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방법 논문

저비용 폴리에틸렌 테레프탈레이트 라미네이션 미세유체역학(Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics) 설계로 멀티플렉스 제브라피시 이미징

1.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67313

⸱

2024년 9월 27일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Bindley Bioscience Center, Purdue University, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

이 논문에서

요약

폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 적층을 사용하여 미세유체 장치를 제조하는 혁신적인 방법은 여러 개의 살아있는 제브라피시 배아를 포획하고 이미징하는 비용과 복잡성을 크게 줄여줍니다.

초록

제브라피시 배아는 투명하기 때문에 상처 치유 및 면역 세포 이동과 같은 기본 과정의 비침습적 생체 내 이미징에 매우 적합합니다. 미세유체 장치는 제브라피시를 포함한 다세포 유기체의 장기 이미징을 지원하기 위해 포획에 사용됩니다. 그러나 소프트 리소그래피를 사용하여 이러한 장치를 제작하려면 3D 프린팅에 대한 전문 시설과 역량이 필요하며, 이는 모든 실험실에서 액세스할 수 있는 것은 아닙니다. 미세유체 장치를 구성하기 위해 이전에 개발된 저비용 폴리에틸렌 테레프탈레이트 적층 방법을 적용하면 기존 기술의 기술 투자보다 훨씬 적은 비용으로 설계 제작 및 반복을 가능하게 하여 접근성을 높일 수 있습니다. 우리는 약물 치료, 수동 상처 및 동일한 시야에서 최대 4개의 배아에 대한 장기 이미징을 수용하기 위해 이 방법으로 만든 장치인 RADISH(Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing)를 사용합니다. 이 새로운 설계를 통해 우리는 손상 직후 2시간 동안 여러 배아에 대한 레이저 절제 및 수동 절제 상처 주변의 칼슘 신호의 총 형태학적 특성과 24시간 동안 상처 가장자리에 대한 호중구 동원을 성공적으로 캡처했습니다.

서론

부상에 적절하게 대응하는 능력은 단일 세포에서 여러 조직에 이르기까지 모든 규모의 모든 유기체의 생존에 매우 중요합니다. 따라서 손상된 부위1에 대한 식세포 동원과 같은 상처 및 관련 반응은 세포 및 조직 생물학에서 중요한 주제입니다. 조직 장벽이 뚫린 직후 상처가 감지되어 상처 수축 2,3 을 포함하는 조직 구배 반응을 일으켜 상처 치유와후속 재생4을 조정합니다. 이 수축의 기계적 특성으로 인해 실험 중에 사용되는 도구는 손상 부위 근처에서 세포의 이동을 물리적으로 방해해서는 안 됩니다.

제브라피시 배아는 치료의 용이성, 유전적 다루기 쉬움, 광학적 투명성으로 인해 척추동물의 상처 반응을 포함한 발달 및 질병을 연구하는 데 탁월한 모델입니다 5,6. 그러나 손상 부위 근처에 있는 세포의 장기적인 행동을 연구하기 위해서는 전체 유기체를 장기간 고정시키는 것이 필요합니다. 저융점 아가로스에 배아를 삽입하는 것은 상처 입지 않은 조직의 단기 이미징에 충분합니다. 그러나 주변의 겔 매트릭스는 상처의 수축 및 이완을 제한하고 시간이 지남에 따라 발달 중인 배아의 성장을 방해합니다 7,8,9.

미세유체역학 장치는 다양한 발달 단계 10,11,12,13,14,15,16에서 제브라피시 배아를 고정시킬 수 있으며, zWEDGI 7과 같은 일부는 수동 상처를 수용할 수 있습니다. 그러나 사용 가능한 장치 설계에는 몇 가지 단점이 있습니다. 예를 들어, 플라스틱에 직접 인쇄된 많은 장치는 광학 투명도가 좋지 않기 때문에 도립 현미경 시스템의 이미징과 호환되지 않습니다. 또한, 병렬 채널은 다위치 이미징10,11을 허용하지만, 현미경 스테이지의 물리적 움직임으로 인해 이미지 획득에 지연이 발생합니다. 이러한 문제를 해결하기 위한 반복적인 반복과 최적화는 모든 새로운 설계에 필요한 재정적 및 기술적 투자를 고려할 때, 특히 폴리디메틸실록산(PDMS) 소프트 리소그래피를 사용하는 현재의 황금 표준 장치 제조 방법의 경우 어렵습니다. 첫 번째 단계인 마스터 몰드 제작에는 3D 모델링 소프트웨어에 대한 지식, 특수 제작 장비에 대한 액세스, 그리고 (사용된 재료에 따라 다르지만) 금형을 사용하기 전에 실란화와 같은 추가 접착 방지 처리가 필요한 경우가 많습니다. PDMS를 한 번 부은 후에는 고온에서 최소 1시간이 소요되며, 일반적으로 최상의 결과를 얻으려면 진공 상태에서 또는 클램프로 수행해야 하며, 종종 클린룸에서수행해야 합니다 7,17,18. 발생 생물학에서와 마찬가지로 이러한 비용은 여러 모델에 걸쳐 많은 고유한 미세유체 환경이 필요한 실험에서 엄청나게 큰 것으로 판명될 수 있습니다.

