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방법 논문

핵 수용체에 대한 환경 오염 물질의 결합 친화도를 평가하기 위한 High-Throughput 스크리닝 접근법

859 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67327

⸱

2024년 9월 20일

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 핵 수용체에 결합하는 특정 형광 프로브의 형광 편광을 환경 오염 물질을 스크리닝하기 위한 판독값으로 사용하는 고처리량 스크리닝 시스템을 설명합니다.

초록

환경에서 점점 더 많은 수준의 화합물이 감지되어 광범위한 오염을 일으키고 인체 건강에 위험을 초래하고 있습니다. 그러나 높은 환경 발생에도 불구하고 독성 학적 영향에 대한 정보는 매우 제한적입니다. 독성 연구를 안내하기 위한 고처리량 스크리닝(HTS) 방법을 개발하는 것이 시급합니다. 본 연구에서는 핵 수용체에 대한 환경 오염 물질의 결합 효능을 측정하기 위해 HTS 시스템을 이용한 수용체-리간드 결합 분석을 개발하였다. 이 테스트는 마이크로플레이트 리더(즉, 다양한 화학 물질이 포함된 96웰 플레이트)를 사용하여 특정 형광 프로브의 형광 편광(FP)을 측정하여 수행됩니다. 이 분석은 재조합 벡터의 구성 및 형질전환, 수용체 단백질(리간드 결합 도메인)의 발현 및 정제, 수용체-프로브 결합, 수용체와 화학 물질의 경쟁적 결합의 네 부분으로 구성됩니다. 두 가지 환경 오염 물질인 PFOS(perfluorooctanesulfonic acid) 및 TPHP(triphenyl phosphate)와 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma)의 결합 효능을 측정하여 분석 절차를 설명했습니다. 마지막으로, 이 방법의 장점과 단점 및 잠재적인 응용 프로그램에 대해서도 논의했습니다.

서론

많은 수의 화학 물질이 환경과 인체에서 널리 검출되어 생태 환경과 인간의 건강에 미치는 영향에 대한 심각한 우려를 불러일으키고 있습니다 1,2,3. 높은 환경적 발생에도 불구하고 독성 학적 영향에 대한 정보는 부족합니다. 따라서 화학적 독성 평가를 용이하게 하기 위해 고처리량 스크리닝(HTS) 방법을 개발하는 것이 시급합니다.

Tox21 및 ToxCast 프로그램 4,5에 사용된 HTS 생물학적 분석과 같은 화학적 독성 평가를 위한 여러 고처리량 스크리닝(HTS) 방법이 보고되었습니다. 이러한 방법은 잠재적인 독성 물질을 신속하게 식별하고 화학적 독성 메커니즘에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 그러나 이러한 HTS 생물 검정은 주로 복잡하고 비용이 많이 들 수 있는 세포 기반 시스템에 의존합니다. 또한 화학 독성 평가에도 고처리량 염기서열분석 방법이 사용되었지만 화학 물질에 대한 고처리량 평가를 달성하는 것은 여전히 어려운 과제입니다6. 이전 연구에서는 과불소알킬 물질(PFAS) 및 폴리플루오로알킬 물질(PFAS)7,8,9, 비스페놀 A(BPA)10,11 및 미립자 물질(PM)12을 포함한 여러 환경 오염 물질의 결합 효능을 결정하기 위해 형광 편광(FP) 기반 수용체-리간드 경쟁 결합 분석을 개발했으며, 과산화소체 증식제 활성화 수용체(PPAR)7와 같은 핵 수용체를 가지고 있습니다. 8,9,10,13, 파르네소이드 X 수용체(FXR)11,12 및 갑상선 수용체(TR)14,15. 이 접근 방식은 효율적이고 비용 효율적이며 기계론적 통찰력을 제공합니다.

