이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

줄기 구내염 병원체에 의해 유도된 포플러 외래 뿌리: 뿌리 생물학 및 광 반응 관련 과정을 연구하기 위한 실험 시스템

755 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67304

⸱

2024년 10월 11일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Beijing Haidian Kaiwen Academy High School, 4State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 포플러의 뿌리생물학 및 광 반응 관련 생리학적 과정 연구에 적합한 체관부 또는 표피 거들 진균 병원체 접종 경로를 통해 외래뿌리(AR)의 생산을 유도하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

Valsa sordida 와 Botryosphaeria dothidea 는 많은 식물 숙주, 특히 Populus 속의 종에 피해를 주는 두 가지 중요한 괴사 영양 곰팡이 병원체입니다. 이 두 가지 곰팡이 병원체는 주로 포플러 가지, 줄기 및 나뭇가지에서 발생하며 구내염 병변, 캐노피 다이백 및 시들음과 같은 전형적인 증상을 유발합니다. 병원체 접종은 식물 질병의 메커니즘을 연구하는 가장 효율적인 경로입니다. 줄기의 접종 부위 주변의 구내염 병변 외에도, 줄기 구내염 병원체 접종 후 포플러 종에서 밝은 붉은색을 띤 풍부한 외래뿌리(AR)라는 새로운 발달 현상이 관찰되었습니다. 이 연구에서는 포플러 나무에서 곰팡이 병원체를 사용하여 AR을 유도하는 방법을 설명했습니다. 이 방법의 중요한 단계는 (체관부 또는 표피) 거들 조작 후 병원체 접종입니다. 두 번째 중요한 단계는 보습 소재를 바르는 것입니다. 파라필름을 사용한 보습 조작과 비교했을 때, 접종된 부위를 가정용 폴리에틸렌(PE) 플라스틱 랩으로 감싸면 거들링 접종 후 20일 이내에 다채롭고 다양하며 견고한 AR을 생성할 수 있습니다. 마지막으로, 포플러 줄기의 접종된 고리에서 흰색 AR이 차양 처리(줄기를 알루미늄 호일로 감싸기) 후 싹이 텄습니다. 이 방법은 뿌리 발달 및 형태 형성을 연구하기 위한 새로운 실험 시스템을 도입하며, 이는 질병 스트레스 하에서 뿌리 발달, 형태 형성 및 반응의 생물학을 이해하는 데 중요합니다. 또한, 본 연구는 음영 처리와 결합하면 광 반응 관련 과정, 예를 들어 플라보노이드, 안토시아닌 또는 기타 관련 대사 산물의 생합성, 이러한 과정에 관여하는 유전자 또는 전사 인자를 조사하기 위한 편리한 실험 시스템을 제공할 수 있습니다.

서론

괴사영양성 진균 병원균인 Valsa sordida 와 Botryosphaeria dothidea에 의해 유발되는 포플러 줄기 구내염병은 중국 북부의 두 가지 중요한 수목 질병으로, 포플러 종의 생태학적, 경제적 플랜테이션 개발에 심각한 피해를 입혔습니다. 포플러 구내염병은 항상 줄기와 가지의 껍질에서 발생하며, 구내염 병변이 전형적인 증상입니다. 질병이 발병한 후, 팽창하는 구내염 병변은 숙주의 체관부, 형성층 및 물관부를 점진적으로 손상시켰습니다. 또한, 그들은 혈관 시스템을 통한 동화 된 산물과 물의 수송에 영향을 미쳤습니다. 그러나 구내염 병원체가 체관부와 물관부 수송을 어떻게 방해하는지는 불분명합니다.

구내암 병원체에 감염된 포플러에서 탄수화물과 수분의 수송 메커니즘을 밝히기 위해 고전적인 정원 거들 조작과 병원체 접종 방법(균사체 차단 상처 접종)을 결합한 체관부 또는 표피 거들 접종 방법 1,2를 제안했습니다. 이러한 방법은 감염 과정과 구내염 병원체에 의해 유발된 물과 탄수화물의 막힘을 시뮬레이션할 수 있습니다.