사용 가능한 대체 건축 자재 중 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)는 내구성이 뛰어나고 독성이 없으며 조작이 용이합니다. PET 시트는 사전 도포된 열 활성화 접착제(일반적으로 에틸렌 비닐 아세테이트)와 함께 대부분의 사무용품점에서 휴대하는 널리 사용 가능한 플라스틱 적층 파우치입니다. 시중에서 판매되는 공예 절단기(즉, 가정 제작자를 위해 설계된 컴퓨터 제어 절단 플로터)를 사용하여 이러한 PET 시트를 성형하고 표준 열 적층 장비를 사용하여 레이어를 서로 접착함으로써 광범위한 잠재적 설계를 빠르게 생성하고 반복할 수 있습니다. 따라서 우리는 Subsequent Healing (RADISH)의 Danio Imaging에 대한 Rotational Assistant를 생성하기 위해 적층된 PET18을 포함하는 이전에 설명된 설계 및 시공 방법을 채택했습니다(그림 1A, B). 여러 개의 대략 쐐기 모양의 억제 채널의 회전 배열은 근접성을 최적화하는 동시에 수동 꼬리 지느러미 절단을 위한 공간을 허용하고, 동일한 시야 내에서 상처 입은 제브라피시 배아의 부상 직후 이미징과 동시 장기 이미징을 수용합니다. 또한 이 건설 방법은 재사용성을 유지하면서 장치 구성에 필요한 초기 자본 비용과 시간을 크게 줄입니다.

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프로토콜

이 연구는 수정 후 3일(dpf) 배아를 사용했지만 2-14개의 dpf 배아를 사용하도록 설계할 수 있습니다. 제브라피시 실험은 국제적으로 인정된 표준에 따라 수행되었습니다. 동물 관리 및 사용 프로토콜은 NIH 교내 연구 프로그램(프로토콜 번호: 1401001018)에서 제브라피시 사용에 대한 지침을 준수하여 퍼듀 동물 관리 및 사용 위원회(PACUC)의 승인을 받았습니다.

1. PET 미세유체 장치의 조립

참고: 이 프로토콜의 모든 부분은 시아노아크릴레이트의 건조 시간에 민감한 1.8단계 및 1.9단계를 제외하고 언제든지 일시 중지될 수 있습니다.

