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방법 논문

박테리아 젤라티나제의 원스텝 추출 및 자이모그래피 분석

971 조회수

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DOI:

10.3791/67291

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2025년 8월 1일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ICMR Regional Medical Research Centre, Port Blair

이 논문에서

요약

단백분해효소는 박테리아 병인에 필수적이며 침입과 면역 회피를 가능하게 합니다. 활성 형태의 박테리아의 세포질 및 막 단백질을 단일 단계 추출하는 것은 끔찍한 일입니다. 이 비디오 기사는 젤라티나제를 검출하고 특성화하기 위한 자이모그래피 분석을 위해 렙토스피라의 전체 세포 단백질을 추출하는 방법을 보여줍니다.

초록

병원성 박테리아의 단백질분해효소는 숙주의 세포외 기질(ECM) 구성 요소와 세포 장벽을 적극적으로 분해하고 숙주 면역 반응을 수정하며 숙주 방어 시스템을 저하시켜 침입 및 병인에 기여합니다. 이로 인해 프로테이나제는 가장 독성이 강한 분자 중 하나가 되었으며 이들의 식별 및 특성화는 질병을 예방하고 통제하는 데 필수적입니다. 많은 박테리아는 또한 외막 결합 단백질분해제를 가지고 있습니다. 활성 형태의 외막 단백질의 분리 및 특성화는 외막 내 국소화로 인해 상당한 문제를 야기합니다. 이 연구에서 우리는 렙토스피라 에서 세포질 및 외막 관련 젤라티나제를 모두 추출하는 단일 단계 방법을 시연하고 자이모그래피를 사용하여 효소 활성을 입증합니다. 이 방법에서는 데옥시콜산나트륨을 사용하여 세포막을 파괴하고 결합된 단백질을 방출하고 6-아미노카프로산을 사용하여 방출된 막 단백질을 천연 형태로 가용화합니다. 또한, 우리는 렙토스피럴 젤라티나제의 자이모그래피 분석을 보여줍니다. 이 접근 방식은 다양한 박테리아 병원체로부터 메탈로프로테아제, 콜라게나제 및 젤라티나제를 분리, 정제 및 특성화하기 위한 다양한 프레임워크를 제공합니다.

서론

대부분의 세균성 병원체는 병인 동안 표적 기관에 침입 및 전파되는 동안 숙주의 세포외 기질(ECM)을 만나야 합니다. 콜라겐은 동물 조직의 ECM에서 주요 구성 요소를 형성합니다1. 젤라티나제는 콜라겐과 가수분해 형태인 젤라틴에 작용하는 프로테아제 그룹입니다. ECM 분해는 주로 콜라게나제 및 젤라티나제를 포함하는 프로테아제 그룹에 의해 실행됩니다 2,3. 박테리아 병원체는 콜라게나제와 젤라티나제를 사용하여 침입 및 병인의 편의를 위해 숙주 ECM을 리모델링하거나 분해합니다 4,5. 박테리아 ECM 분해 효소는 백신 및 약물 표적화의 잠재적 후보입니다5.

박테리아 프로테아제는 분비 및 막 결합 형태로 발견됩니다 6,7,8,9. 세포 효소 추출을 위한 많은 방법은 막 결합 박테리아 젤라티나제 및 콜라게나제를 분리하는 데 효과적이지 않은데, 이러한 절차는 막 결합 단백질의 천연 형태를 효율적으로 보존하지 못할 수 있기 때문입니다. 유사하게, 막 결합 프로테아제와 젤라티나제만 추출하는 막 특이적 방법이 있습니다. 막 단백질을 포함한 총 단백질에 대한 기존의 추출 방법에는 효소 활성에 영향을 미칠 수 있는 세제와 카오트로픽 이온이 포함되는 경우가 많습니다. 효소 활성과 용해도를 유지하는 추출 절차는 전기영동 분리에 필수적이며 프로테아제 활성을 검출하기 위한 자이모그래피 개발을 가능하게 합니다.

