방법 논문

반복적인 착상 실패가 있는 여성의 다중형 형광 면역조직화학적 염색을 사용한 4가지 자궁 NK 세포 아형 측정

DOI:

10.3791/67284

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2024년 10월 25일

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1Department of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Department of Pathology, School of Clinical Medicine, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, 3Reproduction and Development Laboratory, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Sciences, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 5Chinese University of Hong Kong - Sichuan University Joint Laboratory in Reproductive Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 6Laboratory for Reproductive Immunology, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, 7NHC Key Lab of Reproduction Regulation, Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, Fudan University, 8Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University

이 논문에서

요약

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이 연구는 고급 다중 형광 면역조직화학 염색 기술을 사용하여 착상 기간 동안 자궁 자연 살해 세포 하위 집합을 정량화하는 선구적인 방법을 제시합니다.

초록

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면역조직화학(IHC)은 생물학 연구 및 임상 진단에서 중요한 역할을 하며, 조직 항원을 식별하고 시각화하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나 기존의 IHC 염색 방법은 면역 세포의 다양한 하위 유형을 구별하는 데 한계가 있습니다. 이러한 과제로 인해 과학자들은 면역 세포 아형의 정확한 식별 및 분화를 위한 새로운 기술과 방법론을 탐구하게 되었습니다. 최근 몇 년 동안 멀티플렉스 IHC가 동일한 조직 샘플 내에서 여러 항원을 동시에 검출하고 시각화할 수 있는 솔루션으로 부상했습니다. 자궁 자연살해(uNK) 세포는 탈이원화(decidualization), 자궁 나선형 동맥 리모델링, 배아 착상 등 임신 초기 과정에서 중추적인 역할을 합니다. uNK 세포의 아형에 따라 기능이 다르기 때문에 성공적인 배아 발달과 임신을 위해 다양한 생물학적 사건을 조정할 수 있습니다. 따라서 임신 중 면역 조절 기전을 규명하기 위해서는 uNK 세포 아형에 대한 심도 있는 연구가 필수적입니다. 이러한 연구는 불임 및 재발성 생식 부전과 같은 관련 상태를 해결하기 위한 귀중한 통찰력과 새로운 접근 방식을 제공합니다. 이 논문은 이식 기간(WOI) 동안 자궁내막 검체에서 uNK 세포의 4가지 하위 유형 밀도를 연구하기 위한 상세한 다중 IHC 염색 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜에는 시료 준비, subtype marker 최적화, 현미경 이미징 및 데이터 분석이 포함됩니다. 이 멀티플렉스 IHC 염색 프로토콜은 높은 특이성과 감도를 제공하여 다양한 uNK 세포 아형을 동시에 검출할 수 있도록 하여 연구자에게 임신 중 면역 조절의 복잡성과 메커니즘을 탐구할 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.

서론

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체외 수정-배아 이식(IVF-ET) 후 최초로 기록된 출생은 1978년에 보고되었습니다. 지난 40년 동안 불임 부부 사이에서 IVF-ET의 도움에 대한 수요가 높았습니다1. 2021년에는 미국에서 238,126명의 환자가 총 413,776회의 IVF 주기를 시작했습니다. 이는 2년 전보다 25%, 2012년 대비 135% 증가한 수치입니다2. 이러한 급증은 주로 불임 유병률의 증가와 임신 계획 지연에 기인합니다. 배아 배양 기술과 과배란 프로토콜의 발전으로 ET 주기당 출생률이 증가하여 40세 미만 여성의 경우 30%-50%, 40세 이상 여성의 경우 30% 미만에 이르렀습니다2. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 이식된 배아의 절반 이상이 여전히 착상에 실패하고 있습니다. 반복성 착상 실패(RIF)는 일반적으로 고품질 배아를 3회 이상 연속으로 이식하려는 시도 후 실패로 정의되며, IVF-ET3를 받은 여성의 15%에 영향을 미친다. RIF가 있는 부부는 매우 취약하며 과도한 위험에 노출될 수 있는 비싸고 불필요한 시술을 받는 경향이 더 많습니다4. 따라서 RIF의 원인을 이해하고 배아 착상을 개선하는 것은 특히 RIF가 있는 여성의 경우 IVF-ET의 성공을 높이는 데 매우 중요합니다. 자궁내막의 준비는 성공적인 배아 착상을 위해 매우 중요합니다. 이 과정은 자궁자연살해(uNK) 세포의 상당한 축적을 특징으로 하며, 이 세포는 분비 중기 동안 자궁내막의 총 림프구의 30%를 구성하던 것에서 임신 초기에는 낙엽의 70%-80%로 전환된다5. 특히 uNK 세포는 선천성 면역 체계에 중요한 세포독성 림프구인 말초 NK 세포와 다르며, 이는 용해 또는 세포 사멸을 통해 감염된 세포를 사멸시킵니다. uNK 세포의 정확한 기능은 아직 완전히 밝혀지지 않았지만, 여러 증거에 따르면 uNK 세포는 혈관 신생 재형성, 영양 세포 침습 및 태아 발달에 관여한다6. 기질 세포에 대한 uNK 세포의 비율과 RIF 사이의 연관성은 지난 20년 동안 광범위한 관심을 끌었습니다. 604명의 여성을 대상으로 한 8건의 연구가 포함된 최근의 메타 분석에 따르면, RIF 감염 여성은 황체 중기에 CD56+uNK 세포의 밀도가 가임 대조군에 비해 유의하게 증가하는 것으로 나타났다7. 그러나 황체기 중기에 있는 uNK 세포의 특징은 낙엽 NK 세포(dNK) 세포의 특성과 크게 다르다는 점에 유의해야 합니다. 임신 후 uNK 세포가 dNK 세포의 다양한 부분집합으로 더 분화할 수 있지만, uNK 세포를 단독으로 측정하는 것만으로는 dNK 세포를 정확하게 나타낼 수 없다8. uNK 세포는 동적 분화를 거치고 월경 주기와 탈결 과정에서 다양한 역할을 하기 때문에 CD56만으로 식별할 수 있는 것보다 더 복잡합니다. 자궁내막 준비 중 uNK 세포의 거동을 종합적으로 이해하기 위해서는 여러 마커가 필요합니다. 우리의 최근 연구는 월경 주기 전반에 걸쳐 uNK 세포의 다양성을 확인하기 위해 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용했습니다. 유세포 분석을 사용하여 검증된 결과, uNK 세포의 4가지 뚜렷한 아형이 존재하며, 각 아형은 월경 주기 동안 동적 변화를 나타낸다9. 유전자 농축 분석 및 유전자 온톨로지 기능 강화는 이러한 uNK subset이 월경의 다양한 단계에서 다른 기능을 수행한다는 것을 나타냅니다. 그럼에도 불구하고 유세포 분석은 임상 실험실에서 보편적으로 접근할 수 없으며, 효소 소화를 위해 새로운 자궁내막 조직을 즉시 처리하기 때문에 오류 발생 시 실험 단계를 반복할 수 없습니다.