  1. 선택한 소프트웨어(예: Adobe Illustrator, 그림 1A)에서 장치의 패턴을 디자인합니다. 배아의 나이와 크기에 따라 채널의 너비와 중앙 이미징 챔버의 크기를 가장 잘 맞도록 조정합니다.
    1. 각 레이어를 동일한 치수의 개별 이미지 파일로 저장합니다. 사용할 시트의 두께와 조립 순서가 분명하도록 각 파일의 이름을 지정합니다.
  2. 제조업체의 지침에 따라 절단기를 초기화하십시오.
  3. 절단을 위해 디자인된 각 패턴을 디자인 소프트웨어에 업로드하십시오.
    1. 디자인 작업 영역에서 새로 업로드된 디자인을 선택합니다. 동일한 두께의 PET 시트를 위한 패턴을 동일한 절단에서 함께 그룹화합니다(그림 2A). 필요한 경우 설계 소프트웨어의 패턴 크기를 올바른 치수로 다시 조정합니다.
    2. 절단에서 패턴의 수와 유형을 확인한 다음 절단 재료를 선택합니다.
      참고: PET 시트는 "플라스틱 라미네이팅 파우치"와 같은 이름을 포함하여 설계 소프트웨어에서 재료를 선택하지 않을 수 있습니다. 두께와 질감이 비슷한 재료(예: 투명 시트 또는 비접착 비닐)를 대신 선택할 수 있습니다.
    3. PET 시트를 커팅 매트에 부착하고 단단히 눌러 기포를 제거한 다음 매트를 커팅 머신에 적재합니다. 화면의 지시에 따라 절단 기계가 절단을 시작하도록 지시합니다.
    4. 절단 매트에서 완성된 절단을 제거합니다. 필요한 경우 공예용 칼이나 메스 칼날을 사용하여 절단 패턴을 조정합니다.
      참고: RADISH 디자인(그림 1A)을 만드는 데 사용된 이미지 파일은 벡터 및 PNG 파일 형식(보충 파일 1)으로 다운로드할 수 있습니다. 절단기가 들어 올려지거나 찢어지거나 PET 시트를 깨끗하게 절단하지 못하는 경우 절단 매트를 교체하는 것이 좋습니다.
  4. 커버슬립 유리의 레이어를 보조 없이 또는 미리 절단된 등록 표시로 정렬합니다. 적층 전에 여러 층을 제자리에 함께 고정할 수 있는 경우 동시에 정렬하십시오.
  5. 라미네이션 중 이동하지 않도록 오피스 테이프로 레이어를 고정합니다(그림 2B). 장치 크기와 라미네이터 용량에 따라 라미네이터 피드가 걸리거나 막히는 것을 방지하기 위해 더 많은 테이프를 사용하여 작은 디자인을 더 큰 뒷면에 장착하십시오(그림 2C).
    참고: 라미네이션에 사용되는 지지대는 절단 매트와 동일하지 않으며 주로 라미네이터에 견인력을 제공하는 역할을 합니다. 무시할 수 있는 두께의 내열성 재료는 모두 지지대로 작동합니다(마분지, 접힌 사무용 용지 또는 더 큰 PET 시트를 포함하되 이에 국한되지 않음).
  6. 라미네이터를 켜고 제조업체의 지침에 따라 라미네이트하십시오. 다음 레이어를 정렬하기 전에 사무용 테이프를 제거합니다(그림 2D).
  7. 모든 레이어가 부착될 때까지 1.4-1.6단계를 반복합니다.
  8. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 35/3" 구멍이 뚫린 4mm 접시에 장치를 고정합니다(그림 2E, F). 실험적 요구 사항에 따라 접시의 모양과 유형을 조정합니다(예: 24웰 플레이트에 장치 1웰 또는 더 큰 페트리 접시를 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰 용기). 충분한 접착제를 사용하여 장치가 범람하지 않도록 접시에 완전히 밀봉하십시오.
    알림: 장치 기능을 위해 장치를 고정 접시에 고정할 필요가 없습니다. 주의: 시아노아크릴레이트는 몇 초 만에 피부와 눈을 결합하고 호흡기, 눈 및 피부를 자극합니다. 손과 보안경을 착용하고 환기가 잘 되는 곳에서 작업하십시오.
  9. 외부 장치 가장자리를 시아노아크릴레이트 접착제로 철저히 코팅하여 PET 라미네이트를 방수합니다(그림 2F). 바깥쪽 가장자리를 완전히 덮을 수 있도록 충분한 접착제를 사용하십시오. 사용하기 전에 접착제가 최소 2시간 동안 경화되도록 하십시오.
    알림: 시아노아크릴레이트 연기가 배출될 수 있는 충분한 공간을 확보하십시오. 연기가 축적되면 시아노아크릴레이트가 장치에 침전되어 광학적으로 투명한 물질이 가려질 수 있습니다.