세포막을 파괴하여 세포를 용해할 수 있는 이온성 세제인 데옥시콜산나트륨은 세포 내용물과 막 단백질의 방출을 가능하게 합니다. 6-아미노카프로산은 방출된 막 단백질을 천연 형태로 가용화할 수 있습니다. 6-아미노카프로산에 의한 가용화는 전기영동에 영향을 미치지 않는다는 장점이 있습니다. 여기에서는 데옥시콜산나트륨과 6-아미노카프로산을 사용하여 세포 및 막 결합 박테리아 단백분해효소를 추출하여 천연 가용성 형태로 안정화하는 방법을 보여줍니다 10,11,12. 이 방법은 전기영동을 방해하지 않고 직접 사용할 수 있는 세포와 막의 단백질을 효과적으로 용해시킵니다13,14. 응용 분야에 따라 활성화 완충액에 사용되는 프로테아제 억제제와 금속 이온을 변경하여 다양한 효소 특성화를 수행할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 박테리아 젤라티나제 추출

참고: 시약 및 재료의 준비는 표 1 을 참조하십시오.

  1. 30°C에서 10mg/mL의 소 혈청 알부민을 함유한 EMJH(Ellinghausen McCullough Johnson Harris) 배지에서 유기체를 배양합니다. 추출 프로테이나아제 13,14를 위해 3.5 × 108 cells/mL를 포함하는 성장의 중간 로그 단계에서 렙토스피라 배양액10mL를 섭취합니다. 암시야 현미경 아래에서 Petroff-Hausser 계수 챔버와 함께 직접 현미경 계수를 사용하여 성장의 중간 로그 단계를 관찰합니다.
  2. 6,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수확하고, 121°C에서 60분 동안 고압멸균하여 오염 제거를 위해 상청액을 용기에 버립니다.
  3. 펠릿을 1mL의 세척 완충액에 현탁시켜 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 옮기고 6,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 이 세탁을 반복하십시오.
  4. 10mL의 배양액에서 렙토스피라 펠릿용 추출 완충액 100μL를 첨가하여 펠릿에서 단백질을 추출하고 5분 동안 소용돌이치게 합니다. 4°C에서 1시간 동안 배양하여 추출을 계속합니다. 추출한 단백질을 15,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 수집하고, 펠릿을 용기에 버려 121°C에서 60분 동안 고압멸균하여 오염 제거를 한다.
  5. 단백질 추출물을 동일한 부피의 2x 샘플 완충액을 추가하여 자이모그래피에 직접 사용합니다.
  6. Bradford 추정 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.
  7. 단백질 농도가 낮으면 침전을 위해 단백질을 4배 부피의 아세톤과 혼합하여 아세톤과 침전시키고 -20°C에서 하룻밤 배양합니다. 다음날, 샘플을 10,000× g 에서 10분 동안 원심분리하고 생성된 펠릿을 자연 건조시킨 다음 PBS에 재현탁하거나 원하는 완충액에 용해시켜 -20°C에서 최대 1개월 동안 보관합니다. 장기 보관 또는 운송을 위해 동결건조를 사용하십시오.
    참고: 추출물의 활성 프로테아제와 프로테아제 억제제의 부재로 인해 단백질은 샘플에서 분해될 수 있습니다.