우리의 연구는 곰팡이 병원체가 초기에 수압 고장이 아니라 탄소 결핍을 유발함으로써 포플러 캐노피 다이백을 유발한다는 것을 보여주었습니다 1,3,4,5. 놀랍게도, 우리는 줄기 구내염 병원균의 접종과 관련된 포플러 줄기에서 특별한 뿌리 형성을 관찰했습니다: 풍부한 붉은 외래뿌리(AR)는 위쪽 줄기의 아래쪽 끝(체관부 또는 표피 띠 고리의 위쪽 가장자리 반대편)에서 자랍니다. 또한, 우리의 실험은 AR의 생산이 포플러-구내염 병원체 상호 작용에서 보편적임을 보여주었습니다. 그들은 다른 연령 (1 세, 2 세 또는 6 세)의 포플러 종 또는 클론의 종류에서 생성 될 수 있으며 다른 구내염 병원체 (V. sordida 및 B. dothidea) 또는 그들의 분리체에 의해 유도 될 수 있습니다. 또한, 우리는 포플러 AR의 색 메커니즘을 연구했으며, 그 결과 포플러 AR이 플라보노이드와 안토시아닌의 생합성뿐만 아니라 조명 조건에서 빛 관련 유전자(또는 유전자 모듈)의 유전자 발현 조절과 관련이 있음을 보여주었습니다6. 따라서 병원체에 의해 유도된 이러한 포플러 AR은 식물-병원체 상호 작용, 뿌리 생물학, 광 관련 유전자의 기능 및 발현 연구를 위한 안정적이고 이상적인 실험 시스템으로 사용될 수 있습니다.

본 연구에서는 거들링 접종 경로를 통해 포플러 AR 실험 시스템을 구축하기 위한 프로토콜을 소개하고 제공할 것입니다. 또한, AR의 형성에 영향을 미치는 중요한 요인을 지적하고 포플러 뿌리 생물학 및 기타 광 반응 관련 생리학적 과정 연구에서 거들링 접종의 잠재적 적용에 대해 설명합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 거들링 접종을 통한 포플러 AR 유도

