방법 논문

생쥐의 심장 표면에 갈색 지방 조직을 이식하기 위한 수술 모델

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DOI:

10.3791/67289

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2025년 7월 11일

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1Department of Cardiovascular Surgery, The Second Xiangya Hospital of Central South University, 2National Clinical Research Center for Metabolic Diseases, Hunan Provincial Key Laboratory of Metabolic Bone Diseases, and Department of Metabolism and Endocrinology, The Second Xiangya Hospital of Central South University, 3Department of Radiology, the Second Xiangya Hospital, Central South University

이 논문에서

요약

생쥐의 심장 표면에 갈색 지방 조직을 이식하는 독특한 수술 모델이 개발되었습니다. 이 모델은 심장 질환에 대한 심외막 지방 조직(EAT)의 영향과 EAT 갈변의 심장 보호 역할에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.

초록

관상동맥과 심근에 대한 갈변 심외막 지방 조직(EAT)의 paracrine 효과를 조사하기 위한 마우스 모델을 개발해야 합니다. EAT는 특별한 해부학적 위치와 심장 표면과의 직접적인 연결로 인해 에너지 저장 기관일 뿐만 아니라 여러 심혈관 질환에 관여하는 필수 부분비 조절자로 간주됩니다. 여러 연구에 따르면 EAT 갈변은 항염증 표현형 전이, 심장 보호 인자의 방출, 세포 외 소포체 등을 통해 심혈관 질환에 대한 유망한 치료 잠재력을 가지고 있습니다. 설치류 모델에서 EAT의 선천적 결핍은 심혈관 질환에서의 기능에 대한 실험적 연구를 제한합니다. 이전 연구에서는 지방 조직과 다른 장기 사이의 내분비 및 부분비 누화를 조사하기 위해 지방 조직 이식을 활용했습니다. 이는 심혈관 질환에 대한 부분비 효과를 연구하고 EAT 갈변의 잠재적 보호 이점을 탐구하기 위해 쥐의 심장 표면에 갈색 지방 조직(BAT)을 이식하기 위한 수술 모델을 개발해야 할 필요성을 강조합니다. 본 연구에서는 생쥐의 심장 표면에 갈색 지방 조직을 이식하는 독특한 수술 절차를 규명하고, 수술 후 4주 후 이식 생존율 및 이식 생존율을 평가한다. 이 모델은 EAT 갈변을 조사하기 위한 향후 실험에 적용할 수 있습니다.

서론

심외막 지방 조직(EAT)은 심장 표면에 위치한 이질적이고 다기능적인 지방 저장소로, 심근에 직접 부착되어 결합 조직 없이 주요 관상 동맥을 둘러싸고 있습니다1. EAT는 심근 및 관상동맥과 해부학적으로 가깝기 때문에 심방세동, 죽상동맥경화증, 심부전과 같은 심혈관 질환을 조절하기 위해 부분비 의존적 방식으로 풍부하고 다양한 생물학적 인자를 적극적으로 분비할 수 있습니다 2,3,4. EAT는 심혈관 질환의 위험 요인일 수 있으며, EAT는 심혈관 질환의 새로운 치료 표적이 될 수 있는 것으로 여겨진다5.

그러나 인간과 달리 쥐의 심장 표면에는 눈에 띄는 EAT가 거의 없습니다. 실제로, 대부분의 EAT에 대한 실험은 in vivo 6에서 EAT의 기능을 관찰할 수 있는 실험용 동물 모델이 없기 때문에 in vitro에서 수행되었습니다. 따라서 과학자들은 in vitro에서만 EAT 분비체를 정제하고 분석할 수 있으며, in vivo에서 EAT의 실제 기능을 완전히 관찰할 수 있는 적용 가능한 실험 모델은 없습니다. 따라서 EAT를 사용하여 마우스 모델을 확립하는 것은 EAT가 근위 심근 및 관상 동맥에 고유한 효과를 발휘하는 방법을 설명하는 데 도움이 될 것입니다.

