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방법 논문

In Vivo Leaf Inoculation: 줄기 구내염의 포플러 육종에서 하이브리드 클론의 질병 저항성을 평가하는 대체 방법

1.5K 조회수

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DOI:

10.3791/67290

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2024년 9월 20일

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1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Beijing Haidian Kaiwen Academy High School, 4State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

당사는 in vivo leaf 접종 방법을 사용하여 줄기 구내염 병원균에 대한 포플러 내성을 평가하기 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 중국의 포플러 육종 자손에서 Cytospora chrysosperma 및 Botryosphaeria dothidea 구내염 저항성의 대규모 평가에 특히 적합합니다.

초록

병원균 Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) 및 Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces에 의해 발생하는 줄기 구내염 중국의 포플러 농장에서 발생하는 두 가지 주요 산림 질병은 때때로 모든 포플러 묘목을 파괴하거나 성숙한 포플러 숲을 심각하게 손상시킬 수 있습니다. 잡종 육종은 나무 질병을 통제하고 관리하는 가장 직접적이고 효율적인 방법입니다. 그러나 질병 저항성을 평가하거나 체외 줄기 접종에 기반한 질병 저항성 클론을 선택하는 것은 비효율적이고 시간이 많이 걸리며 비용이 많이 들기 때문에 포플러 줄기 구내염의 하이브리드 육종 개발을 제한합니다. 이 연구에서는 in vivo leaf 접종을 통해 줄기 구내염 병원체에 대한 질병 저항성을 평가하는 대체 방법을 제안했습니다. 이 방법에 사용 된 시험 재료는 1 년 된 포플러 묘목 또는 온실이나 들판의 다년생 포플러의 연간 가지에있을 수 있습니다. 이 대체 방법의 중요한 단계는 접종 잎의 선택입니다 : 5-7번째로 자란 잎이 가장 적합 할 수 있습니다. 잎 접종 방법의 두 번째 중요한 단계는 바늘 구멍을 통해 식물 잎에 상처를 만들어 질병의 중증도를 측정하기에 충분한 병변을 제공하는 것입니다. 포플러 육종의 초기 단계에서 생산되는 적절한 수의 잎을 위해, 이 생체 내 잎 접종은 구내염 병원균을 막기 위해 질병 저항성 포플러 클론을 빠르고 정확하며 대규모로 스크리닝하는 데 기여합니다. 또한, 이 잎 접종 방법은 줄기 줄기 구내염 병원체 C. chrysosperma, B.dothidea 또는 기타 포플러 줄기 구내염 병원체의 병원형을 스크리닝하는 효율적인 방법이기도 합니다.

서론

주로 두 개의 괴사성 병원체인 Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. 및 Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces에 의해 발생하는 포플러 줄기 구내염 질환. 중국의 북동부, 북부 및 북서부(Three-north)에 있는 포플러 농장의 개발과 생존을 심각하게 위협합니다. 잡종 육종은 나무 질병을 통제하고 관리하는 가장 직접적이고 효율적인 방법입니다. 그러나 다수확, 빠르게 성장하는 또는 기타 포플러 잡종 클론에 대한 육종의 발전에 비해 포플러 구내염에 대한 저항성 육종에 대한 연구는 부족합니다. 질병 저항성 잡종 육종에 대한 제한된 연구만이 보고되었으며1,2,3, 포플러 조림에서 구내염 저항성 잡종 클론이 재배되지 않았습니다.

정기적인 잡종 육종의 중요한 단계는 잡종 자손의 표현형 획득에 기초한 클론 선택입니다. 그러나 병리학적 표현형(병원형)을 획득하는 것은 시간이 많이 걸리고, 힘들고, 피곤하고, 비용이 많이 들고, 전문가에 의존하는 과정입니다. 목본 식물의 경우 긴 수명주기, 느린 성장 및 거대한 몸체로 인해 시간, 노동 및 경제가 많이 소모되는 특성으로 인해 더 까다롭습니다. 예를 들어, 포플러의 경우, 잡종 자손의 구내염 저항성 스크리닝은 종래의 체외 줄기 접종 방법 1,2,3을 통해 교잡 후 5-7년 후에 수행되었습니다. 더욱이, 이러한 낮은 효율성과 높은 소모력의 질병 저항성 스크리닝 방법으로 인해 연구자들은 모든 잡종 자손이 아닌 작은 하위 그룹(예: 선택된 고수율 또는 빠르게 성장하는 포플러 클론)에서 구내염 저항성 클론을 다시 선택했습니다. 따라서 일반적인 줄기 접종 방법을 사용해서는 진정한 내성 클론을 식별할 수 없고 번식 자손의 질병 저항성 다양성을 밝힐 수 없으므로 질병 저항성 관련 유전자 또는 유전자 모듈의 탐색이 제한됩니다. 포플러의 빠른 성장/다수확 육종의 급속한 발전에 비해, 이러한 육종 프로그램은 육종 첫 2년 동안 표현형 선택 또는 게놈 선택을 통해 잡종을 얻을 수 있다.4, 포플러 구내염 저항성 육종은 천천히 발달했다. 잡종 자손의 질병 저항성 스크리닝(또는 검출) 또는 병원체 접종 방법은 포플러 구내염 저항성 육종에서 중요한 속도 제한 단계가 되었습니다.