따라서 이 연구의 목적은 보다 실용적인 진단 접근법을 제공하는 다중 염색 분석을 사용하여 NK 세포의 이러한 4가지 하위 집단의 측정값을 조사하는 것이었습니다. 다중 염색에서는 각 표적에 대한 서로 다른 특정 항체가 특정 파장의 빛에 의해 여기될 때 다른 파장의 빛을 방출하는 서로 다른 형광단 라벨에 연결됩니다. 기존의 IHC 염색법과 비교했을 때, 이 방법은 샘플에서 여러 표적의 상대적 존재도와 분포를 정량적으로 비교하고 서로 다른 표적의 상호 작용 및 공동 국소화에 대한 정보를 제공하여 uNK 세포의 다양한 하위 유형을 식별할 수 있습니다. 이 접근법은 uNK 세포와 RIF 간의 관계에 대한 이해를 심화시킬 뿐만 아니라 자궁내막 관련 질환에서 다른 면역 세포 하위 집단을 조사하기 위한 통찰력을 제공할 것입니다.

프로토콜

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이 연구는 Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee(CREC 참조 번호: 2022.581)의 승인을 받았습니다. RIF를 가진 여성은 홍콩 중문대학교의 프린스 오브 웨일즈 병원(Prince of Wales Hospital)의 보조생식기술센터(Assisted Reproductive Technology Center)에서 모집되었습니다. RIF는 40세 미만의 여성에서 최소 3회의 신선 또는 냉동 주기를 통해 최소 4개의 양질의 배아를 이식한 후 임상적 임신을 달성하지 못하는 것으로 정의되었다10. 자궁내막 생검을 수집하기 전에 참가자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 자궁내막 검체의 채취 및 처리

