방법 논문

면역침윤분석을 통해 비알코올성 지방간 질환의 트롬보스폰딘 1을 확인하기 위한 의학적 의사결정 지원 플랫폼

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DOI:

10.3791/67328

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2024년 8월 30일

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1Department of Geriatric Cardiology, General Hospital of Southern Theater Command, 2Guangzhou Key Laboratory of Cardiac Rehabilitation, 3Branch of National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 4The First School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 5Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Cardiovascular Department/The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, 6Department of Electronics & Communication Engineering, Mepco Schlenk Engineering College, 7Department of Teleinformatics Engineering, Federal University of Ceará

이 논문에서

요약

본 연구는 동시 발현 유전자를 통해 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)과 심근경색(MI)의 관계를 조사하여 트롬보스폰딘 1(THBS1)을 바이오마커로 확인하였다. 면역 침투 분석은 CD8+ T 세포와 호중구가 핵심 인자로 밝혀졌으며, THBS1은 NAFLD 및 MI의 진단 도구로서 잠재력을 보여주었습니다.

초록

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)과 심근 경색(MI)은 유병률과 사망률이 높은 두 가지 주요 건강 부담입니다. 본 연구는 생물정보학 및 머신러닝을 이용하여 NAFLD와 MI의 관계를 이해하고 NAFLD 관련 MI의 잠재적으로 중요한 바이오마커를 식별하기 위해 동시 발현된 유전자를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 기능적 농축 분석을 수행하고, PPI(co-protein-protein interaction) 네트워크 다이어그램을 구성하고, SVM-RFE(vector machine-recursive feature elimination) 및 LASSO(least absolute shrinkage and selection operator) 기술을 사용하여 하나의 차등 발현 유전자(DEG), Thrombospondin 1(THBS1)을 식별했습니다. THBS1은 NAFLD 환자(AUC = 0.981)와 MI 환자(AUC = 0.900)를 구별하는 데 강력한 성능을 보였다. 면역 침투 분석에서 NAFLD 및 MI 환자에서 CD8+ T 세포가 현저히 낮고 호중구 수치가 높은 것으로 나타났습니다. CD8+ T 세포와 호중구는 NAFLD/MI를 건강한 대조군과 구별하는 데 효과적이었습니다. 상관관계 분석은 THBS1이 NAFLD 및 MI 환자에서 CCR(케모카인 수용체), MHC 클래스(주요 조직적합성 복합체 클래스), 호중구, parainflammation 및 Tfh(여포 도우미 T 세포)와 양의 상관관계를 보였으며 CD8+ T 세포, 세포 용해 활성 및 TIL(종양 침투 림프구)과 음의 상관관계를 보였습니다. THBS1은 건강한 대조군과 비교하여 NAFLD/MI를 진단하기 위한 새로운 바이오마커로 부상했습니다. 연구 결과는 CD8+ T 세포와 호중구가 NAFLD/MI 환자를 건강한 사람과 구별하기 위한 염증성 면역 기능으로 작용할 수 있음을 나타냅니다.

서론

비알코올성 지방간 질환(NAFLD)은 유병률이 25%-30%1인 주요 공중 보건 문제입니다. NAFLD의 유병률은 당뇨병2 환자에서 높은 것으로 보고되었습니다. 그러나 비당뇨병 환자에서 NAFLD의 중요성은 아직 명확하지 않습니다. 연구에 따르면 NAFLD는 죽상동맥경화증의 발병기전에 독립적인 역할을 한다고 합니다 3,4. 또한, 메타 분석에 따르면 NAFLD는 관상동맥 석회화, 내피 기능 장애 및 죽상동맥경화증과 밀접한 관련이 있으며, 독립적인 심혈관 위험 인자로 부상하고 있다5. NAFLD와 심혈관 질환 사이의 연관성은 여전히 추가 연구가 필요합니다.

