방법 논문

2D-TAU 젤 전기영동을 이용한 히스톤 프로테오폼 공개

DOI:

10.3791/67321

⸱

2024년 10월 18일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center on Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Græcia University of Catanzaro, 2Department of Pharmacy, Health and Nutritional Sciences, University of Calabria

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법은 히스톤 단백질형 특성화 및 조사를 위한 간단하고 빠른 전략을 설명합니다.

초록

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히스톤은 메틸화(methylation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation), 아실화(acylation) 및 유비퀴틴화(ubiquitination)와 같은 다양한 번역 후 변형(PTM)을 거쳐 뉴클레오솜 역학을 제어하고 세포의 운명을 결정합니다. 염색질의 기능 단위인 뉴클레오솜은 DNA, 구상핵을 구성하는 4쌍의 히스톤(H3, H4, H2A, H2B), 염색질 구조를 안정화하는 링커 히스톤 H1으로 구성됩니다. 히스톤의 아미노(N) 말단 꼬리는 구상 코어 도메인에서 돌출되어 염색질 지형에 영향을 미치는 뚜렷한 PTM을 거칩니다. 일부 증거는 히스톤 PTM 항상성이 모든 생리적 활동을 보존하는 데 중요하다는 것을 시사합니다. 히스톤 PTM의 탈조절은 비정상적인 세포 증식, 침입 및 전이의 주요 원인입니다. 따라서 히스톤 PTM을 특성화하는 방법을 개발하는 것이 중요합니다. 여기에서는 히스톤 동형을 분리하고 분석하기 위한 효과적인 기술에 대해 설명합니다. 두 개의 직교 분리의 조합을 기반으로 하는 이 방법은 히스톤 동형의 농축과 다음과 같은 질량 분석 식별을 가능하게 합니다. Shechter et al.이 원래 설명한 이 기술은 크기와 전하에 따라 염기성 히스톤 단백질을 분리할 수 있는 산-우레아 폴리아크릴아미드 겔(TAU-GEL)과 분자량에 따라 단백질을 분리할 수 있는 도데실나트륨 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE)을 결합합니다. 그 결과 히스톤 동형의 2차원 지도가 생성되었으며, 이는 인젤 분해에 적합하며 질량 분석법 식별 및 웨스턴 블롯 분석이 뒤따릅니다. 그 결과 히스톤 동형의 2차원 지도가 생성되었으며, 이는 겔 내 소화에 이어 질량 분광법 식별 및 웨스턴 블롯 분석에 적합합니다. 이 단백질체 접근법은 단일 히스톤 동형을 농축하고 새로운 히스톤 PTM을 특성화할 수 있는 강력한 방법입니다.

서론

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암 발병, 진행 및 화학 저항성은 히스톤 PTM을 포함한 유전 및 후성 유전 학적 사건과 관련이 있습니다. 히스톤은 염색질 역학을 조절하고 세포의 운명을 지시하는 다양한 PTM을 겪습니다1.

뉴클레오솜(nucleosome)은 염색질의 기능 단위이며 DNA가 핵으로 패키징될 수 있도록 하는 DNA와 단백질의 분자 복합체입니다. 뉴클레오솜 코어를 구성하는 4쌍의 히스톤(H3, H4, H2A, H2B)과 염색질 구조를 안정화하는 데 도움이 되는 링커 히스톤 H1으로 구성됩니다. 히스톤 아미노(N) 말단 꼬리는 구형 코어 도메인에서 돌출되어 염색질 조경에 영향을 미치는 특정 번역 후 변형을 겪습니다2.

지금까지 적어도 23 종류의 히스톤 PTM이 알려져 있습니다. 이러한 PTM은 주로 메틸화, 아세틸화, 인산화, 글리코실화, 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화로 구성되는 공유 변형입니다3. 또한, 후성유전체 항상성과 대사 재배전 사이의 긴밀한 상관관계가 최근에 제안되었으며, 이는 가능한 히스톤 수 PTM의 기하급수적인 증가를 설명합니다 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 변형 효소에 의해 증착, 삭제 및 형질전환된 히스톤 PTM은 각각 writers, erasers 및 readers로 명명됩니다. 이는 염색질 구조의 물리적, 화학적 특성에 영향을 미치며, 종양 억제 유전자 및 종양 유전자 14,15,16의 발현을 포함한 유전자 발현 프로파일에 영향을 미칩니다.

히스톤 프로테오폼의 수는 히스톤 변이체로 뉴클레오솜에 통합될 때 증가합니다. 이러한 변이체는 표준 히스톤의 비대립형질 이소형이며 염색질의 화학적, 물리적 특성을 변경하여 복잡성을 추가합니다. 표준 히스톤과 비교하여, 히스톤 변이체는 고유한 번역 후 변형을 겪거나 특정 염색질 성분과 상호 작용하는 기능적 도메인을 가지고 있어 뉴클레오솜17의 역학 및 안정성에 영향을 미칩니다.