갈색지방조직(BAT)은 타고난 발열 능력을 가지고 있으며 포도당 대사를 향상시킵니다7. 최근 연구자들은 BAT가 심장 질환의 심장 보호 조직으로 기능할 수 있음을 발견했습니다. BAT에 의해 분비되는 작은 세포외 소포체는 심장 보호 miRNA를 심장에 전달하여 운동으로 인한 심장 보호에 관여합니다8. BAT는 12,13-diHOME과 NOS1을 방출하여 칼슘 순환 조절을 통해 심장 기능을 향상시킬 수 있습니다9. 갈색 지방 조직 유래 FGF21은A2A 수용체10을 활성화하여 고혈압 심장 리모델링을 약화시킵니다. 또한, BAT는 허혈-재관류(I/R) 손상에서 심근 손상을 감소시키는 BMP3b를 방출할 수 있습니다11.

이러한 연구는 BAT가 내분비 메커니즘을 통해 심혈관 질환에서 심장 보호 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 또한 정상 마우스의 BAT를 고지방 다이어트 마우스의 견갑골 부위에 이식하는 성공적인 BAT 이식 모델이 포도당 대사 및 인슐린 감수성을 향상시키고 체지방량을 감소시키며 수용 마우스의 비만도를 개선하는 것으로 관찰되었음을 시사하는 증거도 있습니다. BAT 이식은 BAT 관련 사이토카인의 내분비 방출, 교감신경계의 활성화, 트리글리세리드의 BAT 흡수 증가, 비만 마우스의 포도당 내성 및 인슐린 저항성 개선 등 다양한 메커니즘을 통해 유익한 효과를 발휘할 수 있습니다12,13. 따라서 BAT 이식은 심장 질환에 대한 잠재적인 치료법이 될 수 있습니다.

그러나 종간 차이로 인해 마우스는 심장에 EAT가 부족하여 BAT가 심장에 미치는 영향이 불분명합니다. 또한 심장 표면에 BAT를 현장 이식하는 것이 다른 전략에 비해 우수한 이점을 제공하는지 여부는 아직 알려져 있지 않습니다.

심장에 대한 BAT의 기능을 평가하고 심근세포 및 관상동맥에 대한 부분비 효과를 밝히기 위해 우리 팀은 마우스 심장에 현장 BAT 이식을 위한 미세수술 모델을 확립하기 위한 단계별 절차를 설명하는 것을 목표로 합니다. BAT의 내분비 영향만 시뮬레이션할 수 있는 피하 이식과 달리, 이 접근법은 직접적인 부분비 상호 작용을 연구할 수 있습니다. 일상적인 수술 후 관찰 지표는 마우스 심장 표면에서 혈액 공급을 통해 BAT 이식편의 성공적인 집락화와 생존을 확인하기 위해 사용됩니다.

프로토콜

지방 조직을 얻기 위한 실험 프로토콜은 Central South University Institutional Review Board에서 검토 및 승인되었습니다. 아래 나열된 동물 사용 프로토콜은 프로토콜 번호 2024054에 따라 중국 Central South University의 Second Xiangya Hospital의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호 20230188)에서 검토 및 승인했습니다. 모든 실험은 동물 안전 및 인도적 관리 지침을 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 이 연구에는 체중이 12-25g인 3주에서 8주 된 C57/BL6 야생형 수컷 마우스가 사용되었습니다. 수혜 동물은 수술 1시간 전에 0.1mg/kg의 부프레노르핀으로 피하 주사를 선제적으로 마취했습니다. 수혜 동물에서 부프레노르핀은 이식 후 동일한 용량으로 재투여되었으며 수술 후 첫 48시간 이내에 필요에 따라 재투여되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 기증자 갈색 지방 조직(BAT) 수확