이 프로토콜에서는 포플러 줄기 구내염 병원균에 대한 새로운 접종 방법인 in vivo leaf 접종 방법을 소개합니다. 이 방법을 사용하면 5-7일 이내에 수십 종의 포플러 종(품종 또는 클론)의 구내염 저항성을 빠르고 효율적으로 테스트할 수 있습니다. 검증 분석은 in vivo 잎 접종이 줄기 구내염의 내성 검출에 대한 전통적인 in vitro 줄기 접종과 일치함을 보여주었으며, 이는 잎 접종 방법이 줄기 구내염의 육종에서 저항성 자손의 전체 유전자형 선택과 같은 포플러 구내염의 대규모 내성 스크리닝에 적합함을 시사합니다. 이 방법은 포플러 구내염의 잡종 번식에서 저항성 자손을 선택하는 병리학적 문제를 해결합니다.

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프로토콜

1. 구내염 병원체에 대한 진균 배양

  1. 곰팡이 균주에 대한 감자 포도당 한천(PDA; 감자 추출 6.0g, 포도당 20.0g, 한천 20.0g) 배양 배지를 준비합니다. 위의 물질을 최대 1000mL의 물에 용해시키고 매체를 100 °C에서 10 분 동안 완전히 용해시킵니다.
  2. PDA 배지를 25mL 튜브(각각 15.0mL 포함)에 붓습니다. 모든 튜브를 121.1°C에서 30분 동안 멸균합니다. 배지를 배양 플레이트(직경 9.0cm)에 붓고 플레이트를 실온(RT)에서 냉각합니다.
  3. 28 ° C의 PDA 배지에서 7 일 동안 배양 한 곰팡이 병원체의 균사체를 ~ 0.5cm 정사각형 입방체로 자릅니다. PDA 플레이트의 중앙에 있는 곰팡이 큐브를 접종합니다(균사체 측면이 배지를 향함).
  4. 온도 조절 인큐베이터(28°C, 어두운 곳에서)에서 7-10일 동안 곰팡이 병원균을 배양합니다.
  5. 곰팡이 균사체가 있는 PDA 배지를 정사각형 입방체(한 변 길이 1.0-1.2cm)로 자릅니다.

2. 포플러 재료의 준비

  1. 1 년 된 포플러 클론 (3 개월 > 재배)의 경우 주요 가지의 새로 성숙하고 완전히 확장 된 잎 (항상 5-7번째 잎, 묘목 / 가지 상단에서)을 접종 된 재료로 선택하고 해충, 질병 및 기계적 손상이 없는지 확인하십시오.
  2. 다년생 포플러 잡종 클론 (2 개월 > 재배)의 1 년 된 가지의 경우, 선택한 가지의 상단 5-7번째 잎을 접종 물질로 선택하십시오. 잎이 건강하고 테스트된 모든 포플러 클론 간에 동일한 조명 조건(그늘 또는 빛)을 가지고 있는지 확인하십시오.

3. 접종 잎의 전처리

  1. 포플러 잎에 깨끗한 물을 뿌리고 건조 후 접종 조작 1 시간 또는 1 일 전에 선택한 잎을 75 % 알코올로 닦으십시오.

