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방법 논문

Triton X-114 기반 분획 접근법을 사용하여 렙토스피라의 세포하 단백질 농축

1.5K 조회수

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DOI:

10.3791/67298

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2025년 8월 8일

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1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

이 논문에서

요약

원핵생물에는 소기관 시스템이 없지만 국소적인 단백질이 있는 세포 내 영역이 있습니다. 세포 내 영역의 효소와 단백질에 대한 정량적 및 정성적 분석은 약물 및 백신 표적을 개발하는 데 중요합니다. 여기에서는 Triton X-114를 사용한 렙토스피럴 단백질의 세포내 분획과 그 분석을 설명합니다.

초록

원핵생물은 정확한 세포 내 소기관이 없지만 대부분의 생화학적 및 생리학적 기능이 조직화되는 세포질, 내막, 주변질 및 외막과 같은 뚜렷한 영역을 나타냅니다. 따라서 단백질의 기능적 특성을 이해하려면 단백질의 세포 내 국소화를 밝혀야 합니다. 그러나 그람 음성 박테리아에서 세포내 단백질을 추출하는 것은 복잡한 인지질 이중층으로 인해 어려움을 겪습니다. Triton X-114는 외막 단백질(OMP) 추출에서 가능성을 보여주었지만 간결한 프로토콜은 여전히 파악하기 어렵습니다. 이 프로토콜은 스피로헤타 렙토스피라 를 모델로 사용하여 세포내 단백질을 추출하기 위한 단계별 워크플로를 보여줍니다. 세포 내 분획 및 상 분리를 특징으로 하는 이 기술은 세포질, 외부 및 내막 단백질에 대해 뚜렷한 분획을 생성합니다. 세제 Triton X-114는 최적의 운점 온도(~22°C)와 낮은 임계 미셀 농도(CMC)로 인해 상 분리에 매우 적합하여 변성을 최소화하면서 천연 단백질을 효율적으로 추출하고 정제할 수 있습니다. 특히, 분석 결과 세포질과 구별되는 내막과 외막의 단백질을 구별하는 효율성이 밝혀졌습니다.

서론

세포하 단백질체학(SCP) 분석은 박테리아 세포의 특정 세포하 구획 내의 프로테옴을 분석하여 박테리아 발병기를 밝히는 데 중추적인 역할을 합니다. 이 세포 내 단백질체학 접근법은 별개의 구획 내에서 박테리아 단백질을 특성화하여 매우 풍부한 단백질을 제외하고 조직 및 비례 풍부도에 대한 통찰력을 제공하여 복잡성을 줄입니다 1,2. 예를 들어, 세포 내 분획 및 LC-MS/MS 기술을 사용하여 Shewanella oneidensis에 대한 연구에서는 프로테옴의 상당 부분이 공개되어 세포 및 단백질 풍부도의 구획 구조에 관한 중요한 세부 정보를 제공했습니다. 이 연구는 그람 음성 박테리아3 내에서 세포 내 조직에 대한 후속 조사를 위한 기본 프레임워크 역할을 합니다. 박테리아 발병 기전 영역에서 생체 내 감염 동안 박테리아 프로테옴을 묘사하는 것은 병원성을 유발하는 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다4. 다양한 감염 단계에 걸쳐 상피 세포 내 세포내 살모넬라균의 프로테옴을 조사하는 것은 세포 내 환경 내에서 박테리아 병원체가 사용하는 적응 전략을 밝히는 데 중요한 역할을 했습니다 4,5. SCP 전략은 다양한 세포 구획 내의 단백질 풍부도와 전좌를 평가하여 세포 역학에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. 이 방법은 다양한 박테리아 구획에서 단백질을 광범위하게 식별하여 박테리아 프로테옴의 철저한 분석을 향상시킵니다 6,7.