심근경색(MI)은 건강을 위협하고 전 세계 환자와 그 가족에게 상당한 경제적 부담을 주는 치명적인 질병입니다6. MI는 또한 NAFLD 환자의 주요 사망 원인입니다. 영국 의학 저널(British Medical Journal)에 발표된 임상 연구에 따르면 NAFLD 환자의 심근경색 위험은 NAFLD가없는 환자보다 1.17배 더 높다고 7,8. 일부 연구에서는 염증, 산화 스트레스 및 지질 대사를 포함한 분자 경로가 NAFLD 관련 MI 9,10,11에 기여하는 것으로 확인되었습니다. 그러나 NAFLD와 MI를 연결하는 기본 메커니즘은 여전히 불분명합니다. NAFLD 및 MI의 예후와 관련된 새로운 바이오마커를 식별하는 것이 중요합니다.

광범위한 인구 집단에 영향을 미치는 NAFLD의 유병률 증가는 특히 당뇨병과의 연관성을 고려할 때 중요한 공중 보건 문제를 강조합니다. 그러나 NAFLD가 당뇨병이 없는 환자에게 미치는 영향은 여전히 잘 알려져 있지 않습니다. NAFLD는 죽상동맥경화증의 발병기전과 관련이 있으며 관상동맥 석회화, 내피 기능 장애 및 죽상동맥경화증과 밀접한 관련이 있는 독립적인 심혈관 위험 인자로 인식되고 있습니다. 이러한 연관성에도 불구하고, NAFLD와 심근경색(MI)과 같은 심혈관 질환을 연결하는 정확한 메커니즘은 추가적인 규명이 필요합니다. MI는 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중 하나이며 상당한 경제적 부담을 안겨줍니다. NAFLD 환자의 MI 위험은 NAFLD가 없는 환자보다 현저히 높으며, 이는 이러한 상태를 연결하는 분자 경로에 대한 더 깊은 이해의 필요성을 강조합니다. 염증, 산화 스트레스 및 지질 대사가 원인으로 제시되었지만 정확한 메커니즘은 불분명합니다. NAFLD 관련 MI의 예후 및 관리에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 새로운 바이오마커를 시급히 식별해야 합니다.

결과적으로 본 연구에서는 NAFLD와 MI 간의 차등 발현 유전자(DEG)의 상호 작용을 식별하고 분석하기 위해 NCBI-GEO(National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus, 재료 표 참조)에서 NAFLD 및 MI에 대한 RNA 마이크로어레이 데이터 세트를 다운로드했습니다.농축 분석, 단백질-단백질 상호 작용(PPI) 네트워크 다이어그램 구성, 벡터 기계 재귀 기능 제거(SVM-RFE) 지원, 허브 유전자 12,13,14,15,16,17,18,19를 식별하기 위해 최소 절대 수축 및 선택 연산자(LASSO) 알고리즘을 사용했습니다. NAFLD 및 MI 환자의 면역 세포를 검사하기 위해 면역 침윤 분석을 수행했습니다. 궁극적으로 이러한 방법은 NAFLD와 MI 사이의 관계를 밝히기 위해 통합되었습니다. 그림 1은 이 연구에서 따랐던 설계 순서를 보여줍니다. 본 연구는 생물정보학, 머신러닝, 면역침투분석을 결합하여 새로운 의학적 의사결정 지원 플랫폼 개발에 기여하고자 한다.

이 논문의 주요 기여는 다음과 같습니다: (1) 동시 발현 유전자 식별: 이 연구는 동시 발현 유전자를 식별하여 NAFLD와 MI 간의 관계를 강조하고 이 두 상태 사이의 분자 연결에 대한 더 깊은 이해를 제공합니다. (2) 생물정보학 및 기계 학습의 응용: SVM-RFE(support vector machine-recursive feature removal)17 및 LASSO(least absolute shrinkage and selection operator)19를 포함한 생물정보학 및 기계 학습 기술을 사용하여 이 연구는 THBS1을 차등적으로 발현된 유전자로 식별합니다. THBS1은 NAFLD 및 MI 환자를 건강한 대조군과 구별하는 데 높은 성능을 보여줍니다. (3) 면역 침윤 분석: 이 연구는 면역 침윤 분석을 수행하여 NAFLD 및 MI 환자에서 CD8+ T 세포 수치가 현저히 낮고 호중구 수치가 높은 것을 밝혔습니다.(4) 상관 관계 분석: 이 연구는 THBS1이 CCR(케모카인 수용체), MHC 클래스 I(주요 조직 적합성 복합체 클래스 I), 호중구, parainflammation, 및 Tfh (follicular helper T) 세포. 이는 CD8+ T 세포, 세포 용해 활성 및 종양 침윤 림프구(TIL)와 음의 상관관계가 있습니다.