4. 생체 내 잎 접종

  1. 작은 잎 (잎 너비 < 8.0cm)의 경우 두 개의 정사각형 곰팡이 균사체 큐브와 PDA (또는 물 한천, WA) 큐브 (한 변 길이 1.0-1.2cm)를 포플러 클론의 상단 5-7 잎의 윗면에 접종합니다. 균사체는 잎을 향합니다. 접종 부위가 중앙 정맥에서 ~ 1-2cm 떨어진 반 잎의 중앙에 위치해야하며 2 차 정맥을 가리지 않도록하십시오. 각 클론은 6개의 잎에 12개 부위(균사체용 10개 부위, PDA 접종용 2개 부위)에 접종합니다.
  2. 큰 잎 (잎 너비 ≥ 8.0cm)의 경우 4 개의 정사각형 곰팡이 균사체 큐브와 PDA (또는 WA) 큐브를 상단 5-7 개의 포플러 잎에 접종합니다. 각 클론은 3개의 잎에서 12개 부위(균사체의 경우 10개 부위, PDA 접종의 경우 2개 부위)를 접종합니다.
  3. 접종한 잎을 투명 접착 테이프(폭 6.0cm)로 감싸고 부드럽게 눌러 잎에 접착되도록 하여 실험 중에 균사체(또는 PDA) 큐브의 이동 및 수분 손실을 방지합니다.
  4. 바늘이 포플러 잎의 위쪽 표면에서 아래쪽 표면으로 큐브를 관통할 때까지 잎과 균사체(또는 PDA) 큐브를 5개 부위에 뚫습니다. 한 사이트는 중앙에 있고 다른 네 개는 큐브의 네 꼭짓점 근처 1-2mm에 있습니다.
    참고: 진균 접종 조작을 위해 3인 팀 협업이 권장됩니다. 포플러 잡종 개체군(>100개의 유전자형)에 대한 접종 조작은 팀워크를 통해 4시간 내에 수행할 수 있습니다. 피어싱 조작은 질병의 중증도에 대한 다양한 피어싱 시간의 영향을 완화하기 위해 테스트된 모든 잎을 접종하고 포장한 후에 수행되었습니다.
  5. 균사체 접종제의 위치 이동과 수분 손실을 검사하고, 접종3일째 까지 잎 아래쪽 표면에서 관통 상처 부위 주변의 괴사성 병변의 시작을 관찰합니다.
    1. 접종 후 3일 이내에 균사체 큐브의 위치 이동과 수분 손실을 관찰합니다. 이동 및 건조된 균사체 큐브를 비효율적인 접종으로 정의 및 표시하고 병원형의 최종 식별에서 폐기하는 동시에 다른 큐브를 효과적인 접종으로 정의합니다.
      참고: 이 프로토콜은 5개 이상의 효과적인 접종 큐브가 있는 테스트된 포플러 클론을 유효하지 않은 접종 클론으로 정의합니다. 그러므로, 각 포플러 클론은 적어도 30 개의 효과적인 접종 부위를 제공했으며, 이는 30 개의 독립적 인 괴사 지점으로 발전 할 것입니다.
  6. 실험이 끝날 때(접종 후 5~7일 후) 접종한 모든 잎을 떼어내고 비닐 샘플 백에 담아 실험실로 다시 가져와 4°C에서 보관합니다.

5. 실험실에서 줄기 구내염에 대한 포플러 저항성의 잎 병원형 획득 및 평가

  1. 잎에서 투명 접착 테이프와 균사체(또는 PDA) 접종제를 조심스럽게 제거합니다.
  2. 괴사성 반점의 모양과 색상을 포함하여 각 포플러 클론의 잎 병원형을 관찰하고 식별하며, 관통 부위 주변의 잎 표면에 형성된 곰팡이 균사와 같은 구조, pycnidia 및 분생포자를 포함할 수 있습니다.
  3. 카메라로 나뭇잎을 사진(추가 자 사용)하거나 스캐너를 사용하여 나뭇잎을 스캔(추가 자 사용)하여 해상도가 300dpi 이상인 이미지를 얻은 다음 이미지를 JPEG, TIFF 또는 PNG 형식으로 저장합니다.