본 연구에서는 소형 형광 프로브의 형광 편광(FP) 검출을 기반으로 수용체-리간드 결합 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. FP 기반 수용체-리간드 결합 분석의 원리는 그림 1에 설명되어 있습니다. 작은 형광 분자가 평면 편광에 의해 여기되면 방출된 빛은 빠른 분자 회전으로 인해 고도로 탈분극됩니다. 그러나 추적자가 더 큰 수용체에 결합하면 회전이 느려집니다. 추적자가 큰 수용체에 결합될 때 높은 FP 값이 감지되는 반면, 추적자가 자유로울 때 낮은 FP 값이 관찰됩니다. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ)는 probe가 receptor에 결합하기 위해 정제되었다. Rosiglitazone(Rosi), perfluorooctanesulfonic acid(PFOS) 및 triphenyl phosphate(TPHP)를 사용하여 프로브와 수용체의 결합을 경쟁했습니다. PPARγ의 특이적 작용제인 Rosi는 수용체 경쟁 결합 분석에서 양성 대조군으로 사용되었습니다. 또한, PFOS 및 TPHP는 과거 연구 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17에서 PPARγ의 약한 작용제로 확인되었습니다. 또한, 그들은 환경 노출로 알려진 화합물의 다양한 구조적 범주에 속하며 인간 집단에서 상대적으로 높은 검출률로 유명합니다. 이러한 화합물은 경쟁 결합 분석의 광범위한 적용 가능성을 추가로 검증하는 데 사용되었습니다. 절차는 재조합 벡터의 구성 및 형질전환, 수용체 단백질(리간드 결합 도메인)의 발현 및 정제, 수용체-프로브 결합, 수용체와 화학 물질의 경쟁적 결합의 4단계로 구성됩니다.

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프로토콜

시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 재조합 벡터의 구축 및 변환

참고: PPARγ는 표적 유전자를 조절하는 DNA 결합 도메인과 리간드에 의해 활성화된 리간드 결합 도메인으로 구성된 고전적인 핵 수용체 구조를 가진 리간드 의존성 전사 인자입니다. 리간드 활성화 시, PPARγ는 다른 핵 수용체인 레티노이드 X 수용체(RXR)와 이종이합체를 형성하고 PPARγ의 반응 요소에 결합하여 다운스트림 표적 유전자 9,16의 전사를 조절합니다.

  1. PPARγ-LBD에 대한 설계 프라이머( 표 1 참조) 및 PPARγ-LBD DNA 세그먼트를 증폭합니다( 표 2 및 표 3 참조).
  2. His×6 태그가 지정된 pET28a 벡터를 제한 엔도뉴클레아제 XhoI 및 BamHI18로 분해하여 선형화합니다.
  3. 시판되는 클로닝 키트를 사용하여 PPARγ-LBD DNA 세그먼트를 His×6 태그가 지정된 pET28a 벡터에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET28a-PPARγ-LBD-6×His18을 생성합니다.
  4. 단백질 발현을 위해 재조합 발현 플라스미드 pET28a-PPARγ-LBD-6×His를 BL21 (DE3) 대장균 세포에 형질주입18.
  5. 5 μL의 재조합 벡터를 적격 BL21(DE3) 세포에 첨가하고, 얼음에서 30분 동안 배양하고, 42°C에서 45초 동안 열 충격을 가한 다음 즉시 얼음으로 돌아갑니다.
  6. 900 μL의 LB 배지를 넣고 37 °C에서 1 시간 (160-200 rpm) 동안 흔든 다음 실온에서 5 분 동안 ~ 3000 x g 에서 원심 분리합니다.
  7. 상층액을 버리고 박테리아 펠릿을 100μL의 LB 배지에 재현탁시킨 다음 고체 배지에 펴 바릅니다. 플레이트와 배양을 37 ° C에서 12-16 시간 동안 뒤집습니다.
  8. 염기서열분석(sequencing) 식별과 후속 단백질 발현 및 정제를 위한 개별 콜로니(colony)를 선택합니다.