  1. 자궁내막 검체 채취 시기
    1. 연구 참가자 간의 일관성을 보장하기 위해 엄격한 프로토콜에 따라 자궁내막 샘플을 수집합니다. 자연 주기가 있는 환자의 경우 월경 주기9일째부터 소변 검사를 실시하고 LH 급증(LH+7)11 후 7일째 되는 날에 자궁내막 생검을 실시합니다. 호르몬 대체 요법(HRT) 주기를 받는 환자의 경우, 월경 주기 2일째부터 매일 6mg의 에스트라디올 발레레이트를 경구 투여합니다.
    2. 월경 주기의 13일째에 초음파로 자궁내막 두께를 평가합니다. 자궁내막 두께가 8mm에 도달하거나 초과하면 프로게스테론을 질식으로 투여하고 프로게스테론 투여 5일 후 자궁내막 생검을 실시한다12.
  2. 자궁내막 검체 채취 및 고정: 피펫 샘플러를 자궁강에 도입하여 자궁저부 영역으로 전진시킵니다. 내부 플런저를 아래로 당겨 흡입을 가하는 동시에 자궁강 내의 회전 및 수직 움직임을 통해 자궁내막 표면을 긁어냅니다. 채취한 검체를 생리식염수로 헹구어 자궁경부 및 자궁 분비물을 제거합니다. 샘플을 측정하고 크기를 평가합니다. 3 mm x 15-25 mm 샘플의 경우 즉시 10 mL의 10% 중성 완충 포르말린에 담그고 실온에서 24-48시간 동안 고정합니다.
  3. 탈수: 고정이 완료되면, 샘플을 대상으로 물을 에탄올로 대체하도록 고안된 탈수 과정을 거칩니다. 이렇게 하려면 조직을 70%, 80%, 90% 및 100% 에탄올 욕조에 담가 완전한 탈수를 보장합니다. 최종 에탄올 수조 후 자일렌의 샘플을 청소하여 잔류 알코올을 제거하고 파라핀 침투를 준비합니다.
  4. 임베딩: 조직을 금형 바닥에 평평하게 놓은 후 파라핀을 녹이고 조심스럽게 샘플에 추가하여 자궁내막 조직이 파라핀 매트릭스에 완전히 캡슐화되도록 합니다. 금형에 파라핀 왁스를 채운 후 냉동 테이블에서 냉각하여 파라핀 왁스의 응고를 촉진합니다. 파라핀 블록이 굳으면 추가 처리가 필요할 때까지 실온에서 보관하십시오.
    참고: 사용된 금형은 자궁내막 조직이 접히지 않고 바닥에 평평하게 놓일 수 있도록 얻어진 자궁내막 샘플의 크기를 수용하기 위해 특별히 선택되었으며, 따라서 불필요한 과잉을 생성하지 않고 후속 절편을 위한 최적의 방향을 보장합니다.
  5. 절단: 절단을 준비하려면 파라핀 블록을 4°C에서 2시간 동안 냉장 보관합니다. 마이크로톰을 사용하여 샘플을 4μm 섹션으로 자른 다음 42°C로 데운 증류수 표면의 슬라이스를 평평하게 펴고 접착 유리 슬라이드에 장착합니다. 슬라이스를 슬라이드 건조기에 밤새 올려 놓고 사용하기 전에 실온에서 보관하십시오.

2. 다중 면역조직화학 조건의 최적화

  1. IHC 검증: IHC 염색 파라미터의 검증을 위해 항원 검색, 항체 농도 및 배양 시간에 대한 조건을 미세 조정하기 위한 체계적인 접근 방식을 채택합니다.
    1. 제조업체의 권장 희석 범위 내에서 각 항체에 대해 2-3 농도를 테스트합니다. pH 6 및 pH 9에서 완충액을 비교하여 항원 회수를 최적화하고, 실온에서 1.5시간 및 4°C에서 야간에 배양 프로토콜을 평가합니다.
    2. 염색 강도, 특이성 및 배경 소음에 중점을 두고 각 상태를 꼼꼼하게 평가합니다. 최소한의 비특이적 결합으로 가장 명확하고 특이적인 염색을 제공하는 최적의 조합을 선택하십시오. 이 엄격한 검증은 IHC 프로토콜에서 최고의 정확성과 재현성을 보장했습니다.
  2. 티라미드 신호 증폭(TSA) 모노플렉스 염색: 개별 항체에 대한 최적의 염색 파라미터를 결정한 후 다른 TSA 염료와 항체의 쌍을 최적화합니다. 발현이 더 높은 마커를 형광 강도 수준이 더 낮은 염료와 짝을 이루거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 이 단계에서는 관찰된 형광 신호 강도에 따라 항체 농도와 배양 시간을 조정합니다. 중요한 배경 또는 비특이적 염색이 관찰되면 쌍을 이루는 염료13을 변경하십시오.
  3. TSA 다중 염색: 다중 면역조직화학(m-IHC) 프로토콜의 경우, 확립된 원칙에 따라 염색의 순차적 순서가 신중하게 정의되었습니다. multiplexing 과정이 single-label staining의 민감도와 특이성을 반영하도록 하기 위해, 염색 시퀀스 시작 시 발현 수준이 낮은 항체를 우선적으로 선택했습니다. 염기 복구가 필요한 항체는 염기 복원이 경우에 따라 비특이적 염색 아티팩트를 증폭할 수 있는 산 기반 방법에 비해 강력하기 때문에 항원 회수를 위해 염기 복구가 필요한 항체를 염색 시퀀스의 끝에 배치합니다.
  4. 2.1 및 2.2 단계의 결과를 사용하여 항원 검색 요구 사항 및 발현 밀도를 기반으로 사용할 항체와 단계를 결정합니다. 예를 들어, 항원 회수를 위해 염기 복구가 필요한 CXCR4 항체는 염색의 최종 단계에 배치되었습니다. 반대로, 낮은 발현 밀도를 특징으로 하는 CD49a 항체는 염색 서열에서 첫 번째 위치를 차지합니다. 성공적인 탐지 가능성을 최대화하고 다중화 절차의 후반 단계에서 발생할 수 있는 마스킹 효과를 최소화합니다.
  5. 나머지 항체의 경우 최적화 단계에서 다양한 조합을 테스트하여 민감도와 특이성의 균형을 맞추는 가장 효과적인 염기서열을 결정합니다. 이러한 비교 분석의 결과는 표 1에 자세히 설명된 대로 멀티플렉스 패널의 최종 구성을 안내하여 선택한 패널이 배경을 최소화하면서 최적의 성능을 제공하는지 확인합니다.