2. RADISH 내 배아의 위치 지정 및 이미징 준비

  1. 표준 배아 사육 매체 E319에서 제브라피시 배아를 키웁니다. 필요한 경우, 이미징 최소 1시간 전에 배아를 탈각하여 평평하게 만들 수 있도록 합니다. 이 실험은 3 dpf의 배아를 사용했지만 배아는 최대 14 dpf일 수 있습니다(그림 1E).
  2. 실험적 필요에 따라 배아를 염색하거나 처리합니다.
    참고: 이 실험에서 외부 상피층의 세포막은 100nM MemGlow 560으로 배양하여 관련된 곳에 염색되었습니다.
  3. 164 mg/L MS-222를 사용하여 배아를 마취합니다20.
    참고: 사용된 정확한 농도 및 마취제는 실험자의 선호도에 따라 조정될 수 있습니다. 마취 농도를 줄여 장기간 영상 촬영을 성공적으로 수행할 수 있습니다(4.1단계 참조).
  4. 장착된 장치가 들어 있는 보관 접시에 164mg/L MS-222가 들어 있는 E3 5mL를 채웁니다.
  5. 이송 피펫을 사용하여 마취된 배아 하나를 장치의 각 보관 챔버에 넣습니다. 이미징 기간 동안 배아가 액체에 잠긴 상태로 유지되는지 확인합니다.
    참고: 무 디자인은 1-4개의 배아를 고정시킬 수 있습니다.
  6. 털 고리를 사용하여 배아의 꼬리가 중앙 이미징 챔버로 돌출되고 난황이 쐐기 모양의 채널에서 단단히 고정되도록 배아의 방향을 지정합니다(그림 1C).
    참고: 배아의 방향을 정하는 것은 조작의 용이성을 위해 실체현미경 아래에서 수행될 수 있습니다.
  7. 원하는 경우, 마이크로피펫을 사용하여 1.5% 저용융 아가로스를 보관 챔버에 첨가하여 배아의 머리를 고정합니다.
  8. 배아가 있는 장치를 선택한 이미징 시스템으로 이동하여 이미징을 시작합니다.

3. 상처 후 칼슘 과도 현상의 이미징

참고: 이 섹션과 섹션 4는 선택 사항이며 잠재적인 샘플 실험으로 제공됩니다.

  1. 이미징에 적합한 시스템과 대물렌즈를 선택합니다.
    참고: 여기에서 반전 레이저 스캐닝 컨포칼에는 20x 대물렌즈가 장착되었습니다.
  2. 최적의 신호 대 잡음비와 획득 속도를 위해 샘플 초점과 이미징 매개변수(예: 레이저 출력: 5, 게인: 90, 핀홀 크기: 2AU, 노출 시간[스캔 속도: 1프레임/초])를 조정합니다.
    참고: 상처 형성과 이미지 획득 사이의 지연을 줄이기 위해 상처를 입히기 전에 샘플의 초점을 미리 맞추고 선택한 이미징 시스템의 각 채널에 대한 매개변수를 조정하는 것이 좋습니다.
  3. Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18 21,22 배아를 감습니다.
    1. 수동 절개를 통해 배아를 감으려면 실체현미경(비디오 1)으로 노토코드 끝에 있는 꼬리 지느러미 조직을 메스 날로 가한 다음 장치를 무대로 되돌립니다.
      주의 : 메스 날로 과도한 압력을 가하면 밑에 있는 유리가 깨질 수 있습니다. 유리에 금이 가면 장치를 버리고 1.2단계부터 다시 시작하십시오.
    2. 레이저 자극을 통해 배아를 감으려면 꼬리 지느러미 주름의 가장자리 근처에 관심 영역(ROI)을 정의하고 사용 가능한 레이저 출력에 따라 자극합니다.
      참고: 여기서 800nm에서 30초 동안 2.4W의 레이저 출력으로 전체 두께의 상처를 유발하기에 충분했습니다.
  4. GFP(여기 488nm, 방출 510nm) 및 RFP(여기 561nm, 방출 610nm) 채널을 사용하여 실온에서 1분의 프레임 간격을 사용하여 총 1시간 동안 이미지.
  5. (선택 사항): 필요한 경우, 전사 피펫을 사용하여 머리 근처에서 부드럽게 흡입하거나 접시를 휘젓는 방식으로 이미징 한 후 배아를 추출하기 위해 배아를 방출합니다.

4. 상처 후 호중구 모집 이미징

  1. 이미징 최소 1시간 전에 표준 마취제 농도의 절반(이 경우 82mg/L MS-222)을 포함하는 배아를 E3로 이식합니다.
  2. 이미징에 적합한 대물렌즈를 선택합니다(여기서는 10x 대물렌즈가 장착된 도립 레이저 스캐닝 컨포칼).
  3. 최적의 신호 대 잡음비와 획득 속도를 위해 샘플 초점과 이미징 매개변수(예: 레이저 출력: 5, 게인: 90, 핀홀 크기: 2AU, 노출 시간 [스캔 속도: 0.5 프레임/초]))를 조정합니다.
    참고: 상처 형성과 이미지 획득 사이의 지연을 줄이기 위해 상처를 입히기 전에 샘플의 초점을 미리 맞추고 선택한 이미징 시스템의 각 채널에 대한 매개변수를 조정하는 것이 좋습니다.
  4. 실체현미경으로 꼬리 지느러미 조직을 메스 날로 가하여 수동 절개를 통해 4개의 Tol2(mpx:Dendra2)23 배아를 감은 다음 장치를 무대로 되돌립니다.
  5. 24시간 동안 5분 프레임 간격을 사용하여 실온에서 GFP(여기 488nm, 방출 510nm) 채널에서 이미지를 캡처합니다.
  6. 필요한 경우, 전사 피펫을 사용하여 머리 근처에서 부드럽게 흡입하거나 접시를 휘젓는 방식으로 이미징한 후 배아를 추출하기 위해 배아를 방출합니다.

