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방법 논문

각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 기반으로 한 쥐에서 중증 각막 염증 모델 확립

1.4K 조회수

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DOI:

10.3791/67305

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2024년 11월 22일

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1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 각막 봉합사와 결합된 각막 상피 소파술을 통해 심각한 각막 염증을 일으키는 쥐 모델을 개발했습니다. 이 연구는 염증 상태에서 각막 염증 패턴, 상피 증식 및 윤부 줄기 세포의 변화를 평가했습니다.

초록

각막 염증, 특히 심한 각막 염증은 각막 윤부 줄기 세포 기능 장애의 발달에 중요한 역할을 합니다. 적절한 동물 모델을 구성하면 심각한 염증이 각막 윤부 줄기 세포에 미치는 영향에 초점을 맞추는 데 도움이 될 수 있습니다. 2mm 녹 제거제를 사용하여 Sprague Dawley(SD) 쥐의 중앙 각막 상피를 제거하여 부상을 입혔습니다. 그런 다음 각막의 중앙 기질에 나일론 봉합사를 봉합하여 지속적인 염증을 유도했습니다. 이와 같이 중앙 각막 상피 찰과상과 중앙 기질 봉합을 이용한 각막 염증 모델을 구축하여 심각한 각막 염증을 유발했습니다. 모델링 후 1일, 3일, 7일째에 각막 염증과 윤부 줄기세포의 상태가 관찰되었습니다. 모델링 후 3일 째 되는 날, 쥐의 각막 변부는 심한 부종을 보였으며, 이는 변연계 줄기세포 결핍의 전형적인 징후인 명백한 신생혈관화와 국소 증식증을 동반했습니다. 7일 째가 되자 각막 부종은 점차 악화되었고 신생혈관형성은 계속 증가했습니다. 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(RT-qPCR)과 면역형광 염색을 통해 각막 상피 염증 인자의 현저한 상향 조절, 각막 상피 분화가 비정상적, 각막 상피 줄기세포의 현저한 감소, 세포 증식 및 줄기성도 감소한 것을 확인할 수 있었습니다. 따라서 이 모델은 심한 염증이 윤부 줄기세포를 직접 손상시키지 않고 윤부 줄기세포 손상을 유발할 수 있음을 보여줍니다. 이 모델은 줄기세포의 생물학적 메커니즘에 대한 심각한 염증의 영향을 관찰하는 데 유익하며 염증에 의해 유발된 각막 상피 줄기세포 기능 장애의 메커니즘을 연구하기 위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다.

서론

변연계 줄기세포 기능 장애(LSCD)는 지속적인 상피 결손, 각막 혈관화, 만성 염증, 흉터 및 각막의 결막화를 특징으로 합니다 1,2. 화학적 화상, 열 화상, 스티븐스-존슨 증후군, 안구 수술로 인한 의인성 손상과 같은 심각한 안구 표면 질환 후 윤부 줄기세포의 고갈 또는 기능 장애로 인해 발생할 수 있습니다 2,3,4. LSCD의 병원성 기전은 주로 줄기세포의 변화와 줄기세포 미세환경 5,6의 교란을 수반하며, 이는 각막 상피의 항상성에 영향을 미칩니다 2,7. LSCD에서 윤부 줄기세포의 운명 변화에는 두 가지 주요 유형이 있습니다: 1) 각막 상피 줄기 세포의 방향성 분화 가능성이 비정상적이 되어 피부 상피 세포로 분화됩니다. 이는 각막 상피 세포 특이적 전사 인자 Pax6 및 각막 특이적 케라틴 Krt12 및 Krt3의 발현이 감소하고 피부 관련 편평 상피 화생 마커 Krt10, Krt1 및 Sprr1b8의 발현이 크게 증가한 것으로 입증됩니다. 2) 안구 표면 손상은 각막 윤부 줄기 세포를 직접 파괴하여 괴사 또는 세포사멸을 일으키고, 이어서 각막을 덮고 있는 결막 조직 증식을 일으킨다9. LSCD가 발달하는 동안 각막 상피 줄기세포 미세환경에서 대식세포, 호중구, 수지상 세포와 같은 염증 세포가 크게 증가하는 것으로 보고되었습니다. 이에 따라 인터페론감마(IFN)-γ, 종양괴사인자(TNF)-α, 인터루킨(IL)-1β, 대식세포 염증단백질(MIP)-1α/β과 같은 사이토카인도 유의한 상승을 보였다10.