3. m-IHC 프로세스

  1. 탈랍, 수분 공급 및 고정: 조직 절편을 60°C에서 2시간 동안 굽은 다음 자일렌 I(10분), 자일렌 II(10분), 100% 에탄올(5분), 95% 에탄올(5분), 80% 에탄올(5분), 75% 에탄올(5분), ddH2O(3x의 경우 2분), 10% 중성 완충 포르말린(최소 20분), 및 ddH2O(2x의 경우 3분).
  2. 항원 회수: 각 항체에 대해 표 1 에 나열된 대로 각각의 AR6 또는 AR9 완충액 200mL를 내열성 항원 회수 카세트에 추가합니다. 섹션을 적절한 항원 검색 버퍼에 넣고 끓을 때까지 약 2분 동안 고출력의 전자레인지에서 가열합니다. 그런 다음 카세트를 느슨하게 덮고 저전력으로 15분 동안 가열한 다음 실온으로 식힙니다. ddH2O 및 PBST로 절편을 헹굽니다.
  3. 소수성 장벽 그리기: 흡수성 종이로 여분의 용액을 제거한 후 소수성 장벽 펜을 사용하여 조직 주위에 완전한 원을 그립니다.
  4. 내인성 효소 활성의 불활성화: 절편을 3% 과산화수소로 처리하고 실온에서 8분 동안 배양합니다. PBST로 각각 2분씩 3회 세척합니다.
  5. 비특이적 부위 차단: 흡수지로 건조 후 차단액(1x Antibody Diluent/Block)을 도포하고 상온에서 10분간 배양합니다.
  6. 1차 항체로 배양: 차단 용액을 제거한 후 첫 번째 1차 항체인 CD49a 150 μL를 1x Antibody Diluent에서 1:1000으로 희석하여 각 슬라이드에 적용합니다. 섹션 2에서 이전에 최적화한 대로 배양합니다. 배양 후 PBST로 슬라이드를 각각 2분 동안 3회 세척합니다. 나머지 항체에 대해서는 특정 희석 비율에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
  7. 2차 항체로 배양: 2차 항체를 적용하기 전에 흡수지를 사용하여 과도한 수분을 제거하여 시약의 희석을 방지합니다. 각 슬라이드에 1x Anti-Ms + Rb HRP 2차 항체 4-5방울(약 150μL)을 첨가한 후 실온에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 각 2분 동안 PBST로 3회 세척합니다.
    참고: 1x Anti-Ms + Rb HRP 2차 항체는 토끼 및 마우스 1차 항체에 특이적입니다.
  8. TSA 염료로 신호 증폭: 과도한 수분을 블로팅한 후 증폭 희석액에 TSA 염료를 1:100으로 희석합니다. 이 희석된 TSA 염료 용액 150μL를 각 슬라이드에 추가합니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다. PBST로 각각 2분씩 3회 세척합니다.
  9. 해당 항체 및 염료를 사용하여 TSA 절차에 대해 3.2 및 3.5-3.8 단계를 반복합니다.
  10. 염색 핵: 마지막 항체를 염색한 후 내열 카세트 내의 AR6 완충액 200mL의 섹션을 전자레인지에 돌리고 2분 동안 끓인 다음 15분 동안 저전력 가열하여 결합되지 않은 형광단을 제거합니다. 샘플을 실온으로 냉각하고 ddH2O 및 PBST로 헹굽니다. PBST(1:10)에 희석한 DAPI 작업 용액 150μL를 적하에 넣고 실온에서 10분 동안 배양한 다음 ddH2O로 2배 헹굽니다.
  11. 장착: 섹션이 어두운 곳에서 약 30분 동안 완전히 공기 건조되면 담금질 방지 형광 마운턴트를 한 방울(약 30μL) 바르고 커버슬립을 놓습니다.
    알림: TSA 염료를 처음 도포한 후에는 모든 작업을 빛으로부터 보호하십시오. 신속한 관찰과 이미지 캡처는 형광 소멸을 방지하기 위해 염색 후 완료에 필수적이었습니다.