  1. 진균성 구내암 병원체의 배양
    1. 감자 추출물 6g, 포도당 20g, 한천 20g을 물 1000mL에 용해시켜 감자 포도당 한천(PDA) 배지를 준비합니다. 배지를 121.1°C에서 30분 동안 살균하고 배지를 약 20mL의 PDA 배지를 포함하는 각 접시에 페트리 접시(직경 9cm)에 붓습니다.
    2. PDA 페트리 접시 중앙에 있는 활성화된 곰팡이 균사체 큐브(~0.5cm)를 접종합니다.
    3. 접종된 PDA 플레이트를 28°C의 어두운 곳에서 7-10일 동안 배양합니다.
    4. 곰팡이 균사체가 있는 배양된 PDA 배지를 스트랩(너비 1.2cm, 길이 약 3-6cm)으로 자릅니다.
  2. 포플러 재료의 준비
    1. 1-2 년 된 활발하게 자라는 포플러 묘목을 선택하십시오.
    2. 포플러 묘목(직경 1-2cm, 질병 및 해충 침입이 없음)에서 성숙한 줄기/가지를 선택합니다.
    3. 포플러 줄기 / 가지의 접종 영역 (땅 또는 가지 바닥에서 약 30cm 높이)을 씻으십시오. 줄기/가지를 75% 알코올 용액으로 살균합니다.
  3. 체관부 거들링 접종을 통한 AR 유도
    1. 살균된 포플러 줄기/가지의 표피와 체관부를 조심스럽게 띠고, 거들된 체관부 고리(부분 형성층 포함 너비 1cm)를 제거하고, 흰색 내부 형성층/물관부 조직을 노출시킵니다.
      참고: 1.3.2-1.3.4단계에서는 대체 접종 방법을 자세히 설명합니다.
    2. 체관부 거들링 접종 치료(GP)로서 체관부 스트랩(폭 1.2cm)으로 거들 부위를 완전히 커버합니다. 곰팡이 균사는 노출된 물관부를 향합니다.
    3. 멸균된 칼로 노출된 내부 형성층 조직을 긁어내고 손상시킨 후 거들 부위의 PDA 스트랩(폭 1.2cm)을 거들링 형성층 제거 치료(GR)로 접종합니다.
    4. 거들 대조군(GC)으로 배양되지 않은 PDA 미디엄 스트랩(너비 1.2cm)으로 거들 부위를 직접 접종합니다.
    5. 접종된 줄기/가지를 신축성 있고 무색이며 투명한 접목 테이프(또는 PE 플라스틱 필름)로 감쌉니다. 수분을 유지하기 위해 4겹으로 감쌉니다.
    6. 접종된 줄기/가지를 (금속, 플라스틱 또는 나무) 막대기(50cm 이상)로 묶어 방풍을 방지합니다.
    7. 실험하는 동안 정기적인 관개로 띠를 띠는 포플러 재료를 재배하십시오.
    8. 외부에서 관찰하고 접종 후 14-30일 후에 포플러 AR의 형성을 기록합니다.
  4. 표피 거들링-접종을 통한 AR 유도
    1. 1.2단계에 설명된 대로 접종된 재료를 선택하고 준비합니다.
    2. 포플러 줄기/가지의 표피를 조심스럽게 띠십시오.
    3. 표피 고리(폭 1.0cm)를 제거하고 녹색 체관부 조직을 노출시킵니다.
    4. 체관부 조직을 약간 수직으로 4번 긁어내고 체관부의 내부 구조를 노출시킵니다.
    5. 거들로 된 표피 부위에 진균 균사체(eGP)와 PDA 스트랩(eGC)을 접종합니다. 1.3.2-1.3.4 단계와 유사한 접종 조작을 수행합니다.
    6. 접종된 줄기를 1.3.5단계에서 설명한 대로 접목 테이프(또는 PE 플라스틱 필름)로 감쌉니다.
    7. 포플러를 관리하고 1.3.6-1.3.8 단계에 설명된 대로 AR을 관찰합니다.

2. 거들링 접종법을 통한 광 관련 유전자 연구를 위한 실험적 체계 구축

  1. 체관부 거들링 접종 방법을 사용하여 포플러 AR을 유도합니다(단계 1.3.2-1.3.4).
  2. 또는 1.4.5단계에서 설명한 대로 표피 거들링 접종 방법을 사용하여 포플러 AR을 유도합니다.
  3. 포플러 줄기/가지(높이 15cm)의 병원균 접종 부위를 알루미늄 호일(차광 처리, S) 또는 알루미늄 호일 랩(조명 처리, L)으로 감쌉니다.
  4. 줄기/가지를 >50cm 길이의 막대기로 묶어 방풍을 막습니다. 포플러를 정기적으로 재배하고 관리하며 1.3.6-1.3.7 단계에 설명된 대로 실험 중에 잘 관개하십시오.
  5. 접종 후 ~20일에 줄기에서 알루미늄 호일을 제거합니다.
  6. 알루미늄 호일 음영 처리(S)와 음영 처리되지 않은 포플러 AR(L)을 즉시 관찰하고 사진을 촬영하십시오.
  7. 그늘진 포플러 AR을 햇빛 또는 기타 인공 광원/조건에서 배양하십시오.
  8. 접목 테이프 (또는 PE 플라스틱 필름)를 제거하고 빛에 노출 된 후 1-5 일에 포플러 AR을 수확합니다.
  9. 모든 AR 샘플을 알루미늄 호일로 감쌉니다. 음영 처리를 거친 포플러 AR의 경우 어두운 곳에서 샘플을 수확합니다.
  10. AR 샘플을 액체 질소에 담그고 추가 조사를 위해 -80°C에 보관하십시오.
  11. 빛에 노출되거나 노출되지 않은 포플러 AR(어두운 곳에서 수행됨)을 알루미늄 호일로 감싼 후 수확하고 형태학적 및 기타 현장 분석을 위해 4°C에서 보관합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