봉합사, 화학적 손상 및 염화벤잘코늄 스포팅11에 의해 유도된 모델을 포함하여 다양한 LSCD 모델이 확립되었습니다. 이러한 각 모델에는 장점과 단점이 있습니다. 화학적 손상은 전체 안구 표면을 손상시키고 윤부 줄기 세포를 직접 파괴할 수 있습니다12. 염화벤잘코늄(Benzalkonium chloride)은 화학적 손상과 유사하게 작용하지만 상대적으로 느린 효과를 보인다13. 각막 봉합사 모델은 안정적이고 장기적인 염증 반응을 유도할 수 있지만 염증 반응은 상대적으로 경미하여 LSCD를 유발할 수 없습니다.

각막 LSCD의 발달에서 염증의 역할과 메커니즘을 조사하기 위해 중앙 각막 상피의 소파술과 각막 봉합사를 결합한 동물 모델을 확립했습니다. 이 모델은 윤부 줄기세포를 직접 손상시키지 않고 각막 상피의 지속적인 염증을 유도합니다.

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프로토콜

모든 절차는 안과 및 시력 연구에 동물을 사용하기 위한 ARVO 지침을 준수했으며 구이저우 의과대학 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 2305192). 쥐들은 구이저우 의과대학 동물센터에 수용되었으며, 관련 동물 관리 규정을 준수했다.

1. 동물 선택

  1. 7-8주 된 암컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐를 사용하십시오. 슬릿 램프 검사 하에 안구 표면 병변이 없는지 확인하십시오.
  2. 급속 살균기를 사용하여 기구를 살균하십시오. 필요한 기구로는 각막 녹 고리 제거제, 2mm 크기의 피부 샘플링 마커, 바늘 홀더, 판층 칼, 안과 수술용 가위 및 집게가 있습니다.
  3. 체중 100g당 0.3mL의 복강내 주사를 통해 1.25% 트리브로모에탄올로 쥐를 마취합니다. 발가락 꼬집기로 마취 깊이를 평가합니다. 동공 확장을 위해 트로피카마이드 점안액 한 방울을 주입합니다. 부피바카인 염산염 점안액을 눈에 바릅니다. 수분을 유지하기 위해 반대쪽 눈에 안구 윤활제 연고를 사용하십시오.
  4. 눈 주위의 피부와 모발을 요오드로 소독한다.
  5. 염증 모델을 확립합니다.
    1. 쥐를 측면 욕창 위치에 놓습니다. 작동 중인 현미경으로 안구를 노출시킵니다.
    2. 중앙 각막은 2mm 크기의 피부 샘플링 마커를 사용하여 라벨링하고, 라벨이 부착된 중앙 각막 상피는 각막 녹 고리 제거제를 사용하여 긁어냈습니다.
    3. 10-0 나일론 와이어, 바늘 홀더, 안과 수술용 가위와 집게를 사용하여 3개의 120° 각막 봉합사를 림버스에서 약 3mm 떨어진 곳에 놓고 각막을 관통하지 않도록 합니다14,15.
  6. 감염을 예방하기 위해 절차가 끝날 때 Ofloxacin 눈 연고를 바르십시오.
  7. 수술 후 1일째, 3일째, 7일 째에는 슬릿 램프 확대 10배 렌즈를 사용하여 각막을 관찰하고 촬영합니다. 각막 상피 치유, 결막 충혈, 각막 부종, 윤부 충혈, 각막 혈관 신생술과 같은 증상을 기록합니다.

2. 염증 지수 계산

  1. 동물 모델을 수립한 후 안구 표면의 염증 지수를 계산합니다.
    1. 섬모체 울혈을 다음과 같이 점수 매기십시오 : 울혈 없음 (0 점); 1mm (1 점) 미만의 혼잡의 존재; 1mm에서 2mm 사이의 충혈 (2 점); 1mm에서 2mm 사이의 충혈(3점).
    2. 다음과 같이 중앙 각막 부종을 점수 매기십시오 : 부종 없음 (0 점); 홍채가 뚜렷하게 보이는 부종(1점); 홍채 가시성이 불분명한 부종(2점); 홍채가 보이지 않는 부종(3점).
    3. 다음과 같이 paracentral corneal edema 점수를 매기십시오 : 부종 없음 (0 점); 홍채가 뚜렷하게 보이는 부종(1점); 홍채 가시성이 불분명한 부종(2점); 홍채가 보이지 않는 부종(3점).
    4. 염증 지수는 모든 점수를 더하고 9로 나누어 계산합니다.