프로토콜

사용된 데이터베이스, 웹링크 및 소프트웨어/패키지에 대한 자세한 내용은 Table of Materials에 나열되어 있습니다. 사용된 시뮬레이션 매개변수는 표 1에 나와 있습니다.

1. RNA 마이크로어레이 데이터 세트 얻기

  1. NCBI-GEO 데이터베이스에서 심근경색(MI) 데이터셋 GSE66360을 다운로드합니다.
  2. NCBI-GEO 데이터베이스에서 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 데이터셋 GSE89632를 다운로드합니다.
  3. 다운로드한 데이터 세트에 49개의 MI 샘플, GSE66360에 대한 50개의 정상 대조군, 39개의 NAFLD 샘플 및 GSE89632에 대한 24개의 정상 대조군이 포함되어 있는지 확인합니다.

2. DEG의 식별

  1. 데이터 전처리 및 DEG 식별
    1. 적절한 R 함수를 사용하여 데이터 세트를 RStudio 에 로드합니다.
    2. R 패키지 limma를 사용하여 P < 0.05P 및 | log FC | > 1.5 임계값을 가진 DEG12를 식별합니다.
    3. R 패키지 pheatmap, ggplot2 및 Venn 을 사용하여 DEG 시각화를 위한 히트맵 및 Venn 다이어그램을 생성합니다.
  2. 시각화 만들기
    1. pheatmap을 사용하여 DEG의 히트맵을 생성합니다.
    2. ggplot2를 사용하여 NAFLD와 MI 간의 DEG 중첩을 보여주는 벤 다이어그램을 만듭니다.

3. 농축 분석

  1. GO, KEGG 및 DO 농축 분석 수행
    1. DEG를 R 패키지 clusterProfiler13에 로드합니다.
    2. 유전자 온톨로지(GO) 농축 분석을 수행하여 DEG를 분자 기능, 생물학적 과정 및 세포 구성 요소로 분류합니다.
    3. KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 경로 분석을 수행하여 DEG를 생화학적 경로에 매핑합니다.
    4. 질병 온톨로지(DO) 농축 분석을 사용하여 DEG를 특정 임상 상태에 연결합니다.

4. PPI 네트워크 구축을 통한 PPI 분석

  1. STRING 온라인 플랫폼14를 사용하여 신뢰도 점수가 0.4인 co-DEG의 PPI(protein-protein interaction) 네트워크 다이어그램을 구축할 수 있습니다.
  2. Cytoscape15를 사용하여 PPI 신경망을 시각화합니다.

5. 머신러닝 알고리즘 적용을 통한 후보 허브 DEG 스크리닝

  1. RStudio에서 SVM-RFE(Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination) 및 LASSO(Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) 회귀 알고리즘을 사용하여 가장 관련성이 높은 DEG 16,17,18을 선택합니다.
  2. SVM-RFE는 특징의 순위를 매기고 반복적으로 제거하는 반면, LASSO 회귀19 는 정규화를 적용하여 희소 DEG 집합을 식별합니다.

6. 진단 성능 평가를 위한 ROC 곡선 구성

  1. RStudio를 사용하여 ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석수행 20.
  2. 중요한 co-DEG에 대한 곡선 아래 면적(AUC)을 계산합니다.

7. 면역 침투를 탐색하기 위한 면역 침투 분석

  1. R 패키지 GSVA 및 GSEABase 를 사용하여 단일 샘플 유전자 세트 농축 분석(ssGSEA)을 수행하여 NAFLD 및 MI21의 면역 침투를 분석합니다.
  2. NAFLD 및 MI 샘플과 건강한 대조군 간의 면역 세포 유형의 상대적 풍부도를 비교합니다.