암세포에서 히스톤 PTM 및 변이체의 탈조절은 유전자 발현 프로파일에 영향을 미쳐 비정상적인 세포 증식, 침입, 전이 및 약물 내성 경로의 활성화로 이어집니다 3,18,19,20. 히스톤 또는 염색질 리모델링 복합체 내의 돌연변이는 세포 표현형을 변화시켜 종양 변형에 기여할 수 있습니다. 히스톤 메틸화와 같은 후성유전학적 변형의 축적은 약물 내성 경로를 활성화하는 핵심 요인입니다 21,22,23. 29개의 유전자로 암호화된 15개의 소단위로 구성된 SWI/SNF 복합체 내의 돌연변이는 많은 종양 유형에 걸쳐 인간 암의 20% 이상에 영향을 미칩니다. 지난 10년 동안 후성유전학 기반 약물 전략(epi-drugs)이 개발되었으며, 비정상적인 히스톤 변형 패턴을 가진 암을 표적으로 하는 많은 약물이 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았습니다23.

히스톤 단백질의 분석은 매우 까다롭기 때문에 까다로운 연구 분야입니다. 최근에는 질량 분석 방법이 히스톤 단백질형을 특성화하고 연구하는 데 선호되는 방법이 되었습니다. 그러나 일부 변이체의 낮은 용해도와 높은 염기서열 상동성과 함께 급격한 추출 조건으로 인해 분석이 까다로워집니다.

지난 10 년 동안 히스톤 프로파일 링 및 조사를 위해 여러 질량 분석 기반 방법이 개발되었습니다24 , 25 , 26 , 27 . 이 연구에서는 히스톤 단백질형의 2차원 지도를 만드는 비용 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 제시하여 새로운 번역 후 변형을 발견할 가능성을 높일 수 있습니다.

2D TAU 전기영동은 산성 조건에서의 분리와 SDS PAGE를 결합합니다. 첫 번째 차원에서 매질의 산성 조건은 염기성 단백질에 순 양전하를 제공합니다. 히스톤은 매우 기본적인 단백질이고 매질에 비해 등전점(pH)이 높기 때문에 양전하를 띠고 전기장 아래로 이동합니다. 두 번째 차원에서 히스톤은 SDS에 의해 변성되고 분자량에 따라 분리됩니다. 결과 2D 맵은 질량 분석 및 면역학 연구를 위해 단일 지점 해상도에서 특정 단백질형을 풍부하게 하는 도구로 사용할 수 있습니다28,29. 전기영동 후 2D TAU 스폿을 염색하고 트립신을 분해하며 질량 분석법으로 분석할 수 있습니다. 또는 2D TAU 맵을 니트로셀룰로오스/PVDF 필터에 블롯팅하고 면역염색27로 조사할 수 있습니다.

이러한 맥락에서, 이 방법은 대사 재배선과 관련된 새로운 번역 후 변형의 식별 및 분석을 개선하기 위해 전략적일 수 있습니다30,31.

우리는 DNA 분해 및 단백질 용해도 개선에 도움이 되는 초음파 처리 단계를 통합하여 원래 방법을 더욱 개선했습니다. 또한, 우리는 고순도의 단백질 샘플을 얻기 위해 히스톤 추출을 위한 배양 단계를 연장했습니다. 또한, 우리의 프로토콜에서는 더 나은 해상도를 달성하기 위해 더 오랜 시간 동안 저전압에서 1차원을 실행했습니다. 생성된 겔은 표준 히스톤 PTM을 조사하고 당화10,32와 같은 새로운 변형을 특성화하는 데 사용되었습니다.

전반적으로, 우리는 히스톤을 추출하고 정제하는 방법을 개발했으며, 그 다음에는 2차원 지도를 사용하여 히스톤 단백질형을 분해했습니다. 이 작업에는 질량 분석 분석을 위한 인겔 분해 절차와 2차원 웨스턴 블롯 분석 단계도 포함됩니다.