거들링 접종을 통해 외래 뿌리를 유도하는 줄기 구내염 병원체의 작업 흐름은 그림 1에 나와 있습니다. 여기에서 수행된 실험은 줄기 구내염 병원균인 V. sordida, B. dothidea 및 이들의 분리물(다른 숙주, 지역 또는 병원성)이 포플러 종에서 AR의 형성을 유도할 수 있음을 보여주었습니다. 이 프로토콜에서는 V. sordida를 사용하여 CZC, CFCC86775를 분리하고 B. dothidea를 사용하여 SD50 및 SD81을 분리하여 P. alba var. pyramidalis에서 AR을 생성했습니다. V 소디다 CZC는 사용되는 전형적인 병원체이며 중국 일반 미생물 배양 수집 센터 (CGMCC 40575)에 기탁되었습니다. V. sordida 분리 CFCC86775은 중국 임업 문화 수집 센터에서 구입했으며, 두 개의 SD 분리물은 산둥성의 구내염...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

포플러 종은 줄기 절단에서 AR 또는 측면 뿌리(LR)를 생산하는 경향이 있으며, 이는 번식에 기여하고나무 식물에서 뿌리 생물학을 연구하는 뿌리 생물학 모델로 7,8. 더욱이, 연구에 따르면 유익한 박테리아(Agrobacterium rhizogenes 9,10; 식물 성장 촉진 뿌리 박테리아 [PGPR] 11), 내생식물 박테리아12 , 13 , 수목 균근 균 (AMF) 14 , 15 또는 외부 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중앙 공익 과학 기관, 국가 핵심 수목 유전학 및 육종 연구소의 기초 연구 기금(보조금 번호 CAFYBB2020ZY001-2)과 중국 국립 자연 과학 재단(보조금 번호 32171776)이 Jiaping Zhao에게 공동으로 자금을 지원했습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
한천솔라바이오A8190   곰팡이 성장을 위한 영양 공급
알루미늄 호일바이오샤프BS-QT-027B감염된 지역에 음영을 제공하기 위해
거들링 나이프MoGong 하드웨어 공구 회사포플러 줄기/가지의 표피를 감습니다.
접목 테이프CAPI5 cm식물에 곰팡이를 고정하려면
PD(감자 추출, 포도당) 솔라바이오P7360곰팡이 성장을 위한 영양 공급
PE 플라스틱 필름먀오지에(MiaoJie)413703식물에 곰팡이를 고정하려면
페트리 접시Bkman 생물학적 Co., Ltd 90mmPDA 배지 준비
온도 조절 인큐베이터상하이 Kuntian 실험실 기기 Co., LtdKTD-6000 시리즈곰팡이 성장을 위한 환경 제공