단백질의 세포하 분포는 기능적 활동을 결정할 뿐만 아니라 기능적 다양성을 향상시킵니다8. 예를 들어, 효소는 세포내 국소화에 따라 다양한 조절 메커니즘과 활성 수준을 나타냅니다. 예를 들어, 트랜스글루타미나제(TGase)는 꽃가루관의 서로 다른 세포하 구획에 걸쳐 뚜렷한 역할 또는 조절 메커니즘을 나타냅니다: 세포질 TGase는 Ca(2+) 의존성 방식으로 1차 아민을 세포질 단백질(예: 액틴 및 튜불린)에 통합하여 세포골격과 상호 작용합니다. 막 TGase는 골지체 및 원형질막과 연관되어 있으며, 이는 엑소 세포 작용 전달에서의 역할을 시사합니다. 세포벽 관련 TGase는 세포벽 마커와 공국소화하여 정점 성장을 조절합니다. 이러한 기능적 구별은 구획별 역할9에 의해 매개됩니다. 또한, 박테리아 외피에서 산화된 단백질의 복구는 활성 산소종에 노출된 특정 세포 구획 내에서 효소 시스템의 중요한 역할을 강조합니다10. 세포내 국소화가 지질 변형에 의해 조절되어 다양한 세포막과의 상호 작용에 영향을 미치는 내피 산화질소 합성효소(eNOS)를 고려하십시오11. 효소 구획화는 효소와 기질 사이의 상호 작용에 도움이 되는 뚜렷한 환경을 유지하여 구획 특이적 대사 과정을 촉진합니다12.

박테리아 및 기타 원핵생물은 명확한 세포 내 소기관을 가지고 있지 않습니다. 세포질, 내막, 주변질, 외막 등 뚜렷한 영역이 있습니다. 유기체의 생화학적 및 생리학적 기능의 대부분은 다양한 지하 구획에 조직되어 있습니다13. 따라서 단백질의 세포내 국소화는 단백질의 기능적 특성을 예측하는 데 중요합니다. 그러나 그람 음성 박테리아에서 세포내 단백질을 추출하는 것은 복잡한 이중막 인지질 이중층으로 인해 어려움을 겪습니다. SDS(나트륨 도데실 황산염)와 같은 세제와 요소와 같은 첨가제를 사용하는 기존의 추출 방법은 종종 막 단백질 무결성을 손상시켜 다운스트림 분석에 영향을 미칩니다14,15. 더욱이, 지질 조성은 막 단백질의 구조적 변화를 형성하는 데 중요한 역할을 합니다. 가용화의 성공 여부는 세제-지질-단백질 비율과 같은 요인에 따라 달라지는데, 이 과정에는 지질 이중층에 세제 삽입 후 단백질 가용화가 포함되기 때문입니다16. 세제의 선택은 흐림점 온도 및 배양 시간과 같은 요소를 고려하여 막 단백질을 효과적으로 가용화하는 데 중요합니다17. 지질 환경은 막 단백질의 형태 변화에 영향을 미칠 수 있습니다18,19.