  1. 기증자 3-8주 된 마우스를 100%O2의 0.5-1.0L/min과 혼합된 2% 이소플루란으로 채워진 유도 챔버에 넣어 마취합니다. 적절한 마취 깊이를 확인하려면 마우스의 손톱 바닥에 압력을 가하거나 발가락 꼬집음 반사 검사를 수행하십시오.
  2. 마우스를 가열 패드 위에 엎드린 자세로 놓고 접착 테이프로 팔다리를 고정합니다.
  3. 목 피부에서 정중선을 따라 약 1cm 아래로 이동하여 함몰된 위치를 찾아 견갑골 와를 확인합니다.
  4. 이 위치에서 머리를 면도하고 포비돈 요오드로 피부를 3회 소독합니다.
  5. 약 1cm의 세로로 절개하여 견갑골 내의 지방 조직을 노출시킵니다. 표재성 백색 지방 조직과 근육층을 조심스럽게 분리하여 한쪽이 갈색을 띤 빨간색으로 보이는 기저 BAT를 노출시킵니다. 이식을 위해 BAT 30mg을 수집합니다.
  6. BAT를 세척하여 멸균 식염수를 사용하여 혈액과 부스러기를 제거합니다.
  7. 안과 가위를 사용하여 BAT를 작은 조각(5 × 5mm, 약 20mg)으로 자르고 이식 마우스를 준비하는 동안 37°C에서 조직 배양을 위한 완전한 배지로 유지합니다.

2. 이식 준비

  1. 오토클레이브 살균기를 사용하여 미세 수술 기구를 소독하고 멸균 장갑을 착용하십시오.
    알림: 무딘 가위, 마이크로 가위, 마이크로 집게, 굵은 곡선 집게(×2), 45° 각도의 미세한 집게(×2), 각진 스프링 가위, 흉부 견인기, 2-0 흡수성 봉합사, 7/0 프롤렌 봉합사 및 바늘 홀더.
  2. 75% 이소프로필 알코올로 작업 현장을 소독하십시오.
  3. 37°C± 1°C로 설정된 발열 패드를 사용하여 수술 중 정상 체온과 안정적인 심박수를 유지하십시오.
  4. 출혈이 있을 경우 사용할 수 있도록 면 어플리케이터를 준비합니다.

3. 마우스의 준비 및 삽관

  1. 제모 크림을 사용하여 수혜자 마우스의 목선에서 가슴 중간 수준까지 털을 제거합니다.
  2. 100%O2의 0.5-1.0L/min과 혼합된 2% 이소플루란으로 채워진 유도실에 마우스를 놓아 마취합니다. 적절하게 진정되면 1.7% 이소플루란과 100% O2의 0.7L/min을 혼합하여 마취를 유지합니다.
  3. 마우스를 가열 패드에 누운 자세로 놓고 접착 테이프로 팔다리를 고정합니다.
  4. 복합 요오드 용액으로 수술 부위를 소독한 다음 70% 알코올을 첨가하십시오. 이 과정을 세 번 반복합니다.
  5. 오염을 방지하기 위해 멸균 드레이프로 마우스를 덮고 수술 부위만 노출시킵니다.
  6. 각 개별 마우스에 대해 새 멸균 장갑 세트를 사용하십시오.
  7. 앞니에 고무 밴드를 대고 목을 펴십시오. 한 손에는 구부러진 집게를 사용하여 혀를 옆으로 부드럽게 조작하고 다른 손으로는 PE-90 기관내관을 삽입합니다. 적절한 배치를 위해 마우스의 머리가 튜브와 수평을 이루는지 확인하십시오.
  8. 튜브가 식도가 아닌 기관에 삽입되었는지 확인합니다. 경추 피부를 세로로 절개(~6-7mm)하여 검증에 필요한 경우 기관을 노출시킵니다.
  9. 기관내관을 체적 순환 설치류 인공호흡기에 연결하고 매개변수를 140회/분으로 설정하고 일회 호흡량을 0.2mL로 설정합니다. 접착 테이프로 튜브를 고정합니다.
    참고: 성공적인 기계적 환기의 지표 - 마우스의 흉부 움직임은 규칙적이어야 하며 인공호흡기의 호흡수와 동기화되어야 합니다.