8. 통계 분석

  1. RStudio에서 모든 통계 분석을 수행합니다.
  2. Pearson 상관 분석을 적용하여 유전자 공동 발현 패턴을 조사합니다.
  3. P < 0.05로 통계적 유의성을 보장합니다.
    참고: 프로토콜을 시작하기 전에 모든 소프트웨어 및 R 패키지가 올바르게 설치되고 최신 버전으로 업데이트되었는지 확인합니다.

결과

제안된 연구의 주요 결과는 NAFLD 및 MI의 기저에 있는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 수행된 다양한 분석을 포함하여 여기에 제시되어 있습니다.

DEG 식별
GSE89632 데이터 세트에서는 76개의 상향 조절 유전자와 20개의 하향 조절 유전자가 NAFLD-DEG로 확인되었으며(그림 2B,D), GSE66360 데이터 세트에서는 118개의 상향 조절 유전자와 8개의 하향 조절 유전자가 MI-DEG로 확인되었습니다(그림 2C,E). 그 후, NAFLD-DEG와 MI-DEG 사이의 중첩에서 co-DEG가 파생되어 co-DEG 중에서 13개의 상향 조절 DEG와 1개의 하향 조절 DEG를 식별했습니다(그림 2A).

NAFLD 및 MI에 고유한 DEG와 두 질환 모두에 공통적인 DEG를 식별하면 이러한 질병의 기저에 있는 분자 과정에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 두 질환과 관련된 뚜렷하고 공유된 유전자 발현 패턴을 이해하면 NAFLD 및 MI의 병태생리학을 명확히 하는 데 도움이 되며 치료 개입을 위한 잠재적인 분자 표적을 식별할 수 있습니다. co-DEG에 대한 추가 조사를 통해 이 두 질환 간의 상호 작용에 필수적인 중요한 조절 인자 또는 경로를 밝힐 수 있으며, NAFLD 및 MI와 관련된 부정적인 건강 결과를 완화하는 것을 목표로 하는 표적 치료법의 개발을 촉진할 수 있습니다.

농축 분석
GO 분석에 따르면 NAFLD DEG는 주로 지방 세포 분화, 지질다당류에 대한 반응 및 다세포 유기체 과정과 같은 생물학적 과정(BP)에서 풍부< 것으로 나타났습니다(p 0.05, 그림 3A). 세포 성분(CC)의 경우, NAFLD DEG는 주로 포스파티딜이노시톨 3-키나아제 복합체, 분비 과립 내강 및 세포질 소포 내강과 관련이 있었습니다(p < 0.05, 그림 3A). 분자 기능(MF) 측면에서 주요 활성에는 포스파티딜이노시톨-3-키나아제 조절자 활성, DNA 결합 전사 활성제 활성(RNA 중합효소 특이적) 및 일반적인 DNA 결합 전사 활성제 활성이 포함되었습니다(p < 0.05, 그림 3A).

MI-DEG의 경우, BP 분석은 백혈구 화학주성, 골수성 백혈구 활성화 및 세포 화학주성의 농축을 보여주었습니다(p < 0.05, 그림 3B). CC 분석은 3차 과립, 피콜린-1이 풍부한 과립 및 분비 과립 내강(p < 0.05, 그림 3B)의 농축을 강조했습니다. MF 분석은 패턴 인식 수용체 활성, RAGE 수용체 결합 및 면역 수용체 활성의 풍부함을 보여주었습니다(p < 0.05, 그림 3B).