2. 젤라티나제의 자이모그래피

  1. 젤라틴 공중합 SDS PAGE 겔의 제조
    1. 젤 분해
      1. 겔을 주조하는 데 필요한 양의 성분을 첨가하여 분해 젤 혼합물을 만듭니다. 50mL 비커의 물 3.86mL에 Tris-HCl(pH 8.8) 2.5mL, 10% 젤라틴 원액 0.1mL, 아크릴아미드-비스 아크릴아미드 용액(ABA) 3.34mL, 10% SDS 0.1mL, TEMED 0.006mL, 10% 과황산암모늄 0.1mL를 넣고 거품 및 기포 없이 잘 혼합합니다. 언급된 시스템(일반 유리판, 18 x 8cm)에는 10mL의 분해능 겔 혼합물이 필요합니다.
        참고: 젤라틴이 냉동 분취량에서 나온 것이라면 녹을 때까지 해동하여 덩어리 없이 용액을 제거합니다. 과황산암모늄을 첨가한 직후 중합이 시작되기 때문에 주조 직전에 과황산암모늄을 첨가하십시오.
      2. 분해 젤 혼합물을 웰 바닥 표시 아래 최대 ~3-5mm까지 주조 챔버에 붓습니다. 기포를 피하십시오.
      3. 젤 상단에 균일한 1mm 층을 얻기 위해 약간의 물을 천천히 붓고 거품을 제거합니다. 젤을 1시간 동안 설정하도록 합니다.
        참고: 겔 형성은 물 층과 겔 사이의 상 분리를 찾아 확인할 수 있습니다. 젤 카세트를 기울여도 젤을 부을 수 없습니다.
    2. 스태킹 젤
      1. 다음 구성 요소를 혼합하여 스태킹 젤을 준비합니다. 10mL 비커에 물 1.84mL에 Tris-Cl(pH 6.6) 2.5mL, ABA 0.35mL, 10% SDS 0.03mL, TEMED 0.006mL를 첨가합니다. 1mm 두께의 8 x 10cm 시스템에는 3mL의 분해능 겔 혼합물이 필요합니다.
      2. 젤 카세트에서 젤 설정을 한쪽으로 기울이고 좁은 여과지 스트립을 사용하여 모서리에서 수집된 물을 닦아내어 젤 상단에 형성된 물을 디캔팅합니다.
      3. 2.1.2.1단계에서 언급한 혼합물에 10% APS 0.03mL를 첨가하고 기포를 형성하지 않고 혼합합니다.
      4. 스태킹 젤을 분해 젤에 붓고 빗 이빨 아래에 기포를 형성하지 않고 빗을 제자리에 즉시 놓고 분해 젤과 빗 이빨 바닥 사이에 3-5mm 두께의 스태킹 젤을 남깁니다. 젤라틴의 완전한 중합 및 가교를 위해 최소 3시간 동안 기다립니다.
      5. 하부 스페이서를 꺼내 전기영동 장치에 젤을 고정합니다.
      6. 1x 전극 완충액이 들어 있는 탱크에 젤을 천천히 넣고 젤 바닥에 갇힌 공기가 없는지 확인합니다.
  2. 샘플 준비
    1. 추출물에 동일한 부피의 샘플 완충액을 첨가하고 SDS가 단백질에 결합할 수 있도록 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 2 μL의 인간 혈청을 포함하는 샘플과 동일한 부피의 샘플 완충액을 양성 대조군으로 사용합니다.
  3. 샘플 로드
    1. 팁이 좁은 피펫 또는 Hamilton 주사기(0.5-1mL)를 사용하여 샘플을 웰에 조심스럽게 로드합니다. 전극 완충액을 점차적으로 추가하여 로드된 샘플을 방해하지 않고 웰의 나머지 부분, 겔의 상단 및 전기영동 장치의 상부 탱크를 채웁니다.
      알림: Hamilton 주사기는 교차 오염을 피하기 위해 s들 사이에서 철저히 세척해야 합니다.
  4. 전기 영동 실행
    1. 겔당 6mA에서 전기영동을 시작하고 염료 전면이 분리 겔에 들어갈 때까지 실행합니다. 그런 다음 전류를 겔당 12mA로 늘리고 염료 전면이 겔 바닥에서 1cm 위에 도달할 때까지 계속합니다.
      참고: 실행 시간은 사용된 ABA의 농도와 표적 단백질의 크기에 따라 변경될 수 있습니다.
  5. 표준 밴드의 방향 표시
    1. 전기영동을 완료한 후 플레이트 분리 도구 또는 플라스틱 주걱을 사용하여 유리판을 조심스럽게 분해하고 겔의 오른쪽 하단 모서리를 절단하여 샘플 로딩 방향을 표시하고 근처에 구멍을 뚫거나 젤을 스캔하여 미리 염색된 마커 밴드를 표시합니다.
  6. 분해된 효소의 재생
    1. 젤 트레이에 Triton X-100을 함유한 재생 용액에 겔을 담그고 흔들지 않고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
      참고: Triton X-100은 분해된 단백질을 포함하는 자이모그램 겔이 SDS의 존재 하에서 변성되고 활성을 잃을 수 있으므로 단백질을 재변성합니다.
  7. 프로테아제 활성을 위한 배양
    1. 재생 용액을 겔을 완전히 잠기는 활성화 완충액으로 교체하고 인큐베이터에서 37°C에서 18시간 동안 배양합니다.
      참고: 필요에 따라 단백질분해효소 활성을 특성화하기 위해 관심 있는 단백질분해제의 억제제 또는 활성화제를 추가하여 활성화 완충액을 수정합니다.
  8. 자이모그램의 염색
    1. 배양 후 활성화 완충액을 제거하고 젤을 물로 1분 동안 잠시 헹구어 남아 있는 Triton X-100을 제거하고 흔들기 동안 거품이 생기는 것을 방지합니다.
    2. 트레이에 염색 용액을 추가하여 젤이 완전히 잠기도록 합니다. 손상을 방지하기 위해 젤을 저속으로 부드럽게 흔듭니다. 젤이 완전히 파란색으로 변할 때까지 염색을 계속합니다.
    3. 젤 표면의 여분의 얼룩을 물로 1분 동안 헹구어 제거합니다. 탈색액을 트레이에 넣고 부드럽게 흔듭니다. 파란색 배경에 대해 원하는 밴드 대비가 달성될 때까지 탈색 용액을 새 용액으로 여러 번 교체합니다.
      참고: 탈색을 수행하는 동안 겔이 완전히 탈색되지 않도록 지속적으로 모니터링하여 단백질 분해 밴드를 관찰하고 기록할 수 있도록 합니다.
    4. 겔 문서화 시스템 또는 문서 스캐너에서 겔을 스캔하고 단백질 표준과 비교하여 단백질 밴드의 분자량을 결정합니다.