4. EAT 접목

  1. 쇄골상 노치에서 시작하여 정중선 흉골 절개를 수행합니다. 흉골의 정중선(마우스의 전방 흉벽에 있는 흰색 선)을 따라 1cm 절개를 만들어 심장 전벽을 노출시킵니다. 수술용 현미경으로 흉부 견인기를 사용하여 흉골을 수축시킵니다. 시술 중 폐와 내흉동맥을 다치지 않도록 하십시오.
  2. 끝이 45° 각도인 집게를 사용하여 심장 주위의 심외막 점막을 부드럽게 분리하고 절제합니다.
  3. 좌심실의 전벽에 있는 심낭을 엽니다. 혈관이 풍부한 깨끗하고 작은 BAT 조각을 심장 표면에 놓습니다. 두 개의 수술 매듭이 있는 7/0 프롤렌 봉합사를 사용하여 BAT를 좌심실 표면에 기계적으로 부착합니다. 심장 벽을 뚫지 마십시오.
  4. 흉부 견인기를 제거하고 폐를 다시 팽창시키기 위해 2초 동안 인공호흡기 유출을 꼬집습니다.
  5. 중단된 봉합사 패턴이 있는 2-0 흡수성 봉합사를 사용하여 흉곽을 닫습니다.
  6. 연속 봉합사 패턴의 2-0 흡수성 봉합사를 사용하여 피부층을 닫습니다.

5. 수술 후 관리

  1. 수액 교체를 위해 수술 후 0.3mL의 생리식염수를 복강내로 투여합니다.
  2. 절개 부위의 통증을 완화하기 위해 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 피하로 투여하고 감염을 예방하기 위해 엔로플록사신(5mg/kg)을 투여합니다.
  3. 마우스를 열 램프 아래에 놓습니다.amp 마취에서 깨어나 흉골 누운 상태로 돌아와 자유롭게 움직일 수 있을 때까지. 그런 다음 마우스를 음식과 물이 있는 별도의 케이지로 옮깁니다. 흉부의 일시적인 경미한 제한 움직임으로 인해 쉽게 접근할 수 있도록 케이지 바닥에 젤라틴 식품 공급원을 제공하십시오.
  4. 수혜자 마우스를 케이지 시설로 되돌리기 전에 수술 후 1시간 동안 관찰합니다. 처음 24시간 동안 하루에 세 번 마우스를 검사하여 활동과 영양 섭취를 모니터링합니다. 처음 72시간 동안 통증과 고통의 징후를 모니터링합니다. 매일 동물의 상태를 확인하고 매주 무게를 잰다.
  5. 쥐가 통증, 고통 또는 사료 섭취 감소의 징후를 보이는 경우 수의사와 상담하십시오.
    참고: 필요한 경우 조기 안락사를 고려하십시오. 안락사 기술은 7분 동안 CO2 과다 투여 후 자궁 경부 탈구를 포함합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). BAT 자가이식편의 괴사, 흡수 또는 거부는 안락사를 유발하는 특정 종점으로 정의됩니다.

결과

수술 전, 수술 전후 및 수술 후 결과에 대한 관찰을 기반으로 갈색 지방 조직(BAT)을 심장 표면에 이식하기 위한 이 마우스 모델이 성공적으로 확립되었습니다. BAT는 기증자 마우스의 견갑골 영역에서 수집되었으며, 각 BAT 이식편의 무게는 약 0.1g이었습니다.

Hematoxylin-eosin 염색을 통해 이식편의 조성과 구조를 BAT로 확인했습니다. 낮은 배율에서, 많은 수의 갈색 지방세포가 모세혈관이 풍부한 느슨한 결합 조직 내에서 소엽 구조를 형성하는 것이 관찰되었습니다. 갈색 지방세포의 세포질에는 수많은 작은 액포가 포함되어 있었고 그 핵은 둥글고 중앙에 위치했습니다. 고배율에서 갈색 지방세포는 백색 지방세포와 형태학적으로 유사했지만 직경이 더 작았습니다. 갈색 지방세포의 핵은 원형 또는 타원형이었고 세포 내에서 중앙 또는 편심으로 위치했습니다. 세포질은 호산구성 세포성이었고 세포질 전체에 분포된 다양한 크기의 여러 지질 방울을 포함하고 있었습니다. 모세 혈관과 신경은 또한 갈색 지방 세포 사이에서 볼 수 있었다. 이식된 지방 조직은 UCP1 발현을 위한 면역조직화학적 염색을 통해 갈색 지방 조직임을 추가로 확인하였다(그림 1). BAT 이식편은 좌심실의 전벽에 성공적으로 고정되었습니다(그림 2).