KEGG 농축 분석은 NAFLD-DEG가 IL-17, AGE-RAGE, TNF, 파골세포 분화, 말라리아, 류마티스 관절염, 샤가스병 및 JAK-STAT 신호 전달 경로에서 유의하게 농축된 것으로 나타났습니다(p < 0.05, 그림 3C). MI-DEG는 IL-17, TNF, 지질 대사 및 죽상동맥경화증, 톨 유사 수용체 신호전달, C형 렉틴 수용체 신호전달, 레지오넬라증, 류마티스 관절염 및 NF-κB 신호전달 경로에서 풍부했습니다(p < 0.05, 그림 3D). 질병 온톨로지(DO) 농축 분석은 NAFLD와 MI 모두에 대한 상위 3개 DEG가 죽상동맥경화증, 동맥경화성 심혈관 질환 및 동맥경화증과 유의한 관련이 있음을 보여주었습니다(p < 0.05, 그림 3E-F).

PPI 네트워크 다이어그램 분석
NAFLD에 대한 PPI 네트워크 다이어그램에서 92개의 노드와 250개의 가장자리가 확인되었으며, 이는 이 상태와 관련된 단백질 간의 복잡한 상호 작용 네트워크를 반영합니다. 마찬가지로, MI에 대한 PPI 네트워크 다이어그램은 117개의 노드와 587개의 가장자리를 보여주었으며, 이는 심근 경색의 분자 지형의 보다 복잡한 네트워크 특성을 나타냅니다. 또한 co-DEG에 대한 PPI 네트워크 다이어그램은 14개의 노드와 21개의 가장자리를 식별하여 NAFLD와 MI 간에 공유되는 단백질 간의 잠재적인 주요 상호 작용을 강조합니다(그림 4A-F).

PPI 네트워크는 치료 표적을 구성 및 분석하는 데 유용하며 NAFLD 및 MI의 기저에 있는 분자 연결에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. NAFLD 및 MI에서 관찰된 고유한 네트워크 토폴로지는 이러한 질병과 관련된 고유한 병태생리학적 메커니즘을 강조합니다. 더욱이, co-DEG 간의 공유 연결의 발견은 MI와 NAFLD 간의 상호 작용을 중재하는 잠재적인 공유 경로 또는 조절 네트워크를 시사합니다. 이러한 연결에 대한 추가 연구를 통해 중재 및 치료법 개발을 위한 새로운 분자 표적을 밝힐 수 있으며, 잠재적으로 이러한 복잡한 질병에 대한 새로운 치료 옵션을 제공할 수 있습니다.

후보 허브 DEG 스크리닝
SVM-RFE 알고리즘17을 사용하여 잠재적인 중요한 DEG를 스크리닝하여 GSE89632에서 6개의 유전자와 GSE66360에서 4개의 유전자를 식별했습니다(그림 5A, B). 마찬가지로, LASSO 알고리즘19를 사용하여 후보 결정적 DEG를 식별하여 GSE89632에서 4개의 유전자를, GSE66360에서 5개의 유전자를 산출했습니다(그림 5C,D). 특히, Venn 다이어그램은 SVM-RFE, LASSO 및 co-PPI 네트워크 분석으로 식별된 허브 DEG(THBS1)의 교차점을 묘사하여 NAFLD 및 MI 발병 기전 모두에서 그 중요성을 강조했습니다(그림 5F).

이러한 고급 머신 러닝 알고리즘은 MI 및 NAFLD와 관련된 주요 DEG를 식별하기 위한 강력한 프레임워크를 제공하고 치료 또는 진단 대상으로서의 잠재력에 대한 귀중한 통찰력을 제공했습니다. 여러 분석 기술을 통해 THBS1을 허브 유전자로 식별한 것은 두 질병의 기저에 있는 분자 경로에서 THBS1의 중요성을 강조합니다. THBS1의 기능적 중요성과 co-PPI 네트워크 내 상호 작용에 대한 추가 연구는 NAFLD와 MI를 연결하는 새로운 메커니즘을 규명할 수 있으며, 잠재적으로 표적 치료 및 정밀 의학 전략을 위한 길을 열 수 있습니다.