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결과

RADISH의 도움을 받거나 받지 않은 레이저 스캐닝 컨포칼로 생성된 이미지 품질을 비교하기 위해 외부 상피층에서 인텐시메트릭 칼슘 바이오센서 GCaMP6f22,24를 발현하는 배아를 MemGlow 560을 사용하여 염색하고 프레임당 1분의 시간 간격으로 꼬리 지느러미 주름의 전체 두께를 커버하는 역 레이저 스캐닝 컨포칼로 이미지화했습니다(비디오 2). 장치를 사용하지 않으면(그림 3A) 샘플이 크게 드리프트되고 밴딩 아티팩트가 표시되었으며, 이는 장치를 사용한 이미징과 비교하여 지정된 시간 해상도에 맞추기 위해 Z 스택을 25개의 슬라이스로 제한한 결과입니다(그림 3B). RADISH는 Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)xt18<...

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토론

PET 적층 방법의 핵심 전제는 소프트 리소그래피 또는 PDMS 성형과 같은 미세 유체 장치를 만드는 기존 수단에 비해 비용 절감 및 기술 진입 장벽을 최소화하는 것입니다. 따라서 이 프로토콜에서 유일하게 중요한 단계는 적층 중 PET 층을 정확하게 정렬하고 시공 후 장치 가장자리를 방수하는 것입니다. 상기 방법의 다른 모든 부분들은 실험적 필요에 따라 변형될 수 있다(예를 들어, 더 어리거나 더 나이가 많은 배아의 고정화가 요구되는 경우, PET 층의 두께를 조절하여 그에 따라 채널을 좁히거나 넓힐 수 있다). 디자인은 어떤 형태로든 생성될 수 있으며, 재료가 라미네이터(18,27)를 통해 보내질 수 있을 만큼 충분히 얇고 열에 강하고 얇은 한 모든 기본 재료에 적층될 수 있습니다. PET 시트는 3차원 이미지 파일이 아닌 2차원 이미지 파일을 읽는 시중에서 판매...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R35GM119787에서 QD)의 연구 자금으로 지원되었습니다. 이 작업은 NSF(National Science Foundation) 생물학 통합 연구소인 EMBRIO Institute, NSF 계약 #2120200의 지원을 받는 노력을 기반으로 합니다. 컨포칼 이미징은 Purdue Imaging Facility에서 수행되었습니다. Tg(UAS:GCaMP6f) 라인을 제공해 주신 Guangjun Zhang 박사(퍼듀 대학교)에게 감사드립니다. (cdh1-tdtomato)xt18 라인을 제공해 주신 David Tobin 박사(듀크 대학교)에게 감사드립니다.

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재료

직경 벡터 편집기입니다. 없음 https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png< 잡드 시 접착제가 있는 3mil 접착제가 있는 5mil
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
25mm 원형 커버 유리 #1 두께Chemglass Life SciencesCLS-1760-025베이스 장착 재료. 두께는 현미경 렌즈의 사양에 따라 선택되었습니다.
Adobe Illustrator v28.5장치 패턴을 디자인하기 위한AdobeN/A
염화칼슘 이수화물피셔C79E3 매체 만들기용.
디자인 PNG 파일(온라인 미러)N/AN/Abr/> https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png
https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png
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22-079-697		수동 절단 조정을 위한 메스 블레이드. 유사한 공예 칼(예: X-acto #2 칼)도 작동합니다.
염화칼륨피셔BP366E3 매체 만들기용.
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PET 열 라미네이팅 파우치, 열ScotchTP3854PET 시트. 시트는 샌드위치 쌍으로 도착하므로 사용하기 전에 분리해야 합니다. 접착면이 아래를 향하도록 자릅니다.
PET 열 라미네이팅 파우치, 열ScotchTP5854PET 시트. 시트는 샌드위치 쌍으로 도착하므로 사용하기 전에 분리해야 합니다. 접착면이 아래를 향하도록 자릅니다.
트리카인(MS-222)SyndelIC10310680물고기 마취제.

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