세제는 생물학적 막에서 막 단백질을 추출하고 수용액에 대한 용해도를 보장하는 데 필수적이며, 이는 후속 단백질 정제의 전제 조건입니다. 그러나 막 단백질을 정제하는 것은 천연 지질 막 환경에서 제거되어 막의 물리적, 화학적 특성을 부분적으로만 복제하는 세제 완충액에 넣기 때문에 종종 어려운 일입니다20. 추출 후 막 단백질은 일반적으로 투석, 단백질 침전 및 일부 크로마토그래피 방법을 용해성 단백질로 사용하여 후속 공정에서 정제됩니다20,21. 상 분리는 크로마토그래피 기반 정제 프로토콜에 대한 강력한 대안 또는 보완을 제공하며 가용화된 단백질에 직접 적용할 수 있습니다. 기본적으로 상 분리를 통해 통합 막 단백질이 세제 농축상으로 분열되고 세제가 고갈된 수성상에서 세포질 단백질로 분할될 수 있습니다20,22. 이전 연구에서 여러 세제가 막 단백질의 가용화에 사용되는 것으로 설명되었습니다20. 여기에는 Triton 계열(Triton X-100 및 Triton X-114), Tween 계열(Tween-20, & -80), 음이온 세제, 양이온성 세제, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 모노에테르 세제 등이 포함되지만 단백질, 구조 및 기능 측면에서 장단점이 있습니다20. 이러한 세제의 물리화학적 특성은 막 단백질의 상 분배 및 가용화에 큰 영향을 미칩니다20. 세제는 극성 헤드그룹과 소수성 탄화수소 사슬을 가진 양친성 분자입니다. 낮은 농도에서는 물 속에 단량체로 존재합니다. 임계 미셀 농도(CMC) 이상에서는 크기가 세제 유형에 따라 달라지는 미셀을 형성하며, 응집 수는 미셀당 분자 수(미셀 분자량이라고도 함)를 나타냅니다. 또 다른 중요한 요소는 탁해져서 결국 두 개의 별개의 상을 형성하는 미셀라 세제 수용액의 온도를 변경하여 도달할 수 있는 "운점"입니다. 이 과정을 상 분리 또는 운점 추출이라고 합니다. CMC가 높을수록 결합력이 약한 고농도의 세제에 해당하는 더 많은 막 단백질을 생성할 수 있으며, 이는 정의된 세제 농도의 완충액에 대해 투석할 수 있습니다20. 그러나 대부분의 세제에서 높은 CMC에 도달하려면 높은 탁점 온도가 필요하며, 이는 추출된 단백질 구조와 기능에 영향을 미치고 다운스트림 공정에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 단계에서 고농도의 세제조차도 단백질에 해로울 수 있으며 높은 점도로 인해 정확한 부피를 피펫팅하기 위한 액체 취급에 문제를 일으킬 수 있습니다. 예를 들어, 트리톤 X-100은 64-65°C의 흐름점 온도 이상에서 세제 미셀에서 막 단백질의 수율이 높습니다. 작동 온도를 유지하기 위해 9%-23%(NH4)2그렇게4 또는 16%-25% NaCl 첨가를 실온(RT)으로 환원하여 고농도의 세제를 생성하여 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로 트윈 기반 추출은 높은 운점 온도(트윈 20의 경우 76°C, 트윈 80의 경우 93°C)를 사용합니다. 음이온 세제 SDS는 단백질 응용 분야에 자주 사용되지만 일반적으로 단백질을 변성시킵니다20. 멤브레인 단백질을 효율적으로 추출하는 것을 목표로 하는 연구원들은 Triton X-114가 막 단백질 연구에 이상적인 약 22°C의 최적 운점 온도로 인해 고전적인 세제임을 확인했습니다. 1981년 Bordier가 처음 출시한 Triton X-114는 이후 미생물뿐만 아니라 동식물 조직을 포함한 다양한 공급원에서 막 단백질 추출 및 정제에 널리 사용되었습니다20,22. Triton X-114의 낮은 CMC는 투석에 의한 제거를 방지합니다. 그러나 온화한 특성으로 인해 세제 농축 단계에서 막 단백질의 변성이 최소화됩니다. 또한 Triton X-114는 Triton X-100에 비해 더 작은 미셀(n = 7-8)을 형성합니다20. James G. Pryde의 연구 프로토콜은 배양된 포유류 세포에서 막 단백질 추출을 위해 Triton X-114를 사용했습니다. 20°C 이상의 운점 온도(30°C에서 3분 동안 배양)를 사용하여 통합 막 단백질은 세제가 풍부한 상으로 분할되고 말초 및 세포질 단백질은 세제가 고갈된 수성상에서 회수되었습니다22. 또한, David A. Haake et al. Triton X-114를 사용하여 외막 단백질(OMP)을 추출했습니다. Leptospira interrogans, CaCl 유무에 관계없이2 첨가제로23,24. 이후 연구에 따르면 Triton X-114는 글리세롤이나 CaCl과 같은 첨가물 없이 세포하 구획에서 OMP를 효과적으로 추출하는 것으로 확인되었습니다225,26. 그러나 염을 포함하면 세제 농도가 증가할 수 있으며, 이는 고처리량 질량 분석법을 사용한 대규모 프로테옴 연구에 영향을 미칠 수 있습니다20. 세포내 단백질체 분석에 대한 연구에서 우리는 탠덤 질량 분석법과 결합된 Triton X-114를 사용하여 세포질, 내막 및 외막 단백질을 포함한 모든 세포 내 구획에서 상당한 농축을 달성했습니다25,26. 본 프로토콜의 주요 목표는 다운스트림 공정의 문제를 최소화하면서 전형적인 그람 음성 박테리아 세포의 세포하 구획을 효율적으로 풍부하게 하는 것입니다. 또한, 이 프로토콜은 비용 효율적이고 시간 효율적으로 설계되었습니다. 여기에서는 세포내 단백질 분리를 위해 실험실에서 개발한 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명하고 추출 과정에서 발생하는 각 병목 현상에 대해 논의합니다.