4. 이미지 획득 및 분석

  1. Exposure time(노출 시간): 형광단에 해당하는 excitation 및 emission 파장을 상속하는 이미저를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 노출 시간을 설정할 때 정확성을 보장하기 위해 다양한 마커 표현이 있는 슬라이드를 확인하십시오. 각 마커/필터 조합에 대해 슬라이드의 다른 영역에 수동으로 초점을 맞춥니다. 자동 노출 기능을 사용하여 노출 시간을 설정합니다.
  2. TSA 염료에 따라 필터를 선택하고 여러 슬라이드를 검사하여 채널당 최적의 노출 시간을 결정합니다. 이러한 설정을 모든 후속 획득에 일관되게 적용하여 이미징 전반에 걸쳐 비교 가능성을 유지할 수 있습니다.
  3. 캡처 영역 선택: 조직 절편 전반에 걸쳐 편향되지 않은 샘플링을 보장하고 분석된 각 필드에 발광 상피를 일관되게 포함하려면 이미지 획득을 위한 초기 영역을 무작위로 선택하며, 중요한 기준은 발강 상피 경계의 존재입니다.
  4. 이 초기 필드를 캡처한 후에는 프레임 내의 내강 상피 테두리를 유지하면서 하나의 필드를 시작점의 왼쪽 또는 오른쪽으로 이동하여 후속 영역을 체계적으로 선택합니다(캡처된 각 이미지 사이에 하나의 필드 생략). 이 프로세스를 반복하여 각각 발광 상피의 적어도 일부를 포함하는 최소 5개의 서로 다른 영역을 캡처하여14개 전체에 걸쳐 일관된 분석 깊이를 유지합니다. 이 접근 방식은 포괄적이고 대표적인 데이터 수집을 보장하기 위해 캡처된 모든 필드에 걸쳐 최소 약 10,000개의 기질 세포를 포함하는 것을 목표로 했습니다.
  5. 이미지 분석
    1. 이미지 준비: 다중 스펙트럼 이미지를 가져오고 분석하려면 먼저 소프트웨어 인터페이스에서 File > Open Image로 이동하여 파일과 자가형광(AF) 슬라이드를 로드합니다. 이미지를 업로드한 후 Select Fluors 버튼을 클릭하고 적절한 스펙트럼 라이브러리를 선택하여 형광단의 혼합을 해제합니다. 모든 형광단이 선택되면 OK(확인)를 클릭하여 선택을 확인합니다. AF 스펙트럼을 분리하려면 AF 스포이드 도구를 사용하여 AF 이미지에서 대표적인 조직 영역을 샘플링하고 조직이 아닌 픽셀은 제외하도록 주의합니다. 샘플링 후 인터페이스15의 왼쪽 하단 모서리에 있는 이미지 준비 또는 모두 준비를 클릭합니다.
    2. 조직 분할: 상피 세포가 포함된 상피 영역, 기질 세포가 포함된 기질 영역 및 세포 함량이 없는 빈 영역을 포함하여 이미지 내에서 조직 유형당 3-5개 영역의 기준선을 수동으로 묘사하여 분할 프로세스를 시작합니다. 초기 세분화 결과가 만족스럽지 않은 경우 추가 영역에 수동으로 주석을 달아 훈련 데이터 세트를 개선함으로써 후속 분석의 정확성과 신뢰성을 높일 수 있습니다. 이러한 영역과 파라미터의 동적 조정은 소프트웨어가 현재 및 다른 가져온 이미지에서 유사한 구조를 자동으로 식별하여 향상된 정확도로 식별할 수 있도록 합니다.
      참고: 초기 주석은 소프트웨어가 각 조직 구성 요소의 특성을 학습하기 위한 교육 데이터 세트 역할을 합니다. 그런 다음 소프트웨어의 세분화 기능은 조직의 복잡성과 변동성에 따라 반복적으로 개선됩니다.
    3. Cell Segmentation(셀 분할): Segment Cells(셀 세그먼트)를 클릭하여 셀 분할을 시작합니다. Cell Segmentation Setting(세포 분할 설정)에서 Nuclei and Membrane(핵 및 멤브레인)을 선택합니다. DAPI를 선택하여 세포핵을 식별하고 배경 잡음 없이 모든 세포핵을 검출하도록 강도 설정을 조정합니다. CD16, CD49a 및 CD56 신호를 선택하여 멤브레인을 찾고 이 신호를 사용하여 핵 분할을 지원합니다. 핵 구성 요소 분할 기능을 사용하여 밀접하게 위치한 핵을 구별할 수 있습니다.
      참고: DAPI는 셀 내부를 강조 표시합니다. 핵 구성 요소 분할 기능은 세포핵이 서로 가까이 있거나 병합된 것처럼 보일 때 세포핵을 구별하는 데 도움이 됩니다. 이 단계는 신뢰할 수 있는 세포 수를 얻고 분석의 무결성을 유지하는 데 중요합니다.
    4. 세포 표현형: CD56, CD49a, CXCR4 및 CD16을 포함한 4가지 세포 표면 마커를 채택하여 NK 세포의 다양한 아형을 구별합니다. Phenotyping Scheme에서 이 4개의 마커를 진행할 표현형으로 레이블을 지정합니다. Associate View 섹션에서 식별을 위해 각 표현형에 특정 색상을 할당합니다. Add 버튼을 사용하여 셀을 마커를 양수 또는 음수로 표현하는 것으로 분류합니다. 예를 들어, CD56 표현형에서 세포는 CD56+ 또는 CD56-로 표지될 수 있습니다. 훈련 과정에서 각 표현형에 대해 최소 5개의 세포를 수동으로 레이블링합니다. 초기 훈련에서 효과적인 결과를 얻지 못하는 경우 추가 수동 레이블 지정을 수행합니다.
    5. 세포 표현형 구성이 설정된 후 이미지의 각 셀은 4개의 표면 마커가 양수 또는 음수로 발현되는지 여부를 나타냅니다. 추가 분석을 위해 결과 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
    6. 데이터 처리: 모든 이미지에서 얻은 데이터를 스프레드시트로 가져와 처리합니다. 이미지의 총 셀 수를 기준으로 모든 uNK 셀 하위 유형의 백분율을 계산합니다. 최종 세포 수는 여러 이미지의 평균 세포 수를 나타내며 샘플 내 다양한 uNK 세포 아형의 모집단에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다.

