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방법 논문

발달 중인 제브라피시 유충에서 조골세포의 Two-photon 레이저 매개 절제

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67279

⸱

2024년 9월 6일

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 제브라피시 유충에서 수행된 이광자 레이저 절제 접근법을 설명하며, 이는 뼈 재생과 절제에 대한 면역 반응의 효과를 연구하기 위한 모델 역할을 합니다.

초록

제브라피시(Danio rerio)는 다양한 장기와 부속기관을 재생하는 뛰어난 능력을 가지고 있습니다. 제브라피쉬의 뼈 재생은 지느러미 절단, 비늘 뽑기, 두개골 박리 및 현미경 접근법과 같은 다양한 방법을 사용하여 연구되었습니다. 이광자 레이저가 장착된 컨포칼 레이저 스캐닝 설정을 사용하여 제브라피시 유충의 발달 중인 배엽에서 뼈 형성 세포(조골세포)를 절제하는 병변 패러다임으로 레이저 절제 방법을 개발했습니다. 여기에 설명된 방법은 면적, 모양 및 깊이를 미세하게 조정할 수 있으므로 정확한 방식으로 세포를 절제할 수 있습니다. 또한 이 방법을 사용하면 절제 전후 부위를 이미징할 수 있으므로 부상의 단기적인 영향을 분석할 수 있습니다. 이 실험 설정에서는 손상 부위의 조골세포 절제 후 면역 반응을 연구했습니다. 절제 후 대식세포의 모집 증가가 관찰되었으며, 이는 뼈 재생 중 대식세포의 존재 관련성을 나타냅니다.

서론

제브라피쉬는 망막, 뇌, 심장, 췌장 등 다양한 장기를 재생한다1. 또한 제브라피쉬는 골격 요소를 재생하기 때문에 지느러미, 비늘 및 calvariae(두개골 모자)의 재생을 연구하는 데 사용되었습니다2. 지느러미 절제술(절단), 지느러미 골절, 두개골 절단술 3,4, 냉동 손상 5,6 또는 유전자 절제술 7,8,9와 같은 조직 및 뼈 재생을 연구하기 위해 다양한 실험 패러다임이 사용되었습니다. 최근에는 제브라피시에서 부상 후 치유 및 재생 반응을 연구하기 위해 레이저 절제 접근법이 널리 사용되고 있습니다 10,11,12,13,14.

레이저 매개 절제술은 기계생물학, 발달생물학, 재생연구 및 종양 수술과 같은 생물학 연구의 다양한 분야에서 사용되어 왔다 10,11,12,15,16,17,18,19. 레이저 절제에는 YAG(이트륨 알루미늄 가넷), UV(자외선) 또는 2p(이광자) 레이저를 사용하는 것과 같은 다양한 방법이 있다(20). 레이저 절제술은 단일 세포 또는 조직의 더 큰 부분을 매우 정확한 방식으로 제거할 수 있게 해주어 종양 절제21에 대한 면역 체계의 반응 또는 제브라피시 수술 재생 중 면역 체계의 반응과 같은 다양한 과정을 연구할 수 있습니다. 후자의 예에서, 절제는 핵 및 세포질 형광단 신호의 소실과 괴사 염색10,22에 의해 확인되었다.

선천성 면역 반응과 조절된 동역학이 적절한 조직 재생에 필수적이라는 것은 잘 알려져 있습니다. 호중구와 대식세포는 손상 부위에 모집되는 첫 번째 세포로, 사이토카인 및 성장 인자 방출, 세포 파편 제거, 세포외 기질 리모델링과 같은 다양한 역할을 수행합니다23. 이러한 모집 및 그에 따른 대식세포 기능화는 절단된 제브라피시 지느러미(24)와 발달 중인 제브라피시 지느러미(opercle)에서도 관찰되었으며, 레이저 '나노 해부'를 거쳐 조골세포 절제(osteoblast ablation) 10를 초래하였다. 후자의 실험에서는 UV 레이저 및 이광자 레이저 매개 절제 후 조골세포 수의 회복, 정상적인 수술 발달 및 선천성 면역 세포(호중구, 대식세포 및 파골세포 유사 세포)의 손상 부위 모집이 관찰되었습니다10. 글루코코르티코이드를 사용하여 면역 체계를 약리학적으로 억제한 제브라피시를 대상으로 한 실험에서는 면역이 잘못 조절되면 재생이 손상되는 것으로 나타났으며, 이는 조직 복구에서 면역 체계의 기능적 역할을 뒷받침합니다 3,10,25,26.