3. 각막 신생혈관형성 평가

  1. 슬릿 램프로 각막 신생혈관 형성을 관찰합니다.
    1. 슬릿 램프 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석하고 처리합니다16.
    2. 각 관찰 시점에서 각막 신생혈관의 성장을 기록하고, 최소 곡률로 중앙 각막을 향한 가장 긴 각막 신생혈관을 측정합니다.
    3. 다음과 같이 등급을 매기십시오 : 등급 0 : Avascular; 1 등급 : 마이크로 (<1 mm); 2등급: 경증(1mm에서 1.5mm); 3 등급 : 보통 (>1.5mm에서 2mm); 4등급: 심각(>2mm).

4. 모델의 생물학 분석

  1. 얼어붙은 눈 표본을 준비합니다.
    1. 쥐를 4-5% 이소플루란으로 마취하고 경추 탈구로 안락사시킨다.
    2. 측면 욕창 자세에서 마이크로 핀셋으로 쥐의 안구를 바깥쪽으로 들어 올리고 안구 가위로 위쪽과 아래쪽 눈 돔을 따라 결막을 잘라냅니다.
    3. 시신경을 절단하고 각막 상피의 무결성을 유지하는 데 주의를 기울입니다.
    4. 안구 표면의 핏자국과 수분을 여과지로 건조시키고 최적 절단 온도(OCT) 매립 매체로 매립 상자에 넣습니다.
    5. 200μL 피펫으로 포딩 박스의 기포를 제거하고 액체 질소를 사용하여 동결한 다음 포매된 검체를 초저온 냉장고에 보관합니다.
  2. 안구의 얼어붙은 부분을 준비합니다.
    1. 동결 섹션을 준비하기 전에 저온 유지 장치를 약 -28°C로 예냉각하고 표본 홀더를 -26°C로 예냉각합니다.
    2. 냉동고에서 냉동 표본을 꺼내 약 1시간 동안 냉동 저장체에 넣습니다.
    3. 냉동 표본을 냉동 온도계에서 10분 동안 예냉각합니다. 연필로 표본을 표시하고 OCT로 표본 패드에 고정하고 냉각 후 구획 랙에 함께 고정합니다.
    4. 동결된 시편의 위치와 방향을 조정하고 고정합니다. 먼저 중앙 각막이 보일 때까지 20μm 절편을 자릅니다. 그런 다음 연속 슬라이싱으로 6μm 단면을 얻고 사전 준비된 접착 슬라이드에서 단면을 수집합니다.
    5. 슬라이드에 있는 조직의 이름, 재료, 섹션 시간, 이름 및 번호를 표시합니다. 실온(RT)에서 약 30분 동안 둡니다.
    6. 단면을 건조시킨 후 상자에 넣고 초저온 냉장고에 보관하여 보관합니다.
  3. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행합니다.
    1. 초저온 냉장고에서 미리 준비된 냉동 부분을 제거하고 RT의 흄 후드에 넣어 건조시킵니다.
    2. RT에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드를 사용하여 단면을 고정합니다. 5분 동안 1x PBS로 표본을 헹굽니다.
    3. 슬라이드가 포함된 표본 섹션을 슬라이드 홀더에 놓고 헤마톡실린 염료 용액을 넣고 5분 동안 상온에서 염료 실린더에 담급니다.
    4. 슬라이드가 들어있는 표본을 수돗물로 천천히 헹구어 떠 다니는 염료를 씻어 내고 0.1 % 염산 알코올로 염료 탱크에 넣고 1-2 초 후에 신속하게 제거합니다.
    5. 15분 동안 수돗물로 표본을 천천히 헹굽니다.
    6. 물에서 표본을 제거하고 슬라이드를 eosin 염료 탱크에 담그십시오. RT에서 3분 동안 출발합니다.
    7. 표본을 수돗물로 천천히 헹구고 여분의 염료를 씻어낸 다음 75% 알코올, 80% 알코올, 95% 알코올, 100% 알코올(1개) 및 100% 알코올(2개)을 사용하여 구배 알코올 탈수를 수행합니다. 각 농도의 섹션을 2분 동안 반복합니다.
    8. 시편을 크실렌(1)과 크실렌(2)에서 각각 2분 동안 투명하게 만듭니다.
    9. 흄 후드에서 시편을 건조시키고 밀봉제를 사용하여 섹션을 밀봉하고 기포가 생성되지 않도록 주의하십시오.
    10. RT의 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓습니다. 현미경을 사용하여 섹션을 이미지화합니다.
  4. 면역형광 염색을 수행합니다.
    1. 얼어붙은 부분을 제거하고 흄 후드의 RT에 있는 상자에 넣어 건조시킵니다.
    2. 냉동된 표본의 유리 슬라이드 블랭크에 염색할 항체의 이름을 표시합니다.
    3. 4% 파라포름알데히드로 시편을 상온에서 15분 동안 고정합니다. 표본이 마르는 것을 방지하기 위해 상자에 소량의 수돗물을 넣었습니다.