2. 수용체 단백질의 발현 그리고 정화

  1. 100μg/mL 암피실린이 보충된 200mL LB 배지에 형질전환된 BL21(DE3) 세포를 오비탈 쉐이커(230rpm)에서 37°C에서 1-2시간 동안 배양합니다.
  2. OD600 이 10μM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 0.4-0.6 흡광도 단위에 도달하면 세포를 유도하고 16°C에서 16시간 동안 배양합니다.
  3. 박테리아 현탁액과 원심분리기를 8000 × g, 4 °C에서 10분 동안 수집합니다.
  4. 20mL의 용해성 용해 완충액(50mM의 NaH2PO4, 300mM의 NaCl, 10mM의 이미다졸, pH 8.0)에 200μL의 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF) 및 200μL의 라이소자임을 첨가하여 세포를 용해합니다. 5mL 피펫을 사용하여 박테리아 펠렛을 재현탁 한 다음 20 분 동안 30 % 전력으로 초음파 처리를 진행하십시오.
  5. 컬럼 부피의 5배에 해당하는 lysis 버퍼를 추가하여 니켈 컬럼을 평형화합니다. 이 과정을 두 번 반복하고 따로 보관하십시오.
  6. 8000 × g 에서 4 °C에서 15 분 동안 초음파 처리 된 박테리아 현탁액을 원심 분리하여 박테리아 상층액 용해액 (CL)을 얻는다.
  7. CL을 니켈 컬럼(단백질 흡착용)에 로드하여 관류(FT)를 얻습니다.
  8. 세척 버퍼의 컬럼 부피의 5배(NaH2PO4 50mM, NaCl 300mM, 이미다졸 20mM, pH 8.0)로 컬럼을 세척하여 세척 용리액(W1-W6)을 얻습니다.
  9. 1mL의 용리 완충액(50mMNaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 8.0)으로 컬럼을 세척하여 표적 단백질을 용리하고 단백질 분획(E1-E5)을 얻습니다.
  10. 각 분획(CL, FT, W1-W6 및 E1-E5)의 20μL 분취액을 취하고 Coomassie Brilliant Blue 염색과 함께 SDS-PAGE18 을 사용하여 분석합니다. PPARγ-LBD는 변성 겔에서 34.9kDa 단백질로 작동합니다.

3. 수용체 결합 분석

참고: 이 분석에서 C1-BODIPY-C12는 수용체-리간드 결합 시스템을 확립하기 위한 부위 특이적 형광 프로브로 사용되었습니다. PPARγ의 특정 리간드인 C1-BODIPY-C12는 C1 위치에서 지방산에 BODIPY 형광기가 통합된 지방산의 형광 유사체입니다.

  1. 정제된 human PPARγ-LBD를 Tris-HCl 완충액(Tris 20mM, NaCl 100mM, pH 8.0)에서 1nM - 6400nM의 농도 범위로 희석합니다. 또한 C1-BODIPY-C12 프로브를 Tris-HCl 버퍼에서 50nM의 농도로 희석합니다.
  2. 희석된 PPARγ-LBD 용액(웰당 55μL)과 C1-BODIPY-C12 프로브 용액(웰당 55μL)을 96웰 블랙 플레이트에 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  3. 마이크로플레이트 리더로 형광 편광(FP)을 측정합니다.
  4. 수용체 농도에 대한 FP 값을 표시하고, 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 Hill 기울기 방정식에 대한 특정 결합을 사용하여 곡선을 피팅하고, Kd 값을 계산합니다.

4. 경쟁력 있는 결합 분석

참고: 이 분석에서는 수용체 결합을 위해 800nM의 인간 PPARγ-LBD 및 50nM C1-BODIPY-C12 프로브를 사용했습니다. Rosiglitazone(Rosi), 트리페닐 포스페이트(TPHP) 및 과불화옥탄술폰산(PFOS)을 사용하여 프로브를 PPARγ에 결합하는 것과 경쟁했습니다.

  1. Tris-HCl 완충액의 세 가지 화합물을 0-200 μM의 농도 범위 내에서 희석합니다.
  2. 최종 농도가 800nM의 human PPARγ-LBD 및 50nM의 C1-BODIPY-C12 프로브로 수용체-프로브 결합 용액을 준비합니다.
  3. 수용체 프로브 결합 용액(웰당 55μL)과 복합 용액(웰당 55μL)을 96웰 블랙 플레이트에 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  4. 마이크로플레이트 리더로 형광 편광(FP)을 측정합니다.
  5. FP 값을 리간드 농도의 함수로 플로팅합니다. 그래프 작성 및 분석 소프트웨어로 처리된 시그모이드 모델을 사용하여 경쟁 곡선에서 각 리간드의 절반 최대 억제 농도(IC50)를 구합니다.