여기에서는 제브라피시 뼈 발달에서 뼈 재생의 생물학을 연구하기 위한 이광자 레이저 매개 절제 방법론에 대해 설명합니다. 특히, 수술부위에서 조골세포 절제술의 효과는 면역반응 측면에서 나타나며, 이는 절제 부위에 대한 대식세포의 모집을 모니터링하여 조사됩니다.

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프로토콜

연구 프로토콜은 Landesdirektion Sachsen의 승인을 받았으며 허가 번호는 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87입니다. 사용된 제브라피시 균주는 국내법에 따라 그리고 앞서 설명한 바와 같이 표준화된 조건 하에서 유지되었다27,28. 연구에 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 재료 및 용액의 준비

  1. 배아를 1x E3 배지에서 유지합니다. 170mL의 60x E3 스톡을 탈이온수 10L에 희석하고 2mL의 0.1% 메틸렌 블루를 첨가하여 1x E3 배지를 준비합니다.
    1. 탈이온수 30L에 NaCl 17.2g, KCl 0.76g, CaCl2·2 H2O 2.90g, MgSO4·7 H2O 4.90g을 혼합하여 1x E3 미디어 스톡을 준비합니다.
  2. 유충 매립을 위해 1% 저융점 아가로스(LMA)의 부분 표본을 미리 준비하고 실온에서 보관하십시오.
    1. 부분 표본을 준비하려면 LMA를 1x E3 매체에 용해시키십시오(예: 삼각 플라스크에 있는 1x E3 50mL에 LMA 500mg을 넣고 용액을 전자레인지에서 아가로스가 완전히 용해될 때까지 가열한 다음 1.5mL 튜브의 1mL 부분 표본에 분주합니다.

2. 제브라피시 사육 및 배아 채취

참고: 커밋된 조골아세포[osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 및 대식세포[mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23]의 존재를 보고하는 이중 형질전환 제브라피시 유충이 여기에사용되었습니다 (그림 1A).

  1. 짝짓기 전날 저녁에 표준 짝짓기 케이지에서 원하는 단일 전이유전자를 가진 부모 제브라피시를 설정합니다.
    참고: 표준 짝짓기 케이지를 사용하면 알이 부모 제브라피시가 도달할 수 없는 아래쪽 구획으로 통과할 수 있습니다.
    1. 짝짓기 케이지의 칸막이를 사용하여 짝짓기를 할 때까지 수컷과 암컷을 분리하십시오. 다음날 아침에 칸막이를 제거하여 짝짓기를 시작하십시오.
  2. 늦어도 정오에는 번식 탱크에서 부모 제브라피시를 제거하고 배아를 수집하여 체를 통해 짝짓기 케이지의 물을 걸러냅니다.
    참고: 유충의 정확한 나이가 결정적인 경우, 약 30분 간격으로 배아를 채취하십시오. 클러치 메이트는 다른 실험 그룹과의 실험에 사용해야 합니다.
  3. 배아를 1x E3 배지가 들어 있는 직경 100mm 접시에 넣고 28°C31의 인큐베이터에 보관합니다.
  4. 실체현미경의 도움으로 플라스틱 피펫을 사용하여 접시에서 수정되지 않은 난자와 죽은 배아를 제거하고 매일 1x E3 매체를 교체합니다.
  5. 실험 전에 형광 실체현미경을 사용하여 리포터 전이유전자에 대해 양성인 유충을 분류합니다.