결과

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자연 주기를 겪는 여성의 자궁내막 검체 채취 시기의 일관성을 유지하기 위해 황체 형성 호르몬(LH) 급증을 정확하게 감지하기 위해 소변 검사를 수행했으며, LH 급증 후 7일 후에 자궁내막 생검을 실시했습니다. HRT 주기를 겪는 여성의 경우, 프로게스테론 보충이 시작된 후 정확히 5일 후에 샘플을 예약했습니다. 자궁내막에 있는 NK 세포의 다양한 아형을 정량화하기 위해 m-IHC 염색이 사용되었습니다. 실험 절차의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

실험 절차의 최적화는 실험 결과의 정확성과 일관성을 보장하기 위해 고품질 m-IHC 염색 결과를 달성하는 데 매우 중요합니다. 처음에는 항원 회수 용액 AR6 또는 AR9를 선택하여 적절한 항체 농도를 결정하기 위해 IHC를 사용했습니다. CD56, CD16 및 CD49와 같은 항체의 경우 pH 6의 항원 회수 용액을 권장하는 반면, CXCR4 항체의 경우 pH 6 완충액에 비해 pH 9의 항원 복구 용액을 사용하여 우수한 염색 결과를 얻을 수 있었습니다. 항체 희석 비율, 배양 시간 및 항원 회수 조건을 포함한 매개변수가 결정되면 항체의 친화도에 따라 가장 적합한 TSA 염료를 선택할 수 있습니다. 항체의 높은 친화력을 보완하기 위해 형광 밝기가 약한 염료를 선택해야 합니다. TSA 염료의 신호 강도에 대한 참조 데이터는 표 2에서 찾을 수 있습니다. TSA 모노플렉스 분석이 완료된 후 TSA 멀티플렉스의 순서를 결정할 수 있습니다. 4개의 항체가 uNK 세포의 서로 다른 아형을 식별하도록 설계되었다는 점을 감안할 때, 항체 간의 공동 국소화는 불가피합니다. 스펙트럼 중복을 최소화하고 형광 부분 간의 간섭을 방지하기 위해 파장이 가능한 한 멀리 떨어진 형광 부분을 선택하고, TSA 멀티플렉스의 포지티브 신호의 위치 및 수를 TSA 모노플렉스의 신호와 비교하여 식별을 확인하고(그림 2), 명확한 배경을 보장(그림 3)16 전략을 사용했습니다.

m-IHC 염색 절차의 최적화 및 완료 후 이미징 워크스테이션을 이미지 획득에 사용하고 이미지 분석 소프트웨어를 적용하여 이미지의 심층 분석을 수행했습니다(그림 4). uNK 세포의 분류를 위해 전통적인 방법과 혁신적인 방법이 모두 사용되었습니다. 전통적인 분류는 NK 세포를 CD16의 발현 수준에 따라 CD56+CD16- 및 CD56+CD16+17의 두 가지 범주로 나눕니다. 이러한 토대 위에서 우리는 새로운 분류 전략을 사용하여 NK 세포 이질성을 더욱 명확하게 설명하고자 했습니다. 이전 연구의 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq)을 사용하여 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)로 개별 NK 세포를 분리하고 RNA 염기서열분석을 수행하여 각 세포의 전사체 프로필을 캡처했습니다. 분석 결과, NK1(CD56+CD49a+CXCR4-), NK2(CD56+CD49a+CXCR4+), NK3(CD56+CD49a-CXCR4-), NK4(CD56+CD49a-CXCR4+)의 4가지 뚜렷한 NK 세포 아형이 발견되었다. 이러한 아형은 CD49a와 CXCR4의 차등 발현을 특징으로 하며, CD56은 모든 NK 세포에 대한 보편적인 마커 역할을 합니다. CD49a는 NK1 및 NK2 아형에서 특이적으로 검출된 반면, CXCR4는 NK2 및 NK4 아형에서 검출되었습니다. 이 분류를 검증하기 위해 유세포 분석을 수행하여 서브타이핑 방법의 정확성을 확인했습니다(그림 5)9. 각 uNK cell subtype의 비율은 총 기질 세포 수에 대한 백분율로 표시됩니다.