단일 허브 DEG의 진단 값
NAFLD 및 MI 데이터 세트 모두에서 식별된 허브 DEG의 진단 효율성을 평가하기 위해 ROC 분석을 수행했습니다. 그림 6A,B에서 볼 수 있듯이, THBS1은 NAFLD 환자에서 AUC가 0.981(95% CI: 0.949-1.000), MI 환자에서 0.900(95% CI: 0.834-0.956)으로 높은 변별력을 보였습니다. THBS1이 진단용 바이오마커로서 우수한 성능을 발휘한다는 것은 NAFLD, MI 및 건강한 대조군을 구별하는 데 잠재적으로 유용하다는 점을 강조합니다.

이러한 결과는 THBS1이 질병 상태에 대한 귀중한 지표 역할을 할 수 있음을 시사하며, 임상의에게 위험 평가 및 조기 식별을 위한 유용한 도구를 제공할 수 있습니다. THBS1을 임상 실습에 쉽게 통합하고 환자 치료 및 관리를 개선하기 위해서는 다양한 환자 집단 및 임상 환경에서 진단 정확도를 확인하기 위한 추가 검증 연구가 필요합니다.

면역 침투 분석
ssGSEA는 NAFLD/MI와 대조군(CON) 사이의 29개의 면역 관련 유전자를 분석하기 위해 수행되었습니다. CON 그룹과 비교했을 때, NAFLD 및 MI 그룹에서 면역 세포 침투가 유의하게 증가했으며, 특히 CCR, MHC 클래스 I, 호중구, 부염증 및 Tfh 세포에서 그러했습니다(p < 0.05, 그림 7A,B). 반대로, 면역 세포 침투는 CON 그룹에 비해 NAFLD 및 MI 그룹에서 특히 CD8+ T 세포, 세포 용해 활성 및 종양 침윤 림프구(TIL)에서 현저하게 감소했습니다(p < 0.05, 그림 7C,D).

이러한 결과는 NAFLD와 MI 모두에서 면역 세포 침투의 조절 장애를 시사하며, 이러한 상태와 관련된 복잡한 면역학적 환경을 강조합니다. 관찰된 면역 세포 구성의 변화는 이러한 질병의 발병 및 병태생리학의 기저에 있는 면역학적 과정에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 이러한 면역 특성에 대한 더 깊은 이해는 중재를 위한 새로운 치료 표적을 밝히고 NAFLD 및 MI 환자의 면역학적 프로필을 기반으로 한 개별화된 치료 계획의 개발을 지원할 수 있습니다.

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그림 1: THBS1을 식별하기 위한 의료 의사결정 지원 시스템의 설계 순서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 벤 다이어그램, 화산 다이어그램 및 히트 맵. (A) GSE89632 및 GSE66360에 대한 벤 다이어그램. (B) GSE89632에서 차등적으로 발현된 유전자(DEG)의 화산 다이어그램. (C) GSE66360의 DEG의 화산 다이어그램. (D) GSE89632 단위의 DEG의 히트 맵 다이어그램. (E) GSE66360 DEG의 히트 맵 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 차등적으로 발현된 유전자(DEG)의 농축 분석. (A) 상위 5개 NALFD-DEG는 생물학적 과정(BP), 세포 구성 요소(CC) 및 분자 기능(MF)에서 유전자 온톨로지(GO)를 강화했습니다. (B) 상위 5개 MI-DEG는 BP, CC 및 MF에서 GO를 강화했습니다. (C) 상위 8개의 NALFD-DEG는 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 신호 전달 경로를 풍부하게 했습니다. (D) 상위 8개의 MI-DEG는 KEGG 신호 경로를 풍부하게 했습니다. (E) 상위 5개 NALFD-DEG는 질병 온톨로지(DO)를 강화했습니다. (F) 상위 5개 MI-DEG는 DO를 강화했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 단백질-단백질 상호 작용(PPI) 네트워크 다이어그램. (A) String 온라인 플랫폼에서 얻은 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 PPI 네트워크 다이어그램. (B) Cytoscape에서 얻은 NAFLD의 PPI 네트워크 다이어그램. (C) String 온라인 플랫폼에서 얻은 심근 경색(MI)의 PPI 네트워크 다이어그램. (D) Cytoscape를 획득한 MI의 PPI 네트워크 다이어그램. (E) 단백질 상호 작용의 PPI 네트워크 다이어그램. (F) IL1B 및 FOS의 PPI 네트워크 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 후보 허브 DEG 스크리닝. (A) NAFLD에서 SVM-RFE에 의해 얻어진 6개의 중요한 DEG. (B) 심근경색(MI)에서 SVM-RFE에 의해 얻어진 4가지 중요한 DEG. (C) NAFLD에서 LASSO에 의해 얻어진 4개의 중요한 DEG. (D) MI에서 LASSO에 의해 얻어진 5개의 중요한 DEG. (E) 위에서 얻은 하나의 DEG만 벤 다이어그램에 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 하나의 허브 차등 발현 유전자(DEG)의 진단 값. (A) NAFLD의 ROC 곡선. (B) MI의 ROC 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 및 심근경색(MI)에서 침투 면역 세포의 분포 및 THBS1과 침투 면역 세포 간의 상관관계. (A) NAFLD에서 침투 면역 세포의 분포. (B) MI에서 침투 면역 세포의 분포.(C) NAFLD에서 THBS1과 침투 면역 세포의 상관 관계. (D) THBS1과 MI에서 침투 면역 세포 사이의 상관관계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