프로토콜

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1. 히스톤 추출

  1. 80% 융합된 최소 1 x 106 세포에서 히스톤 추출을 수행합니다. 이 실험에서는 ATCC의 MCF-10A 세포주를 사용했습니다. 도금 후 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS) 1x로 세포를 세 번 세척합니다. 얼음 위에서 모든 단계를 수행하십시오.
  2. 10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM KCl 및 1.5mM MgCl2를 포함하는 세포 용해 완충액을 준비합니다. 사용 직전에 1mM 디티오에리스리톨과 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제를 첨가하십시오.
  3. 세포 함유 페트리 접시에 800μL의 세포 용해 완충액을 추가하고, 긁어내고, 1.5mL 튜브에 세포를 채취한 다음, 300rpm, 4°C의 회전체에서 1시간 동안 배양합니다.
  4. 10,000 x g, 4 °C에서 1.5 mL 튜브용 로테이터가 있는 예냉각식 마이크로 원심분리기에서 10분 동안 원심분리합니다.
  5. 400μL의 세포 용해 완충액과 원심분리기로 펠릿을 10,000 x g, 4°C에서 10분 동안 세척합니다. 상등액을 버리십시오. 세탁 단계를 3회 반복합니다.
    알림: 모든 단계에서 4ml 튜브용 로테이터가 있는 예냉식 미세 원심분리기(1.5°C)를 사용합니다. 재료 손실을 방지하기 위해 펠릿을 조심스럽게 다루십시오.
  6. 펠릿을 0.2 M H2SO4 의 640 μL에 재현탁시키고 300 rpm, 4 ° C, 16 시간 동안 회전체에서 배양합니다.
    주의 : 황산은 위험한 화학 물질입니다. 화학 흄 후드 아래에서 사용하십시오.
  7. 16,000 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리기 상층액을 새 튜브에 옮기고 다음 단계까지 보관하십시오. 핵 파편을 버리십시오.
  8. 212 μL의 트리클로로 아세트산을 한 방울 한 방울 첨가하여 히스톤을 침전시킵니다 (TCA의 최종 농도는 33 %). 튜브를 10번 뒤집어 용액을 혼합합니다. 어둠 속에서 얼음 위에서 16시간 동안 배양합니다.
    주의 : TCA는 유해 화학 물질입니다. 화학 흄 후드 아래에서 사용하십시오.
  9. 4°C에서 10분 동안 16,000 x g 의 예냉각된 원심분리기에서 회전하여 히스톤을 펠릿화합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 200μL의 차가운 아세톤으로 3x 세척합니다.
  10. 펠릿을 차가운 아세톤으로 재현탁시킨 다음 얼음 위에서 10분 동안 일시 중지하면서 30초 켜기/끄기의 3회 주기로 고출력을 2번 초음파 처리합니다.
    알림: 절차는 초음파기를 사용하여 수행되었습니다. 이 단계는 히스톤으로 감싼 DNA를 제거하는 데 필수적입니다.
  11. 16,000 x g 에서 10분 동안 원심분리기를 하고 아세톤을 버리고 시료를 100μL의 이중 증류수에 재현탁합니다. 제조업체의 지침에 따라 Bradford 분석 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정합니다33.
    참고: 원심분리 후 펠릿이 때때로 흰색 또는 반투명하게 나타납니다. 흰색과 불투명한 침전물은 2D 분리를 손상시킬 수 있는 염 오염 물질의 존재를 나타낼 수 있습니다. 그렇다면 펠릿이 반투명해질 때까지 아세톤 세척 단계를 반복하십시오.
  12. 제조업체의 지침에 따라 70μg의 히스톤을 동결 건조합니다. 동결 건조기를 30°C에서 60분 동안 설정합니다. 튜브 부피를 확인하고 샘플이 완전히 동결건조될 때까지 30°C에서 단계를 반복합니다(일반적으로 샘플을 완전히 동결건조하려면 90분이 필요함). 60분 후에는 프로세스가 샘플에 따라 다르므로 10분마다 부피를 확인합니다.
    참고 : 히스톤 단백질의 양이 적으면 2 x 106 세포에서 시작하십시오. 이 경우 1 x 106 세포에 사용된 것과 동일한 부피의 시약을 사용하십시오. 절차 중에 사용 된 모든 화학 물질의 순도를 확인하십시오. 모든 시약은 HPLC 등급이어야 합니다.