참고문헌

  1. Xing, J., et al. Fungal pathogens of canker disease trigger canopy dieback in poplar saplings by inducing functional failure of the phloem and cambium and carbon starvation in the xylem. Physiol Mol Plant Pathol. 101523, 112(2020).
  2. Xing, J., et al. Stem canker pathogen Botryosphaeria dothidea inhibits poplar leaf photosynthesis in the early stage of inoculation. Front Plant Sci. 13, 1008834(2022).
  3. Li, P., et al. Fungal canker pathogens trigger carbon starvation by inhibiting carbon metabolism in poplar stems. Sci Rep. 9, 10111(2019).
  4. Li, J., et al. Effects of Valsa sordida infection on photosynthetic characteristics and carbon-water metabolism in Populus alba var. Pyramidalis. For Res. 34 (05), 58-68 (2021).
  5. Xing, J., et al. Comparisons of photosythetic response and characteristics in leaves of Populus alba var. pyramidalis infected by the stem canker pathogen Valsa sordida and Botryosphaeria dothidea at Early Stage. Scientia Silvae Sinicae. 57 (09), 121-129 (2021).
  6. Li, M. Physiological and molecular mechanisms of adventitious root formation in poplar induced by stem canker pathogens [Master's Thesis]. , Chinese Academy of Forestry. (2023).
  7. Ahkami, A. H. Systems biology of root development in Populus: Review and perspectives. Plant Sci. 335, 111818(2023).
  8. Dickmann, D. I. Silviculture and biology of short-rotation woody crops in temperate regions: then and now. Biomass Bioenergy. 30, 696-705 (2006).
  9. De Almeida, M. R., et al. Environmental control of adventitious rooting in Eucalyptus and Populus cuttings. Trees. 31, 1377-1390 (2017).
  10. Zavattieri, M. A., Ragonezi, C., Klimaszewska, K. Adventitious rooting of conifers: influence of biological factors. Trees. 30, 1021-1032 (2016).
  11. Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World J Microbiol Biotechnol. 28, 1327-1350 (2012).
  12. Khan, Z., et al. Growth enhancement and drought tolerance of hybrid poplar upon inoculation with endophyte consortia. Curr Plant Biol. 6, 38-47 (2016).
  13. Paz, I. C., et al. Eucalyptus growth promotion by endophytic Bacillus spp. Genet Mol Res. 11, 3711-3720 (2012).
  14. Olah, B., Briere, C., Becard, G., Denarie, J., Gough, C. Nod factors and a diffusible factor from arbuscular mycorrhizal fungi stimulate lateral root formation in Medicago truncatula via the DMI1/DMI2 signalling pathway. Plant J. 44, 195-207 (2005).
  15. Maillet, F., et al. Fungal lipochitooligosaccharide symbiotic signals in arbuscular mycorrhiza. Nature. 469, 58-63 (2011).
  16. Felten, J., et al. The ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor stimulates lateral root formation in poplar and Arabidopsis through auxin transport and signaling. Plant Physiol. 151, 1991-2005 (1991).
  17. Splivallo, R., Fischer, U., Gobel, C., Feussner, I., Karlovsky, P. Truffles regulate plant root morphogenesis via the production of auxin and ethylene. Plant Physiol. 150, 2018-2029 (2009).
  18. Druege, U., et al. Molecular and physiological control of adventitious rooting in cuttings: phytohormone action meets resource allocation. Ann Bot. 123, 929-949 (2019).
  19. Steffens, B., Rasmussen, A. The physiology of adventitious roots. Plant Physiol. 170, 603-617 (2016).
  20. Bannoud, F., Bellini, C. Adventitious rooting in Populus species: update and perspectives. Front Plant Sci. 12, 668837(2021).
  21. Li, Y., et al. Signal communication during microbial modulation of root system architecture. J Exp Bot. 75 (2), 526-537 (2024).
  22. Pascale, A., Proietti, S., Pantelides, I. S., Stringlis, I. A. Modulation of the root microbiome by plant molecules: the basis for targeted disease suppression and plant growth promotion. Front Plant Sci. 10, 1741(2020).
  23. Zoratti, L., Karppinen, K., Luengo Escobar, A., Häggman, H., Jaakola, L. Light-controlled flavonoid biosynthesis in fruits. Front Plant Sci. 5, 534(2014).
  24. Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences. Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).
  25. Sorin, C., et al. Auxin and light control of adventitious rooting in Arabidopsis require ARGONAUTE1. Plant Cell. 17 (5), 1343-1359 (2005).
  26. Jung, J. K., McCouch, S. Getting to the roots of it: Genetic and hormonal control of root architecture. Front Plant Sci. 4, 186(2013).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

포플러 줄기 궤양병병원균 접종뿌리 발달진균 병원균뿌리 형태 형성차광 처리플라보노이드 생합성안토시아닌 생합성
줄기 구내염 병원체에 의해 유도된 포플러 외래 뿌리: 뿌리 생물학 및 광 반응 관련 과정을 연구하기 위한 실험 시스템
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.