BAT 이식 4주 후, 수혜자 마우스에서 식단, 활동 또는 체중에 큰 변화가 없었습니다. 가슴 절개 부위가 잘 치유되어 정상적인 머리카락으로 완전히 덮였습니다. 수혜자 마우스는 (윤리적 지침에 따라) 희생되었고, 심장은 심외막 BAT 이식편과 함께 조직학적 검사를 위해 제거되었습니다. Hematoxylin-eosin 염색은 BAT 이식편이 여전히 생존 가능하며 전형적인 BAT 조직학적 특징을 나타내고 인접한 심근과 미세 순환을 확립하는 것을 입증했습니다. 유의미한 염증성 세포 침투나 지방 액화의 징후는 없었다. Masson의 트리크롬 염색은 심근 내에서 이식된 조직을 고정하는 데 사용되는 봉합사를 둘러싼 섬유성 결합 조직의 형성을 밝혔습니다. 이식편 주변과 내부에서 섬유성 결합 조직이 관찰되었지만, 지방 조직의 명백한 구획화나 구조적 파괴는 없었습니다. CD31 및 UCP1에 대한 면역조직화학적 염색은 이식된 BAT 내에서 신미세혈관의 형성을 추가로 나타내고 이식편 내 갈색 지방세포 일부의 생존을 확인했습니다(그림 3).

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그림 1: 기증자 마우스에서 갈색 지방 조직의 분리 및 식별. (A,B) 이식을 위해 기증자 마우스에서 채취한 갈색 지방 조직(BAT)(흰색 화살표로 표시). (C) 갈색 지방 조직에서 UCP1 발현의 대표적인 면역조직화학 염색(스케일 바 = 100μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 동물 모델 확립. 이 그림은 동물 모델을 설정하는 절차를 보여줍니다. 흉골 전방벽을 노출시키기 위해 흉골 전개흉술을 시행합니다. 갈색 지방 조직(BAT) 이식편은 심장 표면에 고정됩니다. 그런 다음 근육과 피부층에 대한 간헐적 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 이식 후 4주에 마우스 심장에 대한 갈색 지방 조직 생착 평가. (A) 정중 전방 흉부 절개 부위의 흉터(흰색 화살표). (B,C) 심장의 정점에 고정된 갈색 지방 조직(BAT) 이식편(흰색 화살표). (D) 이식 후 4주에 BAT 동종이식과 심근의 대표적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 이미지(스케일 바 = 100μm). 검은색 실선 삼각형은 심근을 나타내고, *는 BAT 이식편을 나타내고, 검은색 화살표는 모세혈관을 나타냅니다. (E) 이식 후 4주에 BAT 동종이식편과 심근에 대한 Masson 대표의 삼색 염색 이미지(스케일 바 = 200μm). (F) 이식 후 4주에 BAT 동종이식편 및 심근에서 CD31 발현의 면역조직화학 염색. 검은색 화살표는 동종이식편에서 CD31 발현이 양성임을 나타냅니다(스케일 바 = 100μm). (G) 이식 후 4주에 BAT 동종이식편 및 심근에서 UCP1 발현의 면역조직화학 염색(스케일 바 = 50μm). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 연구에서는 심근 표면에 갈색 지방 조직(BAT)을 이식하는 수술 모델을 성공적으로 확립했습니다. 심외막 지방 조직(EAT)은 심근과 관상동맥에 직접 연결되어 공통의 미세순환을 공유하고 이들 사이의 밀접한 누화를 촉진하는 독특한 지방 저장소입니다. 이전 연구에서는 EAT가 관상 동맥 질환, 심방 세동 및 심근 비대를 포함한 여러 심장 질환과 관련이 있음을 밝혔습니다. 그러나 이러한 연구에서 EAT의 양이 심장 질환의 정도와 중증도와 상관관계가 있음을 보여주었지만, EAT가 심장 병리학에 영향을 미치는 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다 1,2,3,4,5,14,15,16.