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결과

결과는 인간 혈청에서 렙토스피럴 단백질과 젤라티나제의 자이모그램을 보여줍니다. 그림 1에 표시된 결과는 프로테아제를 파란색 배경에 흰색 투명 밴드로 나타냅니다. 밴드는 공중합된 젤라틴이 분해되어 염색되지 않는 영역을 나타내는 반면, 전체 젤의 다른 영역은 젤라틴의 존재로 인해 파란색으로 염색됩니다. 또한, 젤라틴도 단백질임에도 불구하고 아크릴아미드와의 공중합으로 인해 전기영동에서 용출되지 않는다는 것을 보여준다. 이것은 공중합과 올바른 조성 및 중합을 위한 충분한 시간의 중요성을 보여줍니다.

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그림 1: 젤라티나제 활성을 보여주는 자이...

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토론

아크릴아미드 겔을 제조하는 동안 젤라틴은 아크릴아미드 폴리머 매트릭스와 공중합됩니다. 결과적으로, 공중합된 젤라틴은 겔 내에 고정된 상태로 유지되며 단백질임에도 불구하고 전기영동 중에 이동하지 않습니다. 전기영동 후, 데옥시콜레이트와 6-아미노카프로산 완충액을 사용하여 추출된 천연 단백질은 질량과 전하에 따라 분리됩니다. SDS를 제거한 후 이러한 단백질은 Triton X-100의 존재 하에서 재성화되어 활성을 회복합니다. 천연 조건에서 다양한 젤라티나제의 요구 사항에 따라 효소는 공중합 젤라틴을 분해하며 해당 부위는 쿠마시 블루로 염색될 수 없습니다. 이러한 밴드는 염색된 젤을 스캔한 후 밀도계를 사용하여 정량화할 수 있습니다.

여기에 사용된 추출 방법은 박테리아 세포에서 천연 단백질의 총 단백질을 추출할 수 있을 만큼 강력합니다. 프로테아제는 일반적으로 가수분해 특성으로 인해 생물학적 시스템에서 엄격하게 조절되기 ...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 MGM에 대한 보조금 No.SR/S0/HS/0108/2012 를 통해 지원해 준 뉴델리 과학기술부 SERB 부서에 감사를 표합니다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6-아미노카프로산드머 크A2504
아세트산  시그마  695092
아세톤    시그마  32201
아크릴아미드    시그마  A-3553
과황산암모늄    시그마  A-3678
비스 아크릴아미드    시그마  M7279
소 혈청 알부민 분획 V(BSA)  시그마  A-8022
브로모페놀 블루    시그마  B-8026
CaCl2머 크C4901
쿠마시 브릴리언트 블루    시그마1.12553
데옥시콜레이트    시그마-알드리치D6750
엘링하우젠– 맥컬로– 존슨– 해리스(EMJH) 미디엄, 디프코  디프코  279410
젤라틴머 크지9382
글리세롤머 크지5516
글리신 G8790    시그마  지-8898
렙토스피라 인터로건스 혈청형 코펜하겐 균주 Fiocruz L1-130(ATCC BAA-1198) , ICMR-RMRC Portblair의 생물 저장소에서 유지 관리ICMR-RMRC Port Blair의 생물 저장소에서 유지 관리최적 성장 온도 30 ° C
염화마그네슘 M8266  시그마  M8266
메탄올    시그마  17995-7
인산염 완충 식염수    시그마P4417 
플레이트 분리 도구원더 웨들
회전자열과학파이버라이트 F15 8x50 사이
도데실 황산나트륨(SDS)    시그마  L-4396
테메드    시그마  T-9281
트리톤 X-100    시그마-알드리치T8787
트리즈마 베이스(TRIS)     시그마  티6066

참고문헌

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  14. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  15. Zeug, A., et al. Current microscopic methods for the neural ECM analysis. Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).
  16. Madathiparambil, M. G., et al. A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira. Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).

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