약어명명법
증권 시세 표시기곡선 아래 영역(Area Under Curve)
혈압생물학적 과정
참조셀룰러 구성 요소
전과자컨트롤
도그차등적으로 발현된 유전자
하다질병 온톨로지
바둑유전자 온톨로지
케그교토 유전자와 게놈 백과사전
올가미최소 절대 수축 및 선택 연산자
금세분자 기능
미심근경색
나플드비알코올성 지방간 질환
PPI단백질-단백질 상호 작용
중화민국수신기 연산자 특성 곡선
ss지씨아단일 시료 유전자 세트 농축 분석
SVM-RFE(증권 시세 표시기)Vector Machine-Recursive Feature Elimination 지원
바트1트롬보스폰딘 1

표 1: 실험에 사용된 시뮬레이션 매개변수.

토론

이 연구에서 설명한 방법은 NAFLD 및 MI의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 연구에 중요한 의미를 갖습니다. THBS1과 같은 주요 바이오마커를 확인함으로써 제안된 프로토콜은 진단 및 치료 개입 모두에 대한 잠재적 표적을 제공합니다. 이 접근법은 여러 경로 및 면역 반응을 포함하는 다른 복잡한 질병으로 확장될 수 있어 새로운 바이오마커 및 치료 표적의 발견을 촉진할 수 있습니다. 또한 생물정보학과 기계 학습 기술의 통합은 개별 분자 프로필을 기반으로 한 맞춤형 치료 전략을 가능하게 하는 맞춤형 의학을 위한 다양한 프레임워크를 제공합니다. 이 방법은 또한 임상 환경에서 사용하도록 조정하여 진단 정확도를 높이고 표적 중재를 통해 환자 결과를 개선할 수 있습니다.

NAFLD와 심근경색(MI)은 유병률과 사망률이 높은 두 가지 주요 건강 부담입니다. NAFLD는 간에 지질이 축적되는 것이 특징입니다1. NAFLD가 심장의 구조적 무결성뿐만 아니라 심장 기능에도 부정적인 영향을 미친다는 증거가 증가하고 있으며, 특히 MI 22,23,24의 맥락에서 그러하다. 또한, NAFLD와 죽상동맥경화증 사이에 강한 상관관계가 있음을 나타내는 강력한 증거가 있습니다. 연구에 따르면 비당뇨병성 MI 환자에서 NAFLD의 유병률과 중증도는 관상동맥질환과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다25. 중등도에서 중증의 NAFLD는 독립적인 위험 인자로 나타나 다발성 관상동맥 병변의 위험을 3배 증가시킨다4. 그러나 이러한 연구는 주로 NAFLD와 MI에 초점을 맞추고 있어 NAFLD와 죽상동맥경화증 사이의 연관성에 대한 기본 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 따라서 NAFLD 관련 MI를 예방하기 위해 이러한 메커니즘을 탐색하는 것이 중요합니다.