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그림 1: 자궁내막 NK 세포 분석의 워크플로우 다이어그램. 주요 단계에는 자궁내막의 획득 및 수집, m-IHC 패널의 최적화, 자궁내막의 m-IHC 염색, 이미지 획득 및 분석이 포함됩니다. Created with BioRender.com 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: DAB, TSA monoplex 및 TSA multiplex staining을 통한 바이오마커의 정량화를 위한 대표 이미지. DAB(왼쪽 패널), TSA monoplex IHC(중간 패널) 및 TSA multiplex IHC(오른쪽 패널)로 염색된 각 항체의 대표 이미지는 m-IHC의 발달을 통해 최소한의 편차를 보여주었습니다. 아래의 TSA 시뮬레이션 IHC 이미지는 해당 명시야 이미지를 매우 모방합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 자궁내막의 m-IHC 염색 후 실험 결과. (A) 이미저를 사용하여 200x 배율로 혼합되지 않은 이미지를 획득했습니다. (B) 이 혼합되지 않은 이미지의 추가 확대. (C-F) 이미징 소프트웨어를 사용하여 혼합을 해제한 후 TSA 염료 570(CD16), TSA 염료 650(CD56), TSA 염료 620(CXCR4) 및 TSA 염료 520(CD49a) 채널에서 이미지를 관찰했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: m-IHC 염색 이미지 분석. 이미지는 이미징 소프트웨어의 (A) 조직 분할, (B) 세포 분할 및 (C) 세포 표현형 기능을 사용하여 분석되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 자궁내막 NK 세포의 아형 분석. (A) 기존의 자궁내막 NK세포는 CD16 발현에 기초하여 CD56+CD16-NK세포와 CD56+CD16+NK세포로 분류할 수 있다. (B) 혁신적인 아형 분석법은 자궁내막 NK 세포를 NK1(CD56+CD49a+CXCR4-), NK2(CD56+CD49a+CXCR4+), NK3(CD56+CD49a-CXCR4-), NK4(CD56+CD49a-CXCR4+)의 4가지 범주로 분류했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

염색 주기마커클론회사제품항체 희석AR 버퍼형광단
1CD49a (CD49a)씨엘7207노부스 바이오로직스NBP2-764781:1000AR6TSA 520
2CD56 (CD56)CD564 시리즈라이카NCL-L-CD56-5041:100AR6TSA 650
3CD16 (CD16)SP175 시리즈앱캠ab1833541:100AR6TSA 570
4CXCR4 (영문)44716연구개발(R&D)MAB1721:100AR9TSA 620

표 1: m-IHC에 사용된 항체 및 TSA 염료의 농도 목록.

형광단진언
TSA 염료 520높다
TSA 염료 540보통
TSA 염료 570보통
TSA 염료 620보통
TSA 염료 650높다
TSA 염료 690낮다

표 2: TSA 염료 및 해당 형광 강도.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

배아 착상은 배아와 자궁 내막 사이의 복잡한 상호 작용을 포함합니다. 자궁내막 항상성의 면역학적 상태는 자궁내막 수용성을 결정하는 데 중추적인 역할을 합니다. WOI 기간 동안 자궁내막에서 가장 우세한 백혈구 집단은 NK 세포입니다. uNK 세포의 약 90%는 CD56 발현이 높지만 CD16은 부족합니다. 그러나 uNK 세포의 일부 부분집합은 말초 혈액 NK 세포와 유사하여 CD56 발현은 낮지만 CD16 발현은 양성이다18. 이 두 가지 uNK 세포 아형은 뚜렷한 기능을 보여줍니다. CD56+CD16- 아형은 주로 사이토카인 생성, 혈관 재형성 및 영양세포와의 상호작용에 기여하며, 이는 임신을 확립하고 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 대조적으로, CD56+CD16+ 아형은 더 높은 세포 독성을 나타냅니다. 최근 연구에서는 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 사용하여 uNK 세포를 4개의 하위 집합으로 추가 분류하고, CD56+CD16- 조절 NK 세포를 특정 표현형과 기능에 따라 3개의 하위 집단으로 추가 하위 그룹화했습니다9. CD56+CD49a+CXCR4-를 특징으로 하는 NK1 subset은 조직 리모델링에 관여합니다. CD56+CD49a+CXCR4+로 식별되는 NK2 subset은 면역 반응을 조절합니다. CD56+CD49a-CXCR4-로 표시된 NK3 부분 집합은 영양아세포와 상호 작용합니다. CD56+CD49a-CXCR4+를 나타내는 NK4 subset은 CD56+CD16+ NK 세포와 유사성을 공유하며 세포독성 기능을 나타낸다9. 본 연구에서는 처음으로 m-IHC 염색을 활용하여 이러한 4가지 뚜렷한 NK 세포 subset을 식별하기 위한 프로토콜을 성공적으로 수립했습니다.

기존의 IHC 염색 및 유세포 분석은 면역 세포를 식별하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법이며, 각각 고유한 강점과 한계가 있습니다19. 기존의 IHC는 접근성이 뛰어나 임상 환경에서 널리 사용되지만, 여러 항원을 동시에 검출하고 양성 신호를 정량화하는 데 어려움을 겪습니다. 이는 면역 세포 표현형을 정확하게 특성화하는 데 상당한 장애물이 되며, 정확한 측정을 위해 여러 마커를 사용해야 하는 경우가 많습니다. 반면, 유세포 분석은 여러 세포 마커를 동시에 검출할 수 있지만 많은 양의 새로운 샘플이 필요하고 조직 내 세포 위치에 대한 공간 정보를 제공하지 않습니다. 주목할 만한 것은, 자궁내막 면역세포가 자궁내막 조직 전체에 균일하게 분산되어 있지 않다는 것입니다. 예를 들어, uNK 세포는 내강 공동(20) 근처의 영역에 비해 자궁 내막의 기저층 근처에서 더 조밀하게 응집되어 있습니다. 기존 IHC 및 유세포 분석의 이러한 한계는 m-IHC 및 머신 러닝 알고리즘과 결합된 이미지 분석 플랫폼을 통해 해결하여 조직 분할, 세포 분할 및 양성 세포 식별을 달성할 수 있습니다. 이 접근 방식은 몇 분 내에 수만 개의 세포를 분석하여 효율성을 높이고, 양성 세포를 자동으로 식별하여 관찰자 편향을 최소화하며, 여러 마커를 사용하여 보다 정확한 분석을 가능하게 합니다. 또한 새로운 샘플이 필요하지 않으며 필요한 경우 배치 실험 또는 반복 분석이 가능합니다.