    4. 파라포름알데히드 고정제를 제거하고 1x PBS 버퍼로 검체를 세 번 세척합니다. 표본을 씻어내지 않도록 주의하십시오.
    5. 조직 섹션 주위의 액체를 건조시키고 세포막 용액(0.2% TritonX-100)으로 표본을 덮고 RT에서 20분 동안 배양합니다.
    6. 세포막 용액을 제거하고 1x PBS 버퍼로 각각 5분씩 섹션을 세 번 세척합니다.
    7. 조직 절편을 건조시키고 면역형광 차단 용액(2% BSA)으로 검체를 덮고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
    8. 제조업체의 지침에 따라 배양 중에 1차 항체와 희석제(1% BSA)를 준비합니다.
    9. 차단 유체를 제거하고 흡입 펌프로 시편을 건조시킵니다. 준비된 1차 항체를 추가하고 상자를 덮고 빛에서 떨어진 4°C 냉장고에서 하룻밤(약 12-16시간 동안 배양) 배양합니다.
    10. 1차 항체를 버리고 PBS에서 10분씩 검체를 4회 세척합니다.
    11. 세척 단계에서 제조업체의 지침에 따라 2차 항체 희석액을 준비합니다.
    12. PBS를 제거하고 검체를 건조시킨 후 제조된 2차 항체를 검체에 첨가합니다. 표본을 덮고 빛에서 1시간 떨어진 RT에서 배양합니다.
    13. 2차 항체를 제거하고 1x PBS 버퍼로 검체를 각각 10분씩 4회 세척한 후 슬라이드 전체를 1x PBS 버퍼로 덮습니다.
    14. PBS를 제거하고, 시편을 건조시키고, DAPI가 포함된 장착 매체로 절편을 밀봉하여 기포가 없는지 확인합니다. 슬라이드를 은박지로 싸서 빛으로부터 4°C 떨어진 곳에 보관하십시오.
    15. 레이저 컨포칼 현미경 시스템 또는 정립 형광 현미경 카메라 시스템(스캔 속도: 4μs/픽셀, 스캔 해상도: 1024 x 1024)으로 사진을 촬영합니다.
  5. 쥐 각막 상피의 단세포 현탁액 제제
    1. 안락사 후 75% 알코올에 적신 핀셋으로 안구를 제거하고 미리 준비한 10% 소 태아 혈청(FBS)과 10% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 1x 행크스 평형 소금 용액(HBSS)에 넣습니다.
    2. 안구를 세척하고 10% FBS와 10% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 HBBS 1개를 각각 5분씩 2회 사용합니다.
    3. 공막 가장자리를 따라 결막을 제거합니다. 공막 가장자리를 약 1mm로 둡니다. 다시 말하지만, 10% FBS와 10% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 1x HBBS로 각막 조직을 두 번 세척합니다.
    4. 깨끗한 각막 조직을 2U/mL의 Dispase II를 함유한 보충된 호르몬 표피 배지(SHEM)로 옮깁니다. 씰을 닫고 4°C에서 14-16시간 동안 놓습니다.
    5. 핀셋, 이가 없는 핀셋, 홍채 회수 장치 및 수술용 살균기를 준비하십시오.
    6. 외과용 현미경으로 각막 가장자리를 따라 각막 상피를 부드럽게 분리합니다.
    7. 10% 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 1x HBSS로 각막 상피를 5분 동안 세척합니다.
    8. 각막 상피 조직을 트립신 200mL가 함유된 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 5% CO2, 37°C 인큐베이터에서 배양합니다. 5분마다 원심분리기 튜브를 세 번 흔들어 각막 상피 시트를 단일 세포 현탁액으로 소화합니다.
    9. 트립신 분해 용액의 작용을 멈추기 위해 동일한 양의 SHEM 배지를 첨가하고 RT에 놓습니다.
  6. 각막 상피 세포의 클론 배양
    1. 영양막 세포를 준비합니다.
      1. NIH 3T3 마우스 세포의 성장 밀도가 80-90%에 도달하면 세포 배양 배지를 폐기합니다. 사전 준비된 10mg/mL NIH 3T3 미토마이신 배양 배지를 추가하고 37°C에서 2.5시간 동안 배양합니다.
      2. 배지를 제거하고, 1x HBSS로 세포를 헹구고, 새로운 NIH 3T3 세포 배지로 교체하고, CO2 인큐베이터(5% CO2, 37 °C)에서 배양을 계속합니다.