2. 미니 2D 젤 트리톤-산-우레아(TAU) 전기영동

  1. 아래 설명된 대로 미니 수직 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 시스템을 위한 mini-TAU 겔을 준비합니다.
    1. 분리 젤 준비: 6M 요소, 15% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(29:1), 5% 빙산 아세트산, 0.25% 트리톤 X-100(v/v), 0.4% TEMED(v/v), 0.1% APS(p/v). 용액을 준비하려면 아크릴아미드/비스에 요소를 녹이고 초순수 1mL를 실온에서 부드럽게 교반하여 용해시킵니다. 다른 구성 요소를 추가하고 볼륨을 조정합니다. 미니 TAU 젤의 경우 용액 10mL를 준비합니다. 미리 설정된 젤 플레이트에 용액을 채우고 상단에서 불과 1.5cm 떨어진 곳에 기포가 형성되지 않도록 합니다. 용액을 1mL의 이소프로판올로 덮어 젤의 수평을 만듭니다.
    2. 스태킹 젤 준비: 6M 요소, 6% 아크릴아미드/비스아크릴아미드(29:1), 5% 빙산 아세트산, 0.25% 트리톤 X-100(v/v), 0.4% TEMED(v/v), 0.1% APS(p/v). 용액을 준비하려면 아크릴아미드/비스와 초순수 1mL에 요소를 용해시킵니다. 다른 구성 요소를 추가하고 볼륨에 맞게 조정합니다. 젤 플레이트에 스태킹 용액을 채우고 플레이트 사이에 10웰 젤 빗을 놓고 젤 용액이 빗의 치아 중간까지 올라올 때까지 삽입합니다. 겔이 4°C에서 16시간 동안 중합되도록 합니다.
      알림: 우물이 규칙적으로 형성되도록 빗을 조심스럽게 삽입하십시오.
  2. 6M 요소, 5% 빙산 아세트산 및 이중 증류수를 용해하여 100μL의 TAU 샘플 버퍼를 준비합니다. 준비된 동결건조된 시료를 30μL의 TAU 시료 완충액에 용해시킵니다.
  3. 미니 카세트에 TAU 러닝 버퍼, 5% 아세트산 최종 농도를 채웁니다. 러닝 버퍼가 채워진 주사기로 TAU-gel의 웰을 헹구고 마이크로피펫을 사용하여 웰에 샘플을 로드합니다.
  4. 전기 영동 챔버를 양극(빨간색) 전극이 바닥에 놓인 상태로 전원 공급 장치에 연결합니다. IP가 pH> 때 단백질은 양전하를 띠므로 양극에서 음극으로의 이동이 이루어집니다. 먼저 젤을 30V에서 70분 동안 실행한 다음 25V의 정전압에서 17시간 동안 실행합니다.
    알림: 이 시간 동안 때때로 전원 공급 장치를 끄고 일회용 주사기를 사용하여 젤 웰을 헹굽니다. 주사기를 사용하여 겔 바닥 표면에서 기포를 제거하는 데 주의하여 샘플이 손실되고 분해된 단백질에 번짐이 발생하지 않도록 하십시오.
  5. 젤 플레이트에서 젤을 제거하고 깨끗한 메스로 관심 라인을 자릅니다. 젤이 파손되지 않도록 젤을 조심스럽게 다루십시오. 관심 선은 무색이므로 관심 선을 정확하게 식별하고 절단하기 위해 샘플을 웰 번호 1에 로드합니다.
    참고: mini-TAU gel의 분리를 확인하려면 샘플을 복제하여 준비하고 실행합니다. 이 젤 중 하나는 Coomassie Brilliant Blue를 사용하여 염색할 수 있습니다. 분리 패턴은 그림 1A에 보고되어 있습니다.
  6. 15분 동안 0.5M Tris-HCl pH 8.8 mL로 레인을 세척합니다.
  7. 15M 요소, 6M Tris-HCl, pH 6.8, 30% 글리세롤, 20% SDS 및 2% 디티오에리스리톨을 사용하여 15mL의 평형 완충액 2을 준비합니다. 15M 요소, 6.5M Tris-HCl, pH 6.8, 30% 글리세롤, 20% SDS 및 2% 요오도아세트아미드를 사용하여 2mL의 평형 완충액 2를 준비합니다. 사용 직전에 평형 버퍼 1 및 2를 준비합니다. 평형 버퍼 2를 어두운 곳에 보관하십시오.
  8. 겔 레인을 부드러운 교반 하에서 10mL의 평형 완충액 1에 15분 동안 배양한 다음 디캔트합니다. 부드러운 교반 하에서 10mL의 평형 완충액 2를 어두운 곳에서 15분 동안 배양한 다음 디캔팅합니다.
  9. 표 1에 따라 분해능 SDS 15% 아크릴아미드 겔을 준비합니다. 겔 플레이트를 설치하고 분해 겔 용액으로 채웁니다. 긴 젤 플레이트 끝에서 1.5cm 떨어질 때까지 용액을 채웁니다. 표면에 이소프로판올 1mL를 넣어 젤의 수평을 맞추고 중합되도록 합니다.
  10. 겔 중합 후 이소프로판올을 디캔팅하고 3MM Chr 셀룰로오스 크로마토그래피 종이로 웰을 건조시킵니다. 8단계의 결과 레인을 젤 웰에 삽입합니다.
  11. 1x Tris/glycine/SDS 완충액에 0.5% 저융점 아가로스의 밀봉 용액과 0.003% 브로모페놀 블루 5μL의 밀봉 솔루션으로 분해 겔에 레인을 밀봉합니다. 아가로스 겔 중합을 30분 동안 기다립니다.
    참고: 젤 번짐을 방지하기 위해 아가로스 밀봉 중 기포 형성을 피하십시오.
  12. 겔 플레이트를 카세트에 넣고 1x Tris/glycine/SDS buffer를 채웁니다. 브로모페놀 블루 염료가 바닥에 도달할 때까지 120V에서 젤을 실행합니다. 플레이트에서 젤을 부드럽게 제거하고 과도한 아가로스를 버리고 질량 분석법과 호환되는 절차를 사용하여 겔을 실버 염색하거나 면역 분석을 위한 블롯을 사용합니다.