3. 저융점 아가로스에 박힌 유충

  1. LMA 부분 표본을 써모블록 또는 65°C의 수조에서 녹입니다. LMA가 녹으면 매립될 때까지 42°C에서 유지합니다(그림 1B). 녹인 LMA 부분 표본 1mL에 0.4% MS-222 50μL를 첨가하여 마취를 위한 0.02% MS-222 농도를 얻습니다.
  2. 0.02% MS-222 E3 배지에서 4 dpf(수정 후 일수) 유충(또는 더 오래된 유충)을 마취합니다.
  3. 3mL 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 마취된 유충을 유리 바닥 마이크로웰 접시로 옮기고 동일한 피펫으로 과도한 E3 매체를 제거합니다(그림 1B). 유충이 마르지 않도록 하십시오.
    알림: 하나 이상의 유충이 동시에 접시에 박힐 수 있습니다. 배치에 충분한 시간을 허용하기 위해 3-5 마리의 유충을 포함하는 것이 좋습니다.
  4. 수조/써모블록에서 녹은 LMA 아가로스를 가져와 LMA의 (냉각) 방울을 접시에 넣고 유충이 있는 유리 바닥을 덮습니다. LMA는 너무 뜨겁지 않지만 여전히 액체입니다.
  5. 그런 다음 아가로스가 응고되기 전에 유충을 원하는 측면 위치에 놓습니다. 여기에서 역현미경 설정을 위한 준비로 조작부가 접시의 유리 바닥에 최대한 가까운 측면 위치를 확인하십시오(그림 1B).
  6. 아가로스를 응고시킨 다음 E3 매체(최대 0.02% MS-222 포함)를 접시에 추가하여 아가로스가 건조되지 않도록 합니다(그림 1B).

figure-protocol-1
그림 1: 임베딩 절차의 개략도. (A) 이중 유전자 변형 Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 녹색으로 표시된 외골세포와 빨간색으로 표시된 대식세포가 있는 제브라피시 유충을 사용했습니다. (B) 프로토콜의 3단계에서 설명한 대로 임베딩 절차의 작업 흐름. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 유충의 생체 내 이미징 및 레이저 절제

  1. 형질전환 제브라피시 Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30, 25x/0.95 수성 대물렌즈 또는 이와 동등한 설정이 있는 도립 이광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용합니다.
  2. 유충이 박힌 접시를 도립 현미경의 현미경 스테이지에 놓고 절제를 위해 원하는 영역을 시야 중앙에 배치합니다. opercle는 GFP 형광 신호의 도움으로 쉽게 식별 할 수 있습니다.
  3. opercle이 현미경의 시야에서 초점이 맞춰지고 중앙에 배치되면 z-stack 설정(종종 1-2μm z 간격이 사용됨)을 선택하여 opercle의 전체 너비를 이미지화합니다. 동시에 절제할 특정 z 평면의 영역(일반적으로 opercle의 후방 영역)을 선택합니다. 이광자 레이저 어블레이션은 이 평면에서만 발휘됩니다.
    참고: z 차원의 해상도가 높을수록 이미징 시간이 길어지지만 나중에 수집된 데이터의 체적 분석을 수행할 수 있습니다.
  4. 절제 전에 관심 영역을 이미지화합니다. GFP 검출의 경우 488nm의 백색광 레이저와 495nm에서 550nm 또는 이와 동등한 범위의 하이브리드 검출기를 사용하십시오. 하이브리드 검출기(또는 이와 동등한 검출기)에서 595 - 780 nm의 mCherry 검출 범위를 가진 555 nm(백색광 레이저) 여기를 사용하여 대식세포를 이미징합니다.
    1. 좋은 품질/시간 비율을 위해 이미지 형식 512 x 512를 사용합니다(더 높은 해상도 또는 더 빠른 속도가 필요한 경우 다른 형식을 사용할 수 있음).
      참고: 현미경에 설치된 온도 제어 인큐베이터를 사용하여 예를 들어 28°C까지 조정 할 수 있습니다.
  5. 선택한 2D 평면에 직경이 25μm(실험에 따라 다른 모양과 크기를 선택할 수 있음)의 원형 영역을 그리고 ROI 도구를 사용하여 조작부에 초점을 맞춥니다.
  6. 절제를 수행하려면 450mW에서 절제력(대물렌즈 없이 측정)을 적용하고 선택한 영역을 400Hz의 스캔 속도와 총 10초의 지속 시간으로 이광자 레이저에 노출시킵니다. 절제 중에는 401-443nm 또는 이에 상응하는 범위의 하이브리드 검출기를 사용하여 영역을 시각화할 수 있습니다.
  7. 절제 후에는 절제 전에 사용한 것과 동일한 설정으로 동일한 z-stack을 다시 이미징하여 절제를 구조적으로 확인합니다. 절제 부위에는 더 이상 형광 세포가 포함되어 있지 않습니다.