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프로토콜

참고: 이 프로토콜은 세포내 단백질 추출 실험을 위해 렙토스피라 인터로건 을 활용합니다. 이 프로토콜은 다른 그람 음성 박테리아와 함께 사용하도록 조정할 수 있지만 특정 연구 목표에 따라 최적화가 필요할 수 있습니다. 재료표 와 표 1 은 각각 완충액 및 시약 용액의 구성과 함께 화학 물질 및 장비 목록을 제공하고 표 2는 실험실 시설을 간략하게 설명합니다.

1. 렙토스피라 균주 및 배양 조건

  1. L. interrogans 혈청군 Icterohaemorrhagiae 혈청형 Copenhageni 균주 Fiocruz L1-130을 얻습니다.
    참고: 이 균주는 렙토스피라증 진단, 참조, 연구 및 훈련을 전문으로 하는 WHO 협력 센터인 인도 포트 블레어에 있는 인도 의학 연구 위원회 - 지역 의학 연구 센터에서 얻었습니다.
  2. 1% 소 혈청 알부민(BSA)이 보충된 50mL의 Ellinghausen McCullough Johnson Harris(EMJH) 배지 50mL에서 렙토스피라 (~1 × 106 cells/mL를 함유하는 접종물)를 배양합니다.
  3. 배양액이 중간 로그 성장 단계(3.5 × 108 cells/mL)에 도달할 때까지 30°C에서 배양합니다. 배지가 오염되지 않은 상태로 유지되는지 확인하기 위해 영양 한천 플레이트에서 배양 배지의 분취량을 테스트합니다.
    참고: 암시야 현미경과 Petroff-Hausser 계수 챔버를 활용하여 세포를 계수합니다. 자세한 내용은 이전에 게시된 기사27을 참조하십시오.

2. 세포 수확

  1. 7일의 배양 기간 후, L. interrogans 배양의 3개의 생물학적 복제물을 동일한 부피(각각 25mL)의 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    참고: 렙토스피라 배양은 이송 중에 BSL-2 실험실 시설의 층류 공기 흐름 후드 내부에서 처리되었습니다.
  2. 모든 튜브를 2500 × g 에서 4°C에서 45분 동안 원심분리합니다. 상청액을 소독제가 들어 있는 비커에 조심스럽게 디캔팅하고 버립니다. 다음 단계에 세포 펠릿을 사용하십시오.
  3. 5mM MgCl2가 보충된 인산염 완충 식염수(매번 1mL)로 세포 펠릿을 3회 세척하고, 각 세척 후 4°C에서 10분 동안 10,000 × g 에서 원심분리합니다.
    참고: 이 단계는 세포 펠릿 표면에서 EMJH 배지에 존재하는 원치 않는 BSA를 제거합니다.