3. 실버 염색 32

  1. 다음 시약을 준비하십시오 - 정착제 : 50 % 메탄올, 5 % 아세트산, 45 % 탈 이온수; 세척 용액 : 50 % 메탄올, 50 % 탈 이온수; 감작제 : 0.02 % Na2S2O3 5H2O, 탈 이온수; 은 시약: 차가운(4°C) 탈이온수에 0.1% 질산은; 개발자 : 0.04 % 포르말린 및 2 % Na2CO3, 포름 알데히드 (37 %) (사용 직전 추가) 0.4 mL 탈 이온수 및 최대 1000 mL 충전; 정지 시약: 5% 아세트산; 겔 저장 용액 : 1 % 아세트산.
    알림: 염색에 사용되는 화학 물질은 위험하므로 화학 흄 후드 아래에서 모든 단계를 수행하십시오.
  2. 다음 사항을 고려하여 표 2 의 절차를 따르십시오. 모든 배양을 부드러운 교반으로 수행합니다. 개발 단계를 시작하기 전에 정지 시약을 준비합니다. 이것은 적절한 강도로 젤 개발을 보장합니다. 현상 단계에서 반점은 배양이 끝나면 밝은 갈색으로 변하는 노란색 신호로 나타납니다. 다른 반점의 강도는 히스톤 단백질형의 양에 따라 달라집니다. 겔은 스팟 절제 및 겔 내 분해를 할 준비가 되었습니다(그림 1B)

4. 젤 내 소화

  1. 다음 용액을 준비하십시오 : 50mM 중탄산 암모늄 (NH4HCO3) / 50 % (v / v) 아세토 니트릴; 50 mM NH4HCO3 중 10 mM 디티오트레이톨 (DTT); 50 mM NH에서 55 mM 요오드아세트아미드(IAA)4HCO3; 0.1% TFA; 50 mM NH4HCO3, pH 8; HPLC 등급 아세토니트릴; 1mL 실리콘 튜브.
    알림: 머리카락이나 피부로 인한 인체 각질 오염을 방지하려면 깨끗한 장갑을 사용하고 깨끗한 장소에서 작업하십시오.
  2. 깨끗한 메스를 사용하여 염색된 젤에서 관심 히스톤 반점을 제거하고 새 실리콘 튜브(1.5mL)에 넣습니다. 동형 교차 오염을 방지하기 위해 단일 지점을 절제하고 단일 튜브에 넣도록 주의하십시오.
  3. 각 겔 스폿에 250μL의 50mM NH4HCO3/50% 아세토니트릴을 첨가하고 실온의 열혼합기에서 부드럽게 교반하여 배양합니다. 용액을 디캔팅하고 이 단계를 3회 반복합니다. 젤 조각이 투명하게 나타납니다.
  4. 아세토니트릴(200μL)을 첨가하여 겔 반점을 탈수합니다. 이 단계에서 젤 조각은 불투명한 흰색을 띱니다.
  5. 아세토니트릴을 디캔팅하고 10분 동안 자연 건조시킵니다. 젤 조각은 튜브에서 건조된 것처럼 보일 것입니다. 환원 및 알킬화는 평형 단계에서 히스톤 단백질이 환원되고 알킬화되었기 때문에 필수적이지 않습니다.
  6. 20μL의 트립신 용액(0.1mM HCl) 또는 겔 조각을 덮기에 충분한 부피로 겔 반점을 재수화합니다. 튜브를 써머 믹서에 넣고 37 °C에서 최소 4 시간에서 16 시간 동안 부드럽게 교반하여 배양합니다.
  7. 트립틱 펩타이드가 함유된 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 겔 조각에 추출 용액 50μL(60% 아세토니트릴, 1% TFA)를 추가하고 4°C에서 10분 동안 초음파 수조에서 2회 초음파 처리합니다.
  8. 추가 트립틱 펩타이드를 함유한 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 동결 건조기를 사용하여 풀링된 추출된 펩타이드를 건조시킵니다. 동결 건조기를 30 °C로 설정하고 용액을 건조시킵니다. 동결건조된 펠릿이 튜브에 나타납니다.
    참고: 이 단계는 볼륨에 따라 다릅니다. 일반적으로 1 시간이면 충분하지만 샘플이 완전히 건조 될 때까지 10 분마다 부피를 확인하십시오.
  9. 각 튜브에 15μL의 0.1% TFA를 추가하고 25°C의 써모믹서에서 부드럽게 배양합니다. LC-MS/MS 분석을 위해 상층액을 바이알로 옮깁니다.