    2. 각막 상피 세포 현탁액을 준비하고 필요한 비율에 따라 세포를 계수합니다.
    3. 각막 상피 세포 현탁액을 준비하는 동안 미토마이신으로 처리된 NIH 3T3 세포를 처리합니다.
      1. 상등액을 버리고 1x HBSS로 세포를 헹구고 1mL의 트립신-EDTA 용액을 첨가한 다음 RT에서 2-3분 동안 배양합니다.
      2. 동일한 양의 보조 호르몬 상피 배지(SHEM 배지: DMEM/F12, 10ng/mL 마우스 표피 성장 인자[EGF], 10μg/mL 인슐린-트랜스페린-셀레늄[ITS], 5% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.5% 디메틸설폭사이드[DMSO], 0.5mg/mL 하이드로코르티손)를 추가하고 부드럽게 피펫을 만들어 세포 현탁액을 만들고 세포를 계수합니다.
    4. 12웰 플레이트를 사용하고 각 웰에 0.5mL의 SHEM 배지를 추가합니다.
    5. 각막 상피 세포를 NIH 3T3 세포와 500 각막 상피 세포/cm2 및 5 x 105 NIH 3T3 세포/cm2의 밀도로 혼합합니다. 각 웰에 SHEM 배지 1mL를 추가합니다.
    6. 세포 혼합물 1mL를 각 웰에 추가하고 세포가 고르게 분포되도록 부드럽게 피펫팅합니다.
    7. 인큐베이터 (5 % CO2, 37 ° C)에서 배양하고 2-3 일마다 배지를 교체하십시오. 12-14일 동안 문화.
  7. 크리스탈 바이올렛 염색
    1. 약 12일 후, 각막 상피 클론이 융합하려고 할 때 배양 배지를 제거하고 각 웰에 4% 파라포름알데히드 용액 1mL를 첨가하여 세포를 완전히 덮습니다. RT에서 15분 동안 셀을 고정합니다.
    2. 4% 파라포름알데히드를 제거하고 각각 5분 동안 1x PBS로 웰을 세 번 세척합니다.
    3. 1x PBS 버퍼를 제거하고 각 웰에 0.4% 결정 바이올렛 염료 용액을 추가합니다. RT에서 30분 동안 염색합니다.
    4. 크리스탈 바이올렛 염료 용액을 제거하거나 재활용하고 1x PBS로 각각 10분 동안 3회 세척합니다.
    5. 완전히 마를 때까지 RT에서 우물을 자연 건조합니다.
    6. 일반 정립 현미경 촬영 시스템(스캔 속도: 4μs/픽셀, 스캔 해상도: 1024 x 1024)을 사용합니다.
  8. 각막 mRNA 추출
    1. 안과용 가위, 각막 가위, 톱니 겸자, 전기 각막 상피 스크레이퍼, 트리졸, RNase가 없는 1.5mL 원심분리 튜브 및 아이스 박스를 준비합니다.
    2. 상피 획득
      1. 쥐를 4-5% 이소플루란으로 마취하고 자궁경부 탈구 후 안락사시킵니다. 동물을 옆으로 눕힙니다. 시야를 가리지 않도록 눈 가위로 쥐의 수염을 다듬습니다.
      2. 쥐를 수술용 현미경 아래에 놓고 안구에 초점을 맞출 수 있도록 적절한 높이로 조정합니다. 톱니가 있는 집게를 사용하여 안구를 부드럽게 밀어 노출시킵니다. 쥐의 결막을 들어 올리고 깨끗한 전기 각막 상피 스크레이퍼를 사용하여 각막 상피의 중앙 2mm 영역을 긁어냅니다.
      3. 알코올을 뿌린 깨끗하고 이가 있는 집게로 긁힌 각막 상피를 수집합니다. 수집된 조직을 1mL의 Trizol이 들어 있는 원심분리 튜브에 넣습니다.
      4. 가능한 한 빨리 작업하여 이중 탈이온수가 들어 있는 50mL 원심분리 튜브에서 수집된 조직을 헹굽니다. 여과지로 과도한 물을 흡수하십시오. 75% 알코올을 분사하고 다음 단계로 진행합니다.
      5. 이빨이 있는 집게를 사용하여 쥐의 결막을 다시 들어 올립니다. 오목한 면이 위로 향하게 하여 각막 가위를 사용하여 가장자리를 따라 결막을 자르고 약 0.5mm의 흰색 결막을 남깁니다.
      6. 전기 스크레이퍼를 사용하여 각막 가장자리에서 2mm 범위 내의 각막 상피를 긁어냅니다. 앞에서 설명한 대로 조직을 수집합니다. 3개의 안구에서 중앙 각막 상피를 수집하고 3개의 안구에서 쇄부 상피를 수집합니다.
      7. 수집된 조직을 별도의 1mL Trizol RNA 추출 시약 튜브에 넣습니다. RNA 무결성을 보존하기 위해 얼음에서 전체 작업을 수행합니다. 다음 단계를 즉시 진행하거나 나중에 사용할 수 있도록 샘플을 -80°C의 초저온 냉동고에 보관하십시오.