3. 세포하 단백질 추출

  1. Triton X-114 추출
    1. 수확 후 얻은 렙토스피라 세포 펠릿을 수확된 펠릿당 1mL의 비율로 10 mM Tris-Cl (pH 8), 1% Triton X-114 및 150 mM NaCl을 포함하는 추출 완충액으로 처리한다 (표 1) (선택 사항 - 프로테아제 억제제 칵테일은 실험 목적에 따라 첨가할 수 있다).
      참고: 이 절차에는 막 단백질을 추출하기 위해 추출 완충액을 첨가하여 박테리아를 세제 용액에 간단히 노출시키는 것이 포함됩니다.
    2. 용액이 시각적으로 탁해질 때까지 25°C 이하의 마이크로피펫을 사용하여 추출 완충액을 펠릿과 부드럽게 혼합합니다.
    3. 혼합물을 4°C에서 밤새 배양합니다.
    4. 생성된 추출물을 마이크로피펫으로 다시 혼합하고 15,000 × g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
    5. 상청액을 다른 바이알에 디캔팅하고 후속 추출 과정을 위해 세포 펠릿을 보관합니다.
      참고: 이 상청액은 세포질과 외막에서 풍부한 친수성 및 소수성 단백질의 혼합물을 함유하고 있으며 상 분리에 사용됩니다.
    6. 10mM Tris-Cl(pH 8), 8M 요소, 프로테아제 억제제 칵테일 및 1% 도데실 황산나트륨(SDS)을 함유한 완충액 50μL를 세포 펠릿에 첨가합니다.
    7. 추출 완충액을 첨가한 후 혼합물을 5분 동안 지속적으로 소용돌이치게 한 다음 4°C에서 5분 더 배양합니다.
    8. 혼합물을 4°C에서 30분 동안 15,000× g 으로 다시 원심분리하고 생성된 상청액을 펠릿 분획(P)으로 지정합니다.
      참고: 펠릿 분획은 렙토스피라25,26에서 다량의 내막 단백질을 포함하는 것으로 밝혀졌습니다.
  2. 위상 파티션
    1. 추출에서 얻은 상청액의 Triton X-114 농도를 2%로 조정합니다. 예를 들어, 상청액 부피가 900μL인 경우 원하는 농도를 얻기 위해 9μL의 Triton X-114 세제를 추가합니다.
    2. 혼합물을 37°C에서 1시간 동안 배양한 다음 2000×g에서 30°C에서 5 분 동안 원 심분리합니다. 이 저속 원심분리는 상 분리를 가속화할 수 있습니다.
    3. 혼합물을 수성과 세제의 두 단계로 분리합니다. 가시적인 분리를 달성하기 위해 저속에서 적절한 원심분리를 보장합니다. 필요한 경우 격리하기 전에 1분 동안 그대로 두십시오. 분리가 발생하지 않으면 필요에 따라 3.2.2단계를 반복합니다.
      참고: 상 분리는 분광 광도계를 사용한 탁도 측정 또는 정적 광 산란을 통해 육안으로 관찰할 수 있습니다. 흐점 분석의 정확도를 높이려면 500nM 농도의 소수성 염료(5-헥사데카노일-아미노이오신)를 용액에 첨가하고 자외선-가시광선 분광법(UV-VIS)으로 분석합니다.
    4. 멸균 주사기로 인터페이스를 뚫고 별도의 바이알로 옮겨 상부 수성상을 분리합니다. 마이크로피펫을 사용하여 바닥 세제 상을 분리하고 별도의 바이알에 보관합니다.
      알림: 분리 과정에서 두 단계가 모두 들어 있는 바이알을 조심스럽게 다루십시오. 주사기로 바이알을 뚫기 전에 바늘이 파손되거나 상부 수성상을 추출하는 데 어려움이 생기지 않도록 뚜껑을 열십시오. 주사기를 사용하면 분리 후 각 상의 부피를 보다 정확하게 측정할 수 있으며 상 간 단백질 교차 오염을 최소화할 수 있습니다.
    5. 상을 수성(A)과 세제(D)로 표시하고 나중에 사용할 수 있도록 -20°C에서 보관합니다.

4. 단백질 추정

  1. 비신코니닉 분석법(28 ) 또는 임의의 다른 적절한 방법을 사용하여 각 Triton X-114 분획(수성, 세제 및 펠릿)의 단백질 농도를 평가합니다.

5. 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔 전기영동

참고: 각 분획(수성, 세제, 펠릿)의 단백질은 베타-메르캅토에탄올로 처리하여 환원한 다음 10% SDS-PAGE(3개의 생물학적 복제)를 사용하여 분리해야 합니다. 10% SDS-PAGE의 제조법은 표 1에서 찾을 수 있습니다. 단백질 샘플 표적화의 경우 모든 효소 활성 분석은 천연 PAGE에서 분해할 수 있는 천연 형태로 수행되어야 합니다.

  1. 샘플 부피의 4배를 사용하여 얼음처럼 차가운 아세톤에 단백질 샘플을 재현탁합니다. 혼합물을 -20°C에서 최소 2시간 동안 배양한 다음 14,000 × g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 또한 펠릿 분획을 80% 얼음처럼 차가운 아세톤에 재현탁한 다음 4°C에서 5분 동안 배양합니다. 14,000 × g 에서 10분 동안 원심분리하여 과도한 요소염 결정을 제거합니다.
  2. 원심분리 후 상청액을 조심스럽게 제거하고 모든 잔류 아세톤이 바이알에서 증발할 때까지 단백질 펠릿을 건욕조에 넣습니다.
  3. 단백질 샘플을 베타-메르캅토에탄올이 함유된 20μL 샘플 완충액에 배양한 다음 수조 또는 건식 수조에서 95°C에서 10분 동안 가열합니다.
    참고: 여기서, 단백질 샘플은 세포질 단백질을 포함하는 수성(A) 분획, 외막 단백질을 포함하는 세제(D) 분획 및 내막 단백질을 포함하는 펠릿(P) 분획을 나타냅니다.
  4. A, D 및 P를 포함하는 샘플을 사전 염색된 단백질 마커(M) 및 총 단백질(T)과 함께 10% SDS-PAGE 겔의 각 웰에 로드합니다.
    참고: 총 단백질은 20μL의 샘플 완충액을 사용하여 세 가지 분획을 모두 단일 바이알로 함께 당겨 준비할 수 있습니다.
  5. 전기영동 장치에 1x 전극 버퍼를 사용합니다(표 1). 겔 실행 매개변수를 스태킹 겔의 경우 6mA, 분해 겔의 경우 12mA로 설정합니다. RT에서 전기영동을 실행합니다.
  6. Coomassie Brilliant Blue G 또는 실험실에서 구할 수 있는 다른 단백질 염색제로 젤을 염색합니다.