5. 2DTAU 웨스턴 블롯

  1. 이중 증류수를 사용하여 전달 완충액, 250mM Tris 염기, 92mM 글리신 및 10% 메탄올을 준비합니다.
  2. 니트로 셀룰로오스 멤브레인과 여과지를 겔의 치수로 자릅니다.
  3. 겔을 평형을 이루고 멤브레인, 여과지 및 여과지를 전사 완충액에 15분 동안 담급니다. 니트로셀룰로오스 또는 PVDF 멤브레인을 사용하십시오. PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드) 멤브레인을 사용하는 경우 100% MetOH에 담가 활성화하십시오.
  4. 반건조 전사를 위해 카세트에 젤 샌드위치를 다음과 같이 준비합니다: 음극/필터지/젤/니트로셀룰로오스막/필터지/양극. 좋은 결과를 보장하기 위해 젤과 멤브레인 사이의 기포를 제거하십시오.
  5. 카세트를 반건조 장치에 놓고 25V에서 30분 동안 블롯을 실행합니다. 마지막에는 블로팅 샌드위치를 분해하고 면역 분석을 위해 멤브레인을 보관합니다. Ponceau staining으로 전달 효율을 확인하십시오. 오른쪽 상단에 멤브레인을 표시하여 올바른 필터 방향을 유지합니다.
  6. 실험에 따라 1차 및 2차 항체로 배양합니다(그림 2).

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 1A에서는 히스톤 단백질이 1D 겔에서 어떻게 이동하는지 관찰할 수 있습니다. 이것은 1차원의 실행 시간을 이해하기 위한 중요한 예비 단계입니다. 적절한 분리 시간이 결정되면 2차원을 실행합니다. 히스톤 원형의 2D 지도는 독특한 지형 패턴을 보여줍니다(그림 1B). 그림 1B의 각 반점은 특정 히스톤 유형을 나타냅니다. 각 히스톤 단백형이 발견될 수 있는 겔의 정확한 영역을 관찰합니다. 각 히스톤 단백질형에 대한 질량 분석법 식별은 [Perri et al.32]에 보고되어 있습니다. 따라서 이 조건의 각 지점은 특정 히스톤 유형과 연결됩니다. 표준 반점과 함께 추가 반점이 존재한다는 것은 새로운 수정이 존재함을 나타낼 수 있습니다. 겔 이미지는 밀도 측정을 사용하여 획득할 수 있으며, 결과 이미지는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다.

2D TAU 맵의 신뢰성은 지점의 원형 정도에 따라 달라집니다. 실행이 올바르게 수행되면 스폿이 뚜렷한 신호로 나타나고 수평 및 수직 줄무늬가 표시되지 않습니다. 반대로, 샘플, 용액 및 아가로스 오버레이의 불순물은 겔에 줄무늬 및/또는 줄무늬를 유발할 수 있습니다. 겔의 품질은 이미지 디지털화와 다음의 정량적 및 정성적 분석에 영향을 미칩니다. 또한 웨스턴 블롯 분석 및 MS 조사의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 방법의 신뢰성을 확인하기 위해 1차 항체 Acetylated-Lysine(Ac-K2-100) Rabbit mAb32 를 사용하여 분해된 히스톤 단백질형의 니트로셀룰로오스 멤브레인을 조사했습니다(그림 2). 히스톤 신호를 검출하기 위해 항토끼 HRP 2차 항체를 사용했습니다. 예상대로, 밀도계를 사용하면 블롯에 존재하는 각 히스톤 변이체에 대한 특이한 번역 후 변형을 정량화할 수 있습니다.

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그림 1: 1D 및 2D TAUgel. (A) 1D TAUgel을 사용하여 얻은 히스톤 지형 패턴의 대표 이미지. (B) 2D TAUgel을 사용하여 얻은 히스톤 지형 패턴의 대표 이미지. 데이터 식별은 Perri et al. 32에 의해 보고됩니다. 예상대로 각 반점은 특정 히스톤 단백형을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 대표적인 2DTAU 웨스턴 블롯. 이미지에서 각 히스톤 단백질형에서 라이신 아세틸화 수준을 관찰할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시약농도 : 15 %
40% 아크릴아마이드/비스3.75
1.5M 트리스 pH 8.82.5 밀리리터
MilliQ 워터3.6 밀리리터
10% SDS100 마이크로L
10% APS50 마이크로L
테마드5 μL

표 1: 겔 용액 조성 분해.

걸음시간
50% 메탄올 / 5% 아세트산 고정1시간
세척 30% 에탄올2 x 20분
탈이온수 세척1 x 20분
감작제 Thiosulfate 시약1분
탈이온수 세척3 x 20 초
은 질산은30분
탈이온수 세척3 x 1분
개발 개발자25-30 분 참고 : 반점이 보일 때까지 젤을 현상합니다 (연한 갈색).
중지 솔루션1 x 10분
탈이온수 세척2 x 5분
탈이온수 세척1시간