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결과

PPARγ-LBD의 단백질 발현 및 정제
PPARγ-LBD는 히스티딘 표지 단백질로서 BL21 (DE3)에서 이질학적으로 발현되었습니다. 단백질은 용해성 분획에서 검출되었고, 정제된 PPARγ-LBD는 단백질의 예측된 분자량과 일치하는 대략 34.9 kDa의 겉보기 분자량(그림 2)을 가진 SDS-PAGE에 단일 밴드를 보여주었습니다.

C 1-BODIPY-C12 프로브와 PPARγ-LBD의 결합
수용체 결합 분석법에서는 PPARγ-LBD에 결합할 수 있는 BODIPY 표지 지방산인 C1-BODIPY-C12를 형광 프로브로 사용하여 환경 오염 물질과 hPPARγ-LBD의 결합 효능을 연구했습니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 PPARγ-LBD가 첨가되면 형광 편광(F...

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토론

형광 편광(FP), 표면 플라즈몬 공명(SPR) 및 핵 자기 공명(NMR)은 단백질과 화합물19,20 사이의 직접 결합 상호 작용을 평가하는 데 사용되는 일반적인 기술입니다. FP는 약물 발견 및 화학 스크리닝을 위한 분자 상호 작용 조사에 널리 사용되어 왔습니다 21,22,23. 이에 비해 SPR 및 NMR 분석은 비용과 시간이 많이 소요되므로 고처리량 스크리닝(HTS) 응용 분야에 적합하지 않습니다. 이 프로토콜은 멀티웰 플레이트 검출 시스템을 통해 FP를 기반으로 하는 수용체-리간드 분석 방법을 설명하여 화학 물질의 HTS를 가능하게 합니다.

수...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 보조금 번호 82103875)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C1-BODIPY-C12 프로브Thermo Fisher Scientific, China102209-82-3PPARγ-LBD에 결합하고 형광을 방출합니다.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio, China6104-59-2단백질 밴드를 염색합니다.
GraphPad prismDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
imidazoleSolarbio, ChinaI8090단백질 정제 공정을 위한 완충액을 준비합니다.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosideSolarbio, China367-93-1PPARγ-LBD
Microplate readerBiotek, USASynergy H1 FP 값 감지
NaClShanghai Reagent7647-15-5단백질 정제 공정을 위한 완충액을 준비합니다.
NaH2PO4 · 2H2O상하이 시약13472-35-0단백질 정제 과정을 위한 완충액을 준비합니다.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences, 중국SA005005단백질 정제.
원산지 8.5 OriginLab, Northampton, MA, 미국
과불화옥탄술폰산(PFOS)J& K Scientific Ltd, China1763-23-1검출된 환경 오염 물질
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Solarbio, ChinaP0100단백질 분해를 억제합니다.
PPARγ-경쟁사 분석 키트Thermo Fisher ScientificPV6136
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136 PPARγ-LBD 리간드 스크리닝 분석 키트Cayman600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)aladdin, China122320-73-4PPAR&gamma의 작용제;
ShakerZHICHENG, 중국ZWY-211C박테리아 배양 확장 및 단백질 발현
유도 트리페닐 포스페이트(TPHP)맥클린, 중국T819317검출된 환경 오염 물질
TrisSolarbio, ChinaT8230단백질 정제 공정을 위한 완충액을 준비합니다.
TryptoneOXOID Limited, 중국LP0042B용원 육수(LB) 배지를 준비합니다.
초음파 세척기Kimberly, ChinaLHO-1박테리아를 파괴하여 완전한 용해
UreaSolarbio, ChinaU8020단백질 정제 과정을 위한 완충액을 준비합니다.
효모 추출물OXOID Limited, 중국LP0021B용해 성 육수 (LB) 매체를 준비합니다.
의 발현 유도

참고문헌

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