5. 면역 세포 모집을 모니터링하기 위한 유충 회수 및 이미징

  1. 면역 세포 모집의 이미징을 지연시켜 수행해야 하는 경우 이미징 및 마취에서 유충을 회수합니다. 겸자나 해개 바늘을 사용하여 LMA에서 유충을 조심스럽게 제거합니다.
    1. 먼저 유충을 덮고 있는 아가로스 층을 제거합니다. 둘째, 유충과 직접 접촉하는 아가로스를 제거합니다. 면역 세포 모집의 즉각적인 이미징이 이루어지는 경우 이 단계를 생략하십시오.
  2. 유충을 순수한 E3 배지가 있는 접시에 다시 넣고 회복을 확인합니다. 회복은 유충의 수영에 의해 분명합니다.
  3. 4 또는 6 hpl(병변 후 몇 시간)에서 동일한 현미경에서 동일한 설정을 사용하여 수술 부위를 다시 이미징하여 절제가 대식세포 모집에 미치는 영향을 확인합니다. 이렇게 하려면 이전에 수행한 대로 임베딩(3단계)과 이미징(4단계)을 반복합니다.
  4. 이미징 후 LMA에서 유충을 제거합니다. 유충의 희생은 법적 요구 사항에 따라 얼음물에서 배양하거나 E3에서 MS-222를 과다 투여하여 수행할 수 있습니다. 그런 다음 표본을 후속 연구에 사용하거나 폐기할 수 있습니다.

6. 이미지 분석 및 통계 분석

  1. Fiji32와 같은 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. 획득한 데이터의 z 해상도에 따라 2D 또는 3D로 분석을 수행할 수 있습니다.
  2. 주요 세포체를 식별하는 것과 같이 명확하게 분리된 세포를 포함하거나, 핵 라벨로 세포를 정량화하거나, 세포가 겹치는 경우 면적을 측정하여 대식세포를 수동으로 정량화합니다(다음 단계).
  3. 면적을 정량화하려면 대식세포를 둘러싸는 마스크를 만듭니다. 이렇게 하려면 이미지 > 임계값 조정 도구를 > 피지에서 ROI(분석 > 도구 > ROI 관리자 > 추가)를 만듭니다. 정량화를 위해 배경의 작은 입자를 제외합니다.
    1. 그런 다음 면적을 측정합니다(분석 > 측정). 겹치는 세포 형광 영역을 측정에 포함해야 하는지 여부를 고려하십시오.
      참고: 여기에서, 모집된 대식세포는 이 영역에서 구별될 수 없기 때문에 원형 절제 영역은 면적 측정에서 생략되었습니다.
  4. 적절한 소프트웨어를 사용하여 측정 결과를 플로팅하는 그래프를 생성합니다. 절제 전과 후의 데이터를 비교하려면 적절한 통계적 검정을 수행하십시오(여기서는 쌍을 이루는 단측 t-검정 이 수행됨).
    참고: 그림은 사진 편집 및 그래픽 디자인 소프트웨어를 사용하여 준비할 수 있습니다.