표 2: 은 염색 방법.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

지난 10년 동안 암 환자 치료법은 암 발병과 진행을 주도하는 다양한 분자 변화를 확인함으로써 혁명을 일으켰습니다. 현대 종양학에서 가장 중요한 발전은 포괄적인 분자 분석을 기반으로 한 치료법의 개발입니다. 유전체학 및 단백질체학의 기술 발전은 조기 발견, 감시, 예후 및 약물 모니터링을 위한 특정 바이오마커를 프로파일링하는 데 중요한 역할을 했습니다. 단백질체학(Proteomics)은 특정 조건 하에서 세포, 조직 또는 유기체의 완전한 단백질 보체를 분석하는 것으로 정의되며, 단백질 상호작용(protein interactions), 번역 후 변형(post-translational modifications) 및 국소화(localization)에 대한 연구도 포함합니다34. 단백질체학의 특정 분야는 에피-단백질체학(epi-proteomics)으로, 이는 히스톤 번역 후 변형에 대한 체계적인 연구를 포함합니다. 이는 암의 발병 및 진행과 관련이 있다35. 이 논문은 세포 표현형에 기여하는 특정 히스톤 동형을 식별하는 방법을 간략하게 설명합니다.

이 방법의 중요한 단계는 용해도가 낮고 염기성이 높기 때문에 히스톤을 추출하는 것입니다. 주요 한계는 2D 맵의 복잡성과 변형 수가 적어 MS/MS 분석을 어렵게 만들 수 있다는 것입니다.

전반적으로 이 접근 방식의 주요 이점은 모든 실험실에서 수행할 수 있으며 적절한 예방 조치에 따라 미니 젤 장치를 소유할 수 있다는 것입니다. 이러한 맥락에서 우리는 이 방법이 기관의 대규모 시설에서 혜택을 받을 수 없는 과학자와 같은 많은 과학자들이 에피 단백질체에 대한 지식을 향상시키는 것을 목표로 새로운 에피 마커를 식별하는 데 도움이 될 수 있다고 확신합니다. 또한 이 방법은 서비스로 아웃소싱할 수 있는 질량 분석법과 결합하여 새로운 단백질형을 발견할 수 있습니다. 또한 면역학적 분석법과 함께 사용하여 상용 항체를 사용할 수 있는 특정 번역 후 변형의 변화를 확인할 수 있습니다.

이 방법은 유방암 발병과 관련된 히스톤 변형의 전형적인 변화를 연구하고28마우스 배아 줄기 세포에서 H1의 변형을 조사하는 데 사용되었습니다36. 또한, 이 방법은 빠르게 성장하는 섬유아세포에서 히스톤 카르보닐화37 의 수준을 측정하고 히스톤 당화 및 히스톤 마릴화38과 같은 새로운 히스톤 변형을 탐색하기 위해 성공적으로 사용되었습니다.