    3. 얼음 위에서 표본을 해동하고 초음파 조직 균질기를 사용하여 세포를 용해시킵니다. 초음파 균질기의 전력을 25%, 시간을 버스트당 2초, 인터벌 시간을 5초, 총 시간을 2분으로 설정합니다. 얼음 위에 10분 동안 그대로 두십시오.
    4. 각 샘플에 클로로포름(총 부피의 1/5, 약 200μL)을 첨가하고 30초 동안 반전하여 철저히 혼합한 다음 400 °C에서 10분 동안 400 x g 에서 원심분리합니다.
    5. RNA 침전
      1. 원심분리 후 원심분리기 튜브 내부의 액체는 세 부분으로 층을 이룹니다. 위쪽 투명층은 RNA, 중간의 흰색 흐림층은 DNA와 단백질, 아래쪽 층은 트리졸입니다. 약 500μL의 상단 투명 층을 새 1.5mL 원심분리 튜브에 조심스럽게 피펫으로 주입하고 중간 층의 흰색 침전물을 흡인하지 않도록 주의합니다. 실수로 흡인된 경우 원심분리를 반복하여 투명층을 다시 수집합니다.
      2. 투명층이 포함된 원심분리기 튜브에 약 500μL의 예냉된 이소프로판올을 동일한 양으로 추가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 완전히 혼합한 다음 즉시 -80°C 초저온 냉동고에 20-30분 동안 놓습니다. 이 단계는 RNA의 침전을 가속화하는 것을 목표로 합니다.
    6. 샘플을 꺼내 즉시 400 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 소량의 하얗고 벗겨지기 쉬운 침전물이 원심분리기 튜브의 바닥에서 보입니다. 상등액을 버리십시오.
    7. 사전 준비되고 얼음으로 냉각된 70% 에탄올을 각 튜브에 추가합니다. 즉시 4 ° C에서 400 x g 의 냉장 원심 분리기에서 약 10 분 동안 원심 분리기; 침전물을 철저히 세척하려면 위의 단계를 한 번 반복하십시오. 이 단계에서 흄 후드를 자외선으로 15분 동안 사전 살균합니다.
    8. 원심분리기 튜브를 제거하고 상층액을 버린 후 4°C에서 약 250 x g 으로 2분 동안 다시 원심분리합니다. 200μL 피펫 팁을 사용하여 침전물 반대쪽에서 과도한 알코올을 조심스럽게 흡입하고 가능한 한 완전히 건조시킵니다. 사전 UV 살균 흄 후드에 넣어 건조시키고 침전물을 약 15분 동안 자연 건조합니다.
    9. 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 물 40mL에 RNase 억제제 1mL를 첨가하여 용액을 준비합니다. 약 20-30 μL의 적당량의 DEPC 물/RNase 억제제 혼합물을 첨가하여 시료를 용해시킵니다. 침전물이 많으면 30-50 μL를 첨가합니다.즉시 역전사 PCR을 진행합니다.
  9. 역전사 PCR
    1. PCR 기계, RNase-free 1.5mL 원심분리 튜브, 0.2mL PCR 튜브, 얼음 수조 또는 얼음 상자, 피펫 및 RNase-free 팁이 있는지 확인하십시오.
    2. 미량 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다. 각 샘플에 대해 1μg의 RNA가 반응 시스템에 추가되었는지 확인합니다.
    3. 역전사 시스템의 총 부피는 20μL입니다. 샘플 수에 따라 필요한 시약의 총량을 계산합니다. 지침에 명시된 비율에 따라 섞으십시오.
    4. 얼음 위에 반응 시스템을 준비하고 와류로 만든 다음 간단히 원심 분리하십시오. 42 °C에서 15 분 동안 배양하고 90 ° C에서 30 초 동안 배양합니다.
    5. 역전사 과정에서 얻은 cDNA를 실시간 정량 PCR 분석을 위해 직접 사용하거나 -80°C 냉장고에 보관할 수 있습니다.
  10. Real-time 정량 PCR 반응
    1. 10μL 반응 시스템과 함께 Real-Time 정량 PCR 시약 kit17 을 사용합니다. 표 1에 표시된 프라이머 염기서열을 사용합니다.
    2. 위에서 설명한 반응 시스템을 RT-PCR 전용 96웰 플레이트 또는 8스트립 튜브에 추가합니다. 샘플이 잘 섞여 있는지 확인하십시오. PCR 기계에 넣기 전에 튜브에 기포가 있는지 확인하십시오.
    3. PCR 사이클(95°C 동안 5분), 40사이클(95°C 동안 10초, 60°C에서 30초)을 사용하여 유전자를 증폭하고 2-ΔΔ Ct 값을 계산하기 위한 데이터를 완성합니다. 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리, 분석 및 플롯합니다.