6. 면역블로팅

  1. 겔 분리 후, 염색되지 않은 겔을 전사 완충액(25mM Tris 염기, 190mM 글리신, 20% 메탄올)에서 5분 동안 배양합니다.
  2. 적절한 크기의 블로팅 페이퍼를 면역블롯 전사 완충액에서 5분 동안 배양한 다음 샌드위치의 바닥층으로 조립합니다.
  3. 폴리불화비닐리덴(PVDF) 멤브레인 또는 니트로셀룰로오스 멤브레인을 활용하여 염색되지 않은 겔에서 단백질을 전달합니다. PVDF 멤브레인을 무수 메탄올에 30초 동안 담근 다음 면역블롯 전사 완충액에 5분 동안 담그는 것으로 시작합니다. 그런 다음 블로팅 샌드위치에 통합합니다.
  4. 이제 전사 완충액에서 제거된 염색되지 않은 젤을 넣고 전사 블로팅 샌드위치에 사용합니다.
  5. 마지막으로 샌드위치를 다른 압지 위에 올려 덮고 블로지 롤러로 갇힌 기포를 제거한 다음 반건식 전사 방법을 사용하여 전사를 실행합니다.
    참고: 건식 및 습식 이송을 포함한 다른 접근 방식은 실험실 시설에 따라 사용할 수 있습니다.
  6. 멤브레인을 차단 완충액(TBS-0.1% Tween 20[TBS-T]의 8% 탈지 우유)에 2시간 동안 담근 다음 렙토스피라 지단백질 LipL41(1:5000)을 표적으로 하는 단일특이적 항혈청* 또는 편모 필라멘트 35kDa 코어 단백질(FlaB)(1:4000)(*맞춤형 항체)과 함께 4°C에서 하룻밤 배양합니다. TBS-T로 멤브레인을 세 번 헹구고 각 헹굼을 5분 동안 진행합니다.
    참고: 관심 있는 항체를 사용하십시오. 항체의 희석 인자는 다를 수 있습니다.
  7. 양 고추냉이 과산화효소 (HRP) IgG (1:20000 희석)와 접합된 마우스 항토끼 2차 항체와 함께 멤브레인을 RT에서 2시간 동안 배양합니다.
  8. 멤브레인을 전기화학발광(ECL) 시약에 노출시켜 단백질 밴드를 시각화합니다.
  9. 어두운 방 내에서 청색 민감성 X선 필름 아래에 멤브레인을 놓습니다.
    참고: 다른 현상 방법도 활용할 수 있습니다.

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결과

이 실험에서 우리는 세포 내 구획을 추출하기 위해 스피로헤타 렙토스피라를 모델 유기체로 사용했습니다. 우리는 비이온성 세제인 Triton X-114의 효과를 활용하여 운점 및 임계 균사체 농도(CMC)에 고정된 전략적 방법론을 사용했습니다(그림 1). 더 진행하기 전에 단일 생물학적 복제에 대한 각 분획의 농도를 평가하기 위해 단백질 추정을 수행했습니다. 우리는 수성(A): 세제(D): 펠릿(P) 분획에서 3:1:1.3의 농도 비율을 관찰했으며, 이는 생물학적 복제의 각 배치에서 일관되게 관찰되었습니다. 각 Triton X-114 분획에서 추출한 단백질 샘플을 SDS-PAGE 분석에 적용한 후 면역블로팅을 수행하여 품질을 평가했습니다(그림 2). 우리는 면역블롯 분석에서 렙토스피라 의 LipL41 및 FlaB 단백질을 사용하여 다양한 세포 내 구획에 걸친 발현을 조사했습니다