우리의 관점에서 볼 때, 우리는 이 방법이 새로운 히스톤 PTM, 특히 아세틸화, 말로닐화, 메틸화, 지질화, 수유, 부틸화 등과 같은 특정 대사 경로의 비정상적인 활성화와 관련된 PTM을 프로파일링하는 데 성공적으로 적용될 수 있다고 확신합니다. 궁극적으로 이 방법은 개별 단백질형을 분리하기 위한 미시적 준비 도구로도 사용될 수 있으며 대사와 연결된 PTM의 분석을 용이하게 할 수 있으므로 이 중요한 연구 분야에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 PRIN2022, DS, CF, AC는 PRIN2022의 지원을 받았으며, MLC는 UMG 박사 프로그램 학교인 분자 종양학 박사 과정의 지원을 받았습니다. 이 작업은 프로젝트 PNRR INSIDE CUP: B83C22003920001의 지원도 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1,4-디티오에리스리톨시그마- 알드리치D8255 &마이너스 유지를 위한 시약; 감소된 상태의 SH 그룹; 이황화물을 정량적으로 환원시킵니다.
1,5 M Tris-HCL 버퍼, pH 8.8BIO-RAD161-0798레졸루빙 젤 버퍼
10x Tris/Glycine/SDS 바이오 라드 1610772이 사전 혼합된 10x Tris/glycine/SDS 러닝 버퍼를 사용하여 단백질 샘플을 SDS-PAGE별로 분리합니다.
2-프로판올SIGMA-ALDRICH335392-프로판올(이소프로판올)은 2차 알코올입니다. 다양한 연료 전지에 사용되는 연료의 대체품으로 테스트되었습니다. 2- 프로판올에 용해 된 CuO 분말은 Cu 콜로이드의 레이저 절제 보조 합성에 사용되었다. Zn (NO3) 2를 가진 2 프로판올의 현탁액은 이산화 티타늄 입히는 스테인리스 (P25-TiO2/SS) 광양극의 제조를 위해 P25-TiO2.This photoanode의 획일하게 두꺼운 층으로 입히는 photoanode의 제조를 위해 전기화학 photocatalytic (ECPC) 강직 과정에 이용되었다.
30% 아크릴아미드/비스 솔루션 BIO-RAD1610158 2.6% 교차결합제. 전기영동 순도 시약 
아세트산 빙하Carlo Erba Reagennts401392아세트산은 많은 산업 응용 프로그램을 가진 중요한 화학 시약입니다.
아세톤Panreac Applichem211007.1214아세톤  다양한 실험실, 제조 및 세척 응용 분야에서 다재다능한 것으로 유명한 용매입니다.
아세토니타일VWR83640320    LC-MS 등급
아가로스인비트로젠15510-027아가로스  입니다  이종다당류  분자 생물학에서 자주 사용됩니다.
암모늄 바이카보네이SIGMA-ALDRICHA6141최소 99,0%
과황산암모SIGMA-ALDRICHA3678분자 생물학용, 전기영동용, ≥ 98% 
Bioruptor plusDiagenodeB01020001 - B01020002- B01020003초음파 발생기
DithiothreitolSIGMA- ALDRICHD9163-5G단백질의 이황화 결합을 줄이는 데 사용되는 환원제.
Dodeca 실버 스테인 키트 BIO-RAD161-0480Dodeca 실버 염색 키트는 폴리아크릴아미드 겔에서 노나그램 수준의 단백질을 검출하는 데 사용하기 쉽습니다.
글리세롤GE - 헬스케어 생명 과학171325010L글리세롤은 단순한 트리올 화합물로 구배 겔, 단백질 안정제 및 저장 버퍼 구성 요소를 캐스팅하는 데 도움이 됩니다.
Halt Phosphatase 억제제 Thermo SCIENTIFIC78428Thermo Scientific Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail은 세포 용해 또는 조직 단백질 추출 중과 후에 단백질의 인산화 상태를 보존합니다. 일회용 칵테일 (100X).   
프로테아제 억제제 중단 Thermo SCIENTIFIC78430Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X)은 세포 용해 및 단백질 추출 중 단백질 분해 분해를 방지하기 위해 시료에 첨가할 수 있는 즉시 사용 가능한 단백질 분해 농축 원액입니다. 일회용 칵테일 (100X).   
염산SIGMA-ALDRICHH1758BioReagent, 분자생물학용
요오도아세트아미드SIGMA-ALDRICHI6125≥ 99% (NMR), 결정질
KClSIGMA-ALDRICHP9541염화칼륨, KCl, is  일반적으로 실험실 루틴에 사용됩니다. pH 전극의 저장 버퍼로 사용하고 전도도 측정을 위한 참조 용액으로 사용하는 것은 잘 알려져 있습니다.
MCF10 세포주atccCRL-10317 1984년 섬유낭포성 유방을 가진 36세 백인 여성의 유선에서 분리된 상피 세포주. 이 세포주는 Michigan Cancer Foundation에 의해 기탁되었습니다.
MgCl2SIGMA-ALDRICH208337염화마그네슘은 무색의 결정질 고체입니다.
N,N,N',N'-Tetramethylethylene-diamineSIGMA-ALDRICHT9281전기영동을 위해, 약 99%
인산염 식염수 완충제 1XCorning153736311 X PBS (인산염 완충 식염수)는  버퍼링  균형 잡힌 소금 용액  해리 전 세포 세척, 세포 또는 조직 운반, 계수를 위한 세포 희석 및 시약 준비와 같은 다양한 생물학적 및 세포 배양 응용 분야에 사용됩니다.
Potassium hexacyanoferrateSIGMA-ALDRICH60299전자 수용체, 전자 수송 관련 시스템에 사용,
SDS 솔루션 20% (w/v) BIO-RAD161-0418도데실황산나트륨. 전기영동 순도 시약 
소듐 티오설페이트, ReagentPlus 99%SIGMA- ALDRICH21,726-3소듐 티오설페이트, ReagentPlus 99%
황산SIGMA-ALDRICH339741황산, 시약, is  황색, 약간 점성이 있는 액체로 제공되는 매우 부식성이 강한 산입니다. 물에 용해되며 이양성자산입니다. 그것은 매우 강한 부식성, 탈수 및 산화 특성뿐만 아니라 흡습성을 가지고 있습니다.
트리클로로아세트산SIGMA-ALDRICHT6399-5G트리클로로아세트산 (TCA)은  단백질1,2 및 핵산의 침전을 위한 시약으로 사용3. 
Trifluoroacetic 산Riedel-de Haë n34957트리플루오로아세트산
트리톤 X-100시그마-알드리치T9284-1L트리톤 X-100은 단백질을 추출하고 가용화하는 데 가장 자주 사용되는 비이온성 폴리옥시에틸렌 계면활성제입니다.
돼지 췌장에서 추출한 트립신SIGMA-ALDRICHT6567단백질체학 등급, 바이오시약, 디메틸화
우레아SIGMA-ALDRICH33247우레아는 카오트로픽제이며 단백질 변성에 사용됩니다. 그것은 단백질의 2차, 3차 및 4차 구조에서 수소 결합을 방해합니다. 또한 DNA 2차 구조에 존재하는 수소 결합을 방해할 수 있습니다
HPLC용 트 늄

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