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결과

그림 1A에서 볼 수 있듯이, 세극등을 이용한 관찰을 통해 각막 상피의 치유가 손상되었음을 발견했다. 정상적인 상황에서는 중앙 각막 상피가 제거 후 24-48시간 이내에 완전히 치유되지만, 봉합사 모델과 결합된 각막 중앙 상피 절제술에서는 새로운 혈관이 계속 존재했습니다. 모델이 확립된 지 3일째 되는 날, 유의미한 각막 윤부 부종과 신생혈관화가 관찰되었으며, 각막 윤부 줄기 세포 결핍의 전형적인 징후가 국소적으로 나타났습니다. 시간이 지나 7일째 되는 날이 되어도 치유는 여전히 완료되지 않았습니다. 각막 염증 지수는 섬모 울혈, 부중심성 각막 부종 및 중심 각막 부종을 사용하여 평가되었습니다. 각막 부종은 점차 악화되었고, 각막 염증(그림 1A)은 계속 악화되었습니다. 또한 각막 혈관신생술은 염증의 지표입니다. 염증이 진행됨에 따라 각막 신생혈관형성(그림 1B

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토론

염증은 윤부 줄기세포 결핍증18의 발병에 중요한 역할을 하지만, 염증의 특정 메커니즘과 영향에 대해서는 추가 연구가 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 중앙 각막 상피를 긁어내고 중앙 각막 기질을 봉합하여 심각한 각막 염증을 유발하여 LSCD를 유도했습니다. 모델링 후 1일, 3일, 7일째에 각막 염증의 진행과 윤부 줄기세포의 상태를 관찰했습니다. 모델링 후 3일째 되는 날에는 쥐 변연계의 유의미한 부종, 현저한 신생혈관화, 국소 조직 증식 증가가 관찰되었는데, 이는 윤부 줄기세포 결핍의 전형적인 특징이다. 7일째가 되자 각막 부종은 더욱 심해졌고 새로운 혈관의 수는 계속 증가했습니다. RT-qPCR 및 면역형광 염색 기법을 통해 모델링 후 7일차에 대식세포 마커 ED1, 호중구 마커 PMN, 중심 각막 상피 염증 인자 MIP-1α 및 IL-1β의 발현 수준이 크게 상승하는 것을 관찰했습니다. 염증이 진행되는 동안 각막 상피...

