면 용해도가 증가하여 자체 조립이 가능합니다. 따라서, 용액 pH를 조정하는 것은 특정 펩티드(13)의 자기 조립을 유발할 수 있다. 그러나 극성이 높은 등전점을 가진 펩타이드는 불안정한 구조를 나타낼 수 있으며 탈아미드화 또는 가수분해가 발생하기 쉽습니다.
금속 이온에 의해 유도되는 펩타이드 하이드로겔의 형성에서 펩타이드는 일반적으로 글루탐산 및 아스파르트산과 같은 음전하를 띤 아미노산을 포함합니다. 이러한 펩타이드는 2가 금속 이온의 영향 하에서 금속 이온을 브리지로 사용하여 연결하여 자체 조립을 트리거할 수 있습니다. 대안적으로, 히스티딘 잔기를 가진 펩타이드는 특정 2가 금속 양이온과 배위 결합을 형성하여 자기 조립을 유도할 수 있습니다. 금속 이온은 펩타이드 사이의 정전기 반발력을 줄이고 상호 인력을 향상시켜 펩타이드 하이드로겔14의 형성을 유도함으로써 펩타이드 자체 조립을 촉진합니다. 이 방법은 특정 금속 이온이 필요한 응용 분야에 적합하지만 대부분의 생리학적 조건에서는 필요하지 않을 수 있으며 금속 이온을 쉽게 제거할 수 없습니다.
일부 고소수성 펩타이드는 먼저 수용성 유기 용매에 용해된 다음 원래 불용성인 수성 상에 첨가되어 펩타이드 하이드로겔을 빠르게 형성합니다. 그러나 많은 유기 용매는 특히 더 높은 농도에서 생물학적 응용 분야에 해로운 영향을 미칠 수 있습니다. 본원에 기술된 방법은 자기-조립된 펩티드에 특이적으로 적용된다. 펩타이드는 부작용을 최소화하면서 원하는 생물학적 기능을 달성하기 위해 앞서 언급한 유발 메커니즘을 기반으로 설계되었습니다.
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (Nos. 11674344 및 22201026)과 CAS, Frontier Sciences의 주요 연구 프로그램 (보조금 번호 QYZDJ-SSW-SLH019)의 지원을 받았습니다.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyl)triethoxysilane | Aladdin | A107147 | / |
| Atomic Force Microscopy | Bruker | Multimode Nanoscope VIII/ | |
| CaCl2 | Aladdin | C290953 | / |
| Diphenylalanine (FF) | Chinesepeptide | customizable | 순도 > 95% |
| DMSO | Sigma-aldrich | 34869 | / |
| ECF-5 펩티드 | 차이니즈펩타이드 | 서열: ECAFF | 순도 > 95% |
| 염산 | 알라딘 | H399657 | / |
| 운모 | 시그마-알드리치 | AFM-71856-02 | / |
| 인산염 완충 식염수 | 알라딘 | P492453 | / |
| 레오미터 | Anton Paar GmbH | MCR302 | / |
| 실리콘 캔틸레버 | MikroMasch | XSC11 | / |
| 염화나트륨 | 알라딘 | C111549 | / |
| 수산화나트륨 | 알라딘 | S140903 | / |
| TRIS 하이드로 클로라이드 | 알라딘 | T431531 | / |