한편, BAT는 포유류를 저체온증으로부터 보호하는 데 자연스러운 역할을 하는 것으로 여겨집니다. 세포질에는 여러 개의 작은 다위치 지질 방울이 포함되어 있으며 미토콘드리아가 풍부합니다. BAT는 에너지 소비를 조절하고 포도당 및 지질 항상성을 유지하는 열발생 지방 조직으로 대사 및 심혈관 질환에 대한 잠재적인 치료 표적이 됩니다 17,18,19. 일부 임상 연구에서는 BAT 부피가 심혈관 질환과 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. BAT 부피가 높은 개인은 제2형 당뇨병, 관상 동맥 질환, 이상지질혈증, 울혈성 심부전, 뇌혈관 질환 및 고혈압의 유병률이 낮다7,20,21.

이전 연구에서는 BAT 유래 소세포외 소포체(sEV)가 심근세포에 흡수되어 심근허혈/재관류(MI/R) 관련 MAPK 경로8의 활성화를 억제하는 것으로 나타났습니다. 또 다른 연구에서는 BAT가 운동 관련 심장 보호에 기여하는 심장 보호 microRNA를 포함하는 sEV를 방출한다는 사실을 발견했습니다22. 이러한 결과는 BAT 심근세포 누화의 기저에 있는 메커니즘을 설명하고 BAT sEV와 그 microRNA 함량을 운동 유도 심장 보호의 잠재적 후보로 강조합니다. 또한, BAT 유래 뉴레굴린 4(Nrg4)는 수컷 마우스23에서 내피 염증 및 죽상경화증을 완화하는 것으로 나타났으며, 이는 심혈관 건강에서 BAT의 내분비 보호 기능을 더욱 입증했습니다.

또한, 전사 분석에 따르면 인간 EAT는 UCP-1, PRDM16 및 PGC-1α와 같은 BAT 마커를 다른 지방 저장소에서 발견되는 것보다 높은 수준으로 높게 발현하는 것으로 나타났습니다 5,6,24,25. 이는 EAT가 부분적으로 BAT로 기능할 수 있음을 시사합니다. 이러한 결과는 갈변 EAT가 저체온증으로부터 심근과 관상동맥을 보호하고 허혈 또는 저산소증에 대한 방어 메커니즘 역할을 할 수 있다는 가설을 뒷받침합니다. 종합적으로, 이러한 연구는 BAT가 여러 생체 활성 인자를 방출하고 심혈관계에 유익하고 보호적인 효과를 발휘한다는 것을 나타냅니다6.

이전 연구에서는 BAT가 질병 발생 및 진행에 미치는 영향을 밝히기 위해 BAT 이식 모델을 다양한 질병 모델에 적용했습니다. 여기에는 다낭성 난소 증후군(PCOS)에 대한 BAT 이식의 영향에 대한 연구26, 난소 노화에 대한 조절 역할27, 전신 대사에 미치는 영향28,29에 대한 연구가 포함됩니다. 그러나 BAT 이식이 심장에 미치는 병태생리학적 영향은 아직 조사되지 않았습니다.

BAT는 수많은 신호 분자를 분비할 수 있는 기관으로서 주로 내분비 경로를 통해 정상 유기체의 심혈관 병태생리학에 영향을 미치며, 이러한 분자를 심장이나 혈관으로 전달합니다11. 그러나 BAT가 부분비 경로를 통해 심장 병태생리학을 직접 조절할 수 있는지는 불분명합니다. 심장 표면에 BAT 이식을 위한 적절하고 신뢰할 수 있는 모델을 확립하면 BAT와 심장 간의 직접적인 상호 작용에 대한 조사를 용이하게 할 수 있습니다.