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공개 사항

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감사의 글

이 연구는 구이저우성 과학 기술 프로젝트(QKHJC-ZK[2024]ZD043), 저명한 젊은 학자를 위한 푸젠성 과학 기금(2023J06053 [to S.O])의 일부 지원을 받았습니다. 중국자연과학재단(No.82101084 [to S.O.] 및 중국장학위원회(CSC, 202306310049 [to Y.W.]).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10-0 봉합 라인Alcon, Inc., 미국8065698001
2mm 각막 트레핀쑤저우 XVI Vision Company, 중국http://www.66vision.com/
20 μ L, 100 &뮤; L, 1mL 피펫 건 헤드, 세포 배양 플레이트 배양 플레이트, 원심 분리기 튜브Guangzhou Jiete Biological Co., Ltd., 중국https://www.jetbiofil.com/index.html-20
; C 냉장고Qingdao Haier Company, 중국https://www.haier.com/cn/
A 10mL 주사기  Zhejiang Condelai Medical Device Co., Ltd., 중국https://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
슬라이드ShiTai Company188105
Amylene alcohol. Macklin Biochemical, 중국http://www.macklin.cn/products/
Anti-CytokertinAbcam, 영국ab76318
Anti-Keratin 12 항체 EPR17882Abcam, 영국ab185627
Anti-PAX6 항체Abcam, 영국ab195045
안티 스트리핑 슬라이드, 커버 슬립Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. , 중국https://cn.citotest.com/
AutoclaveHirayama, 일본https://hirayama.com.cn/about/
AvertinShanghai Aladdin Biochemical Technology, 중국https://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
클로로포름Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., 중국https://www.siobp.com/web
CO2 오븐 인큐베이터, 초음파 크러셔, 원심분리기Thermo Fisher Technologies Inc., 미국https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
컨포칼 현미경Shanghai Qinxiang Scientific Instrument Co., Ltd., 중국https://www.clinx.cn/about
각막 상피 겸자Suzhou XVI Vision Company, 중국53418D
DAPIVector. Inc., 미국H-1000
DEPC 물  Shanghai Biological Engineering Co., Ltd., 중국https://www.siobp.com/web
Dicuro 아이크림(ofloxacin 아이크림)Santian Pharmaceutical Corporation, 일본https://www.santen.com/asia
D-KSFM, 배양 배지, 이중 항체 및 PBSThermo Fisher Scientific, Inc., 미국https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c, 영국 
전자 저울Shanghai Ohaus Biotechnology Company, 중국http://shbio.com/company
멤브레인 인클로저Parafilm, Inc., 미국https://www.sigmaaldrich.cn
Fluorescein 나트륨 테스트 스트립은 안과에서 사용되었습니다Tianjin Jingming New Technology Development Co., Ltd., 중국https://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
형광 반전 위상차 현미경 시스템TE-2000U, 니콘, 일본https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
냉동 탁상용 원심분리기에펜도르프, 독일https://www.eppendorf.sh.cn 
유리 시트 프레임Xiamen Tianjing Biotechnology Co., Ltd., 중국http://www.tagene.net/
H-1200 DAPI 밀봉제포함 Xiamen Juin Biotechnology Co., Ltd., 중국https://www.bosonbio.com.cn/
HE 염색 키트Auragene, 중국http://jushengwu.com/a048/
Hematoxylin-eosin 염료 솔루션 키트AURAGEN, 미국P032IH
고정밀도 및 저정밀도 전자 저울Sdolis, 독일https://www.solisinverters.com/global
이소프로판올Shanghai Sinopharm Chemical Reagents Co., Ltd., 중국https://en.reagent.com.cn/
Ki-67 항체Abcam, 영국ab16667
액체 질소Xiamen Yidong Gas Co., Ltd., 중국https://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
Microhand 홀더Suzhou XVI Vision Company, 중국http://www.66vision.com/
멀티포름알데히드 분말Sigm, 미국https://www.sigmaaldrich.cn
상온 원심분리기 46Eppendorf, 독일https://www.thermofisher.cn
10월Shanghai Maokang Biotechnology Co., Ltd., China4583
Ordinary biological micrographic systemEclipse 50i, Nikon, Japanhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBSShanghai Anjin Biotechnology Co., Ltd, 중국SH30256.01
PCR 및 반응기 장치Biometra Thermocycler, Germanyhttps://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
사양의 피펫Eppendorf Company, Germanyhttps://www.eppendorf.com/cn-zh/
Primers for Rt-PCRShanghai Bio-Tech Co., Ltd.
프로메인 하이드로클로라이드 0.5% 안약Alcon, Inc., 미국https://www.alcon.com/about-us
쥐 PMN 항체Fitzgerald, 미국20R-PR020
실시간 형광 정량 PCRApplied Biosystems,  미국https://www.thermofisher.cn
역 전사 키트TAKARA, 일본https://www.takarabiomed.com.cn/
Slit lampTOPCON, 일본https://topconchina.cn/
부드러운 집게Suzhou XVI Vision Company, 중국http://www.66vision.com/
Specimen-boxLambolid (Fuzhou) Biotechnology Co., Ltd., 중국http://chuangdianbio.com/
Superclean benchNew Plus Pi Art High Technology Company Limited, 싱가포르https://www.hi-p.com/
톱니집게집게 Suzhou XVI Vision Company, 중국http://www.66vision.com/
Toppicamide 점안액(Medol)Alcon, Inc., 미국https://www.alcon.com/about-us
미량 핵산 단백질 농도 검사Thermo Fisher Technologies Inc., 미국https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen 미국https://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
Zeiss, 수술용 현미경Carl ZEIS, 독일https://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html
/-80 ° Shanghai를 준수합니다MCA341GA 다양한 자

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