m-IHC 기법을 사용하여 uNK 세포 표현형에 대한 포괄적인 평가를 수행하면 uNK 세포와 배아 이식 간의 상관 관계뿐만 아니라 RIF가 있는 여성의 변화에 대한 더 깊은 이해를 제공할 수 있습니다. uNK 세포 외에도 다른 자궁내막 면역 세포도 국소 면역 항상성에 기여합니다. 예를 들어, 조절 T 림프구(Treg 세포)는 Th1 및 Th2 세포의 활성을 억제하는 IL-10 및 TGF-β와 같은 억제 인자를 방출하여 면역 관용을 유지합니다21. 스테로이드와 Th2 사이토카인에 의해 조절되는 M2 대식세포의 분화는 아르기나제 활성을 상향 조절하고 산화질소 생성을 억제함으로써 면역 내성 상태에 기여합니다22. 또한, 수지상세포(dendritic cell, DCs)는 자궁 내에서 성숙한 내형성 세포(mature tolerogenic cell)로 분화하여 혈관 신생아형성을 조절하고 CD8+ T 세포의 기능을 억제하는 sFLT1 및 TGF-β1과 같은 인자를 방출함으로써 면역 항상성을 유지하고 배아 발달을 지원한다18. uNK 세포와 마찬가지로 이러한 면역 세포도 이질적이며 단일 마커로 표현형을 정확하게 식별할 수 없습니다. uNK 세포 subset을 평가하기 위한 m-IHC의 적용은 이러한 자궁내막 면역 세포의 subset을 식별할 수 있는 가능성을 보여줍니다.

자궁내막 외에도 이 방법은 면역 세포 표현형을 식별하기 위해 다양한 조직에 적용할 수 있습니다. 다른 조직에 적용할 때는 최적의 염색을 보장하기 위해 약간의 조정만 필요합니다. 또한 연구자가 특정 마커를 교체하려는 경우 특정 실험 요구 사항을 충족하도록 기존 패널을 수정할 수 있습니다. 이 패널의 다양성과 유연성은 다양한 조직 또는 다른 세포 하위 집합을 연구하기 위한 적응 가능한 도구로 만듭니다.

이 기술은 자궁내막 면역 세포의 상세한 변화를 이해하여 자궁내막 비수용성의 근본적인 메커니즘을 해부할 수 있을 뿐만 아니라 진단 검사의 개발 가능성을 제공합니다. 파라핀 블록과 절편을 상대적으로 쉽게 얻고 보존할 수 있기 때문에 이 기법이 널리 사용될 수 있는 길이 열렸습니다. 표준화된 염색 패널을 통해 병원은 정교한 소프트웨어 알고리즘과 함께 자동 염색 기술을 활용하여 분석 절차의 효율성을 크게 향상시킬 수 있습니다. m-IHC 기술의 장점은 임상 실습을 위한 실행 가능한 옵션입니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 보건 의료 연구 기금(Health and Medical Research Fund, 10210956)의 지원을 받았다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CD49aNovus BiologicalsNBP2-764781차 항체
CD56LeicaNCL-L-CD56-5041차 항체
CD16abcamab1833541차 항체
CXCR4R& DMAB1721차 항체
증폭 희석제Akoya BiosciencesFP1498 시리즈형광단 희석 완충액
항체 희석제Akoya BiosciencesARD1001EA항체
구연산염 완충 용액 희석, pH 6.0 /9.0(10x)Akoya BiosciencesA6001/A9001항원 회수 솔루션
inForm 고급 이미지 분석 소프트웨어Akoya BiosciencesinForm 조직 찾기 소프트웨어 2.2.6데이터 분석 소프트웨어
Mantra 워크스테이션Akoya BiosciencesCLS140089분광 이미징
마이크로파Akoya Biosciences인버터마이크로파 스트리핑
TSA 520Akoya BiosciencesFP1487001K적합한 티라미드 기반 형광 시약
TSA 620Akoya BiosciencesFP1495001K적합한 티라미드 기반 형광 시약
TSA 650Akoya BiosciencesFP1496001K적합한 티라미드 기반 형광 시약
TSA 570Akoya BiosciencesFP1488001K적합한 티라미드 기반 형광 시약
Poly-L-lysine 코팅 슬라이드Fisher Technologies120-550-15일상적인 조직학적 사용을 위한 슬라이드
PolyHRP Broad SpectrumPerkin ElmerARH1001EA2차 항체
Invitrogen™   플루오로마운트-G&트레이드; 마운팅 매체ThemoFisher 과학495802설치
스펙트럼 DAPIAkoya BiosciencesFP1490A핵산 염색

참고문헌

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