BAT가 해부학적으로 생쥐의 견갑골 부위에 위치한다는 점을 감안할 때, 다른 기관과의 누화는 주로 내분비 신호 전달을 통한 전신 순환에 의존합니다. 또한 일부 연구에서는 심외막 지방 조직(EAT)이 갈변 전이를 겪을 가능성이 있다고 제안했습니다. 다양한 식이요법, 환경적, 약리학적 개입이 비만 및/또는 관상동맥질환(CAD) 환자에서 EAT 갈변을 유도하는 데 유망한 것으로 나타났습니다. 이러한 전이는 혈관 손상을 악화시키고 관상동맥 죽상동맥경화증을 가속화하는 저산소성 및 염증성 미세환경을 완화하는 데 도움이 될 수 있다 4,24,30. 그러나 EAT 갈변과 관련된 특정 요인과 경로를 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 또한 EAT 표현형과 불균형 염증 프로필과 관련된 심혈관 결과 사이의 관계를 탐구하기 위해 실험 동물 모델이 필요합니다.

EAT를 연구하는 데 있어 가장 큰 한계 중 하나는 설치류가 눈에 띄는 EAT가 거의 없다는 것입니다. 인간의 경우 개흉술이 필요하기 때문에 샘플을 얻기가 어렵기 때문에 신선한 EAT를 연구하는 것도 어렵습니다. 이전 연구에서는 당뇨병성 지방 조직이 허혈-재관류 손상을 악화시킬 수 있음을 입증하기 위해 고지방 다이어트 마우스에서 유래한 지방 조직을 심근경색 마우스의 복강에 이식하는 모델을 사용했습니다31. 지방 조직 이식 모델을 적용하면 부분비 신호 전달을 통해 BAT가 심장에 미치는 영향을 탐색할 수 있습니다.

이 모델 개발의 주요 목적은 심근 및 관상 동맥에 대한 EAT와 같은 부분비 기관인 BAT의 잠재적인 치료 효과를 조사하는 것입니다. 앞으로 이 모델은 죽상경화성 플라크 진행을 억제하고 심근 허혈성 손상을 개선하며 심방세동을 완화하는 BAT의 심장 보호 효과를 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 또한 EAT 갈변을 촉진하는 이점을 뒷받침하는 정황 증거를 제공할 수 있습니다.

2013년 하버드 의과대학의 연구팀은 BAT 질량 증가를 통한 대사 항상성 개선을 평가하기 위해 부고환 지방 패드에 조직을 연결하여 BAT를 이식한 쥐의 내장강에 BAT를 이식했습니다32. 1960년대의 초기 연구에서 연구자들은 기증자의 견갑간 부위에서 BAT를 분리하여 1-2주 동안 수혜자의 신장 캡슐 아래에 이식했습니다. 또한, 또 다른 연구에서는 BAT를 햄스터의 안구 앞쪽에 이식하고, 이식된 BAT가 생존 여부를 평가하기 위해 조직학적 분석을 사용했다12. 그러나 설치류의 심외막 부위에 BAT 이식의 타당성과 생존 가능성은 아직 알려지지 않았습니다.

생쥐의 심외막 수술은 이제 심근 경색 모델을 유도하기 위한 일상적인 절차입니다. 흥미롭게도, 한 연구팀은 돼지 모델에서 심낭 공간/유체 내에 약리학적 제제를 성공적으로 전달했으며, 이는 심방세동, 상대적 불응성 기간 및 허혈성 심근병증을 조사하는 데 활용되었습니다. 이러한 연구를 바탕으로 외과 절차를 통한 심외막 BAT 이식을 위한 설치류 모델 개발이 보장됩니다.