6. 질병 발생의 파악 및 통계적 분석

  1. ImageJ 1.54g (http://imagj.org) 소프트웨어에서 병든 잎의 이미지를 엽니다.
  2. 나뭇잎 이미지의 자에 따라 눈금을 설정합니다.
  3. 지팡이(추적) 도구로 병변을 식별하고 측정합니다.
  4. 모든 괴사 지점의 면적을 측정한 후 면적 값을 기록하고 스프레드시트로 내보냅니다.
  5. 질병 판정을 위한 기준을 설정합니다.
    1. 관통 부위를 덮고 있는 균사체 큐브 주변의 병변 영역이 PDA 큐브로 덮인 것보다 훨씬 큰 경우 이러한 부위를 질병 부위로 정의합니다.
    2. PDA로 덮인 부위와 비교했을 때 균사체로 덮인 관통 부위의 형태학적 특성이 크게 변한 경우, 병변의 색상, 균사와 같은 구조를 생성하는 pycnidia, 분생포자 및 분생포자(conidia)는 해당 부위를 질병 부위로 정의합니다.
  6. 각 포플러 하이브리드 클론의 효과적인 PDA 병변 반점의 평균 면적을 계산합니다. 평균 면적에 따라, 한 포플러 클론의 모든 균사체 접종 지점을 발병 및 비발병의 두 가지 범주로 나눕니다. 그런 다음, 테스트된 포플러 클론의 질병 발병률을 계산합니다(공식 1: 질병 발병률(%) = 병든 찌르기 부위의 수/효율적인 찌르기 부위의 총 수 × 100).
  7. 잎에서 병든 반점의 평균 면적을 계산합니다 (n = 50). 테스트된 모든 포플러 클론에서 잎의 병든 반점의 평균 면적 값에 따라 5단계 질병 등급 기준을 설정합니다.
  8. 위의 질병 등급 기준(공식 2: 질병 지수 = ∑(수준별 찌르기 부위 수 × 모든 수준에서의 중증도 값)/(가장 높은 중증도 수준 × 효율적인 찌르기 부위의 총 수) × 100)에 따라 각 포플러 클론(화학식 2)의 질병 지수를 계산한다.
  9. 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 Shapiro-Wilk 테스트를 사용하여 다양한 저항 수준에서 포플러 클론 수의 정규 분포를 확인합니다.
  10. 질병 지수에 따라 테스트된 모든 포플러 클론을 매우 높은 저항성(VHR), 높은 내성(HR), 내성(R), 내성 없음 및 감수성 없음(NRNS), 감수성(S), 높은 감수성(HS) 및 매우 높은 감수성(VHS) 그룹5의 5개(또는 7개) 그룹으로 식별합니다.

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결과

이 프로토콜에서 도식적 워크플로우는 줄기 구내염 병원균 C. chrysosperma 에 감염된 48개의 포플러 하이브리드 클론에서 수행되었습니다(그림 1). 포플러 잡종 클론은 베이징 중국 임업 아카데미 (CAF)의 종묘장에서 재배 된 P. deltoides의 교잡 자손의 일부입니다.

줄기 구내염 병원체 C. chrysosperma isolate CZC는 포플러 구내염 6,7,8,9의 생리학적 연구에 사용되며 우리 실험실에 기탁된 전형적인 곰팡이 균주(중간 병원성)입니다. 그 결과, 줄기 구내염 병원균 C. chrysosperma를 접종...

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토론

이 프로토콜은 포플러 구내염 내성 병원체에 대한 빠르고 효율적인 접종 방법을 제공하며, 이는 포플러 구내염 내성의 하이브리드 육종 및 줄기 구내염 병원체의 병원성 스크리닝과 같은 대규모 질병 내성 스크리닝이 필요한 연구 분야에 적합합니다.

이 방법의 첫 번째 핵심은 성숙한 줄기/가지 대신 새로 성숙한 잎 접종으로 질병 저항성을 평가하는 것입니다. 결과적으로, 줄기 줄기 구내염 저항성 클론의 선택은 줄기 접종 경로(육종 후 5-7년)에서 시간이 많이 걸리는 저항성 스크리닝과 비교하여 잎 접종 방법을 사용할 때 포플러 잡종 육종의 1-2년 내에 수행될 수 있으며, 잎 방법은 포플러 줄기 구내염의 번식 주기를 급격히 단축합니다. 잎 방법의 두 번째 중요한 단계는 잎을 선택하는 것입니다. 잎의 질병 저항성은 잎 단계 관련 저항성12,13

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공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중앙 공익 과학 기관, 국가 핵심 나무 유전학 및 육종 연구소의 기초 연구 기금(보조금 번호 CAFYBB2020ZY001-2) 및 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 32171776)이 공동으로 Jiaping Zhao에 자금을 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알루미늄 호일BiosharpBS-QT-027B
C. chrysosperma isolateChina Forestry Culture Collection CenterCFCC86775우리 실험실에 의한 분리 및 보존
Cytospora chrysospermaPlant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry(중국임업학회)NCBI 등록 번호: rRNA-ITS의 경우 MK994101, EF1&alpha의 경우 MN025273; 유전자    CGMCC 번호:40575우리 실험실에 의한 분리
및 보존 Epson Perfection V370 PhotoEpson V370스캐너; 잎을 이미지
PDA(Potato Dextrose Agar)로 스캔 SolarbioP8931곰팡이 성장에 영양을 공급
PE 플라스틱 필름잎에 곰팡이를 고정하기 위해
Populus alba var. PyramidalisPlant Physiology Laboratory, Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry실험실에서 육성
SPSSIBM데이터 분석 소프트웨어
온도 조절 인큐베이터Shanghai Kuntian Laboratory Instrument Co., LtdKTD-6000곰팡이 성장 환경 제공
터프 TG-6 카메라올림푸스병든 잎의 사진을 찍습니다
합니다 우리 .

참고문헌

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