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결과

레이저 절제술은 위의 프로토콜에 표시된 대로 수행되었습니다. 절제 부위의 조골세포의 GFP 신호는 절제 후 즉시 사라졌습니다. 면역 반응 측면에서 조골세포 절제의 반응을 연구하기 위해 6 dpf 유충에서 6 hpl 전과 6hpl에서 대식세포의 존재를 이미지화했습니다. 절제 전에는 수술 영역(opercle area) 10 에서 대식세포가 거의 관찰되지 않았습니다(그림 2). 6 hp에서, 절제된 opercle 영역에 대식세포가 강하게 축적되고 opercle 및 opercle 주변 영역을 포함하여 시야에서 대식세포의 수가 증가하는 것이 감지되었습니다10 (그림 2).

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토론

레이저 절제술은 생물학 연구의 다양한 분야에 적용되어 왔습니다. 특히, 조직 재생을 연구하는 방법으로 유용하였다10,11,12. 예를 들어, 선천성 면역 세포의 모집 및 표현형 변화는 최근에 레이저 절제 부위(10)에서 조골세포의 회수와 함께 UV 레이저 또는 이광자 레이저 절제 분석을 사용하여 시간 경과에 따른 분석을 수행했습니다. 면역 세포 모집의 실시간 이미징은 병변 후 최대 12시간(hpl)까지 수행되었습니다. 그러나 더 긴 이미징 기간은 마취의 적절한 조정과 해당 당국의 승인을 통해 구상할 수 있습니다. Geurtzen et al.에서는 레이저 절제 후 최대 며칠까지 분석을 수행하여 절제 부위의 염증성 환경을 정의하고 뼈 재생에서 대식세포의 지지 역할을...

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공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 독일 연구 재단(DFG) Transregio 67(프로젝트 387653785), DFG SPP 2084 μBone(프로젝트 KN 1102/2-1)의 지원을 받았습니다. 이 작업은 TU Dresden의 CMCB 기술 플랫폼의 핵심 시설인 Light Microscopy Facility(DFG 프로젝트 413875620)의 지원을 받았습니다. TU 드레스덴의 작업은 작센 의회 ( 'Landtag')가 합의 한 예산에 기반한 세금 수입으로 공동 자금을 조달했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
염화칼슘 이수화물, CaCl2· H2OCarl Roth5239.1
세포 배양 접시, PS, 100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 FocepsFST11295-51팁 모양 직선, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm
Falcon 6웰 플레이트Corning353502
유리 바닥 마이크로웰 접시MatTekP35G-1.5-14-C35mm 접시, No. 1.5 커버슬립, 14mm 유리 직경, 코팅되지 않은
Insight X3 다광자 레이저Spectra-Physics
Leica 응용 제품군LAS X, Leica Microsystems
저융점 아가로스 Biozyme840101Biozym 플라크 아가로스
마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트, MgSO4· 7H2OSigma-AldrichM5921
메이팅 케이지다양한 종류(예: Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA, AldrichA5040
염화칼륨, KCl,PanReac AppliChem131494
염화나트륨, NaClCarl Roth3957.1
SP8 팔콘 라이카 마이크로시스템Insight X3 다광자 레이저 및 라이카 애플리케이션 제품군 소프트웨어
장착 스테인리스 스틸 해부 바늘Bochem12010140mm
실체 현미경 시스템 SZX16올림푸스LED 조명 베이스 장착 SZX2-ILLTQ
온도 조절 캐비닛 TS - WTW물관부TS 608/2-i배양(배아)
이식용 피펫, 3.5 mLSARSTEDT861171155 x 15 mm, LD-PE, 투명
Zeiss SteREO Discovery.V12 버전 4.7.1.0.ZeissAxiocam MRm 카메라 및 AxioVision 소프트웨어 탑재
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참고문헌

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