실험 결과에 따라 기증자 마우스의 견갑골 공간에서 두 개의 BAT 조각을 분리했습니다. BAT는 피하 지방 조직(SAT)으로 덮여 있었고 SAT보다 더 어두운 색을 보였으며 혈액이 풍부하게 공급되었습니다. BAT의 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(eosin, H&E) 염색 결과, 갈색 지방세포(brown adipocytes)는 더 작은 다위치 지질 방울을 함유하고 있으며, 모세혈관 내강(capillary lumen)에 적혈구가 존재하여 혈관화(vascularization)가 높다는 것을 밝혔습니다. 수집된 각 BAT 세그먼트의 무게는 약 30-40mg이었습니다. 그러나 이식된 BAT 이식편은 약 20mg으로 제한되었으며, 이식편이 더 커지면 수술 후 1-2일 이내에 생쥐가 폐사했습니다. 이러한 결과의 가능한 원인은 흉강과 심장 전벽 사이의 제한된 공간입니다. 상대적으로 큰 이식편은 과도한 압력을 가하여 잠재적으로 심장 압착을 초래할 수 있습니다.

마취는 기관 삽관을 통해 유지되었으며, 마우스의 흉부 변동의 진폭과 리듬을 관찰하여 마취 깊이를 모니터링했습니다. 심장 전벽을 노출시켜 BAT 이식을 용이하게 하기 위해 정중 개흉술을 선택했습니다. EAT는 심근과 관상동맥을 결합조직이 분리하지 않고 직접 연결되어 있다는 점을 감안할 때, 프로토콜은 심낭을 열고 BAT를 심장 표면에 삽입한 다음 심낭을 봉합하는 것이었습니다.

이식 4주 후, 수혜 마우스는 윤리 지침에 따라 안락사되었고, BAT 통합 및 생존을 평가하기 위해 흉강을 열었습니다. 이러한 발견은 BAT 동종이식이 성공적으로 생존했음을 확인합니다.

결론적으로, 생쥐의 심장 표면에 BAT를 이식하는 수술 모델이 성공적으로 개발되었습니다. 이 모델은 심장 질환에 대한 EAT의 효과와 EAT 갈변의 심장 보호 잠재력에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다.

공개 사항

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학재단(No. 81870623, 81770881, 81900286, 82100494, 82100944, 82070910), 후난성 핵심 R&D 계획(2020SK2078), 후난성 자연과학재단(2022JJ70055, 2021JJ40842, 2022JJ40721)의 지원을 받았다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1% 페니실린/스트렙토마이신Gibco, Invitrogen, New York, USA03-031-1BCS이식편을 위한 조직 보존
10% 태아 소 혈청(FBS)Bovogen, New Zealand, Australia1907B이식편을 위한 조직 보존
2-0 흡수성 봉합사 ShanghaiPudong Jinhuan Medical Products Company17Y1204J피부 폐쇄
6-8주 수컷 C57BL/6J 마우스SJA Laboratory Animal Co., Ltd(중국 후난성) 
7/0 Prolene 봉합사Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products CompanyR731갈색 지방 조직을 심장에 고정
Alizarin Red 염색 솔루션Servicebio, Wuhan, ChinaCR2203058Alizarin Red 염색 이식편용 각
진 스프링 가위Jinzhong 수술 기구 회사Y3C040조직 해부 및 분리
무딘 가위진중 수술 기구 회사J22010조직 해부 및 분리
흉부 견인기TIGERGENE 회사TG-CK-07PK가슴 후퇴 및 고정
코스 곡선 겸자진중 수술 기구 회사JD1060조직 해부 및 분리
DMEM: F12 (1:1) mediumGibco, Invitrogen, New York, USAC11330500BT이식편을 위한 조직 보존
Fine 45° 각진 겸자Jinzhong 수술 기구 회사Y4E040조직 해부 및 분리
IsofluraneShenzhen RuiWoDe Life Technology Co., LTDR510-22마우스 가스 마취
마이크로 겸자Jinzhong 수술 기구 회사JD1050조직 해부 및 분리
마이크로 가위Jinzhong 수술 기구 회사Y00030조직 해부 및 분리
늘 홀더진중 수술 기구 회사Y3G150폐쇄용 바늘 고정
과용 가위진중 수술 기구 회사Y3C060조직 해부 및 분리
수술용 현미경Murzider Company MSD203갈색 지방 조직 이식편의 외과적 이식용
적 순환 설치류 인공호흡기난징 KEWBASIS 생명공학 Co.LTDKW-MZJ-Z마우스 가스 마취
바 안 용

참고문헌

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