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토론

세포 내 분획 기술은 후속 분석을 위해 개별 세포 성분을 분리하는 데 중추적인 역할을 합니다. 비이온성 세제인 Triton X-114는 샘플을 별개의 상으로 분할하여 다양한 세포 성분을 분리할 수 있는 능력 때문에 이러한 기술에 일반적으로 사용됩니다32. Triton X-114는 소변 세포외 소포, 골지막, 박테리아막, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 및 렙토스피라(Leptospira interrogans)와 같은 병원체의 외막 단백질을 포함한 다양한 출처에서 막단백질(천연 형태)을 추출하는 데 특히 유용했습니다 25,32,33,34,35,36,37

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공개 사항

저자들은 상충되는 재정적 이해관계가 없다고 선언했습니다.

감사의 글

저자는 인도 뉴델리에 있는 인도 의학 연구 위원회(Indian Council of Medical Research)에 Grant No. Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 및 인도 뉴델리에 있는 과학기술부, 과학공학연구위원회, 보조금 번호를 통한 자금 지원에 감사드립니다. SR/SO/HS/0108/2012에서 MGM에 게재 또한 저자는 인도 뉴델리에 있는 인도 의학 연구 위원회에 보조금 번호를 통해 선임 연구 펠로우십을 수여한 것에 감사를 표합니다. ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS- BMS, Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 각각 HP 및 AS 및 인도 뉴델리의 과학 및 공학 연구 위원회 과학 기술부, 보조금 번호. PDF/2017/000343 - S.A.D.C.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세트산  시그마  695092
아세톤    시그마  32201
아크릴아미드    시그마  A-3553
과황산암모늄    시그마  A-3678
저울  시마두즈  Z741079
비스 아크릴아미드    시그마  M7279
소 혈청 알부민 분획 V(BSA)  시그마  A-8022
브로모페놀 블루    시그마  B-8026
원심분리기 튜브(50mL)타슨스500020
캡이 있는 원뿔형 플라스크(150mL)타슨스431030
냉각 원심분리기  에펜도르프  5355316200
쿠마시 브릴리언트 블루    시그마1.12553
암시야 현미경  자이스  GmbH37081
섬세한 작업 와이프김텍사이언스34155
건식 목욕  에펜도르프  535531620
엘링하우젠– 맥컬로– 존슨– 해리스(EMJH) 미디엄, 디프코  디프코  279410
젤 트레이: 젤 트레이는 치수가 최소 2cm 더 넓어야 하며 뚜껑이 있는 표면이 매끄럽고 평평해야 합니다.   호퍼  해당 없음
유리 비크 (150mL)타슨스421030
글리신 G8790    시그마  지-8898
Immobilon 블로팅 여과지밀리포어IBFP0813C
면역블롯 세미 드라이 셋업  아타  AE-6675
인큐베이터 - 젤 트레이를 37°C에서 18시간 동안 배양합니다.  아일라  SLI-700 시리즈
층류 공기 흐름  해당 없음  해당 없음
루미놀  시그마  09253
염화마그네슘 M8266  시그마  M8266
마그네틱 교반기  타슨스  6040
메탄올    시그마  17995-7
마이크로피펫 팁(10 & micro; L– 10 mL)액시젠T-10, T-200-C, T-1000-C, T-10ML-C
마이크로피펫  에펜도르프  EP2231300010
마이크로튜브(1.5mL Safe-Lock)에펜도르프EP022363212
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인산염 완충 식염수    시그마P4417 
냉장고  Lg 전자  GC-B217BLJ2
로커 - 젤을 염색하기 위한 저속의 로킹 또는 로터리 셰이커.  타슨스  4080
SDS-PAGE SETUP- 전기영동 장치  호퍼, Inc.  SE300-10A-1.0  Hoefer 모델 ' 미니VE' 두께 1mm의 10cm x 8cm 크기의 젤을 주조할 수 있습니다. 
소금      시그마  5886
도데실 황산나트륨(SDS)    시그마  L-4396
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트리즈마 베이스(TRIS) T6066    시그마  티6066
소용돌이  타슨스  3020

참고문헌

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