이 연구에서는 NCBI-GEO에서 두 개의 데이터 세트를 얻었습니다. 분석 결과 NAFLD와 MI 사이에 13개의 상향 조절된 DEG와 1개의 하향 조절된 DEG가 밝혀졌습니다.기능 강화 분석을 수행하고, co-PPI 네트워크 다이어그램을 구성하고, 허브 DEG를 식별하기 위해 두 개의 기계 학습 알고리즘을 사용했습니다. 그 결과, THBS1은 NAFLD와 MI 모두에 대해 뛰어난 진단 효율을 가진 새로운 바이오마커로 확인되었습니다. SVM(Support Vector Machine)은 분류 및 회귀 분석에 널리 사용되는 지도 기계 학습 기법입니다17. RFE(Recursive Feature Elimination)는 샘플에서 가장 중요한 유전자를 선택하는 데 도움이 됩니다. LASSO 회귀 알고리즘(19 )은 예측 정확도를 향상시키기 위해 정규화를 적용한다. 이러한 알고리즘을 co-DEG와 결합하여 최적의 DEG를 스크리닝할 수 있었습니다.

두 가지 머신 러닝 알고리즘과 co-DEG를 사용한 분석을 기반으로 Thrombospondin 1(THBS1 또는 TSP1)이 주요 진단 허브 DEG로 확인되었습니다. THBS1은 세포외 기질 단백질의 구성원이며 트롬빈 자극에 대한 반응으로 혈소판에서 처음 검출되었습니다26. 내피 세포, 간 성상 세포 및 평활근 세포를 포함한 다양한 세포는 THBS1을 생산하여 세포 외 공간으로 분비할 수 있습니다 27,28,29. THBS1은 알려진 리간드30인 CD36과 상호 작용하고 CD3629,31을 조절하여 항혈관신생 효과를 발휘하여 심혈관 질환에서 중요한 역할을 강조합니다. 또한 THBS1은 CD47, 형질전환 성장 인자 β 및 인테그린과 같은 수용체 및 단백질과의 상호 작용을 통해 혈관 신생 및 혈소판 응집을 조절할 수 있습니다32. 이는 THBS1이 MI 33,34,35 동안 혈전 형성, 취약한 플라크 파열 및 후속 심실 리모델링에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.

또한, NAFLD 발병은 순환 중인 분비 단백질의 합성과 밀접한 관련이 있습니다. 이바이오메디슨(EBioMedicine)에 발표된 주요 연구에서는 분비 단백질인 THBS1이 NAFLD의 새로운 바이오마커 역할을 할 수 있음을 입증했습니다. 이 연구는 또한 외인성 THBS1 투여가 지질 합성 경로를 억제하여 간 지질 침착을 개선한다는 것을 발견했습니다36. 특히, CD36은 NAFLD에 대한 THBS1의 효과에 대한 핵심 수용체로 확인되었습니다. 또한 THBS1의 펩타이드 유사체인 ABT-526은 간세포에서 지질 합성을 억제하는 것으로 나타났습니다. 이러한 발견은 NAFLD의 진단 및 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 THBS1이 NAFLD와 MI 모두에 대한 새로운 바이오마커가 될 수 있음을 시사하여 빠르고 간단하며 접근 가능한 진단 도구를 제공합니다.

최근의 증거는 NAFLD 및 MI의 진행에서 면역 염증 반응의 중요한 역할을 강조합니다.주요 특징으로는 사이토카인 발현, 면역 조절 및 신경내분비계 활성화가 있습니다. Wabitsch 등은 메트포르민이 NAFLD 마우스에서 CD8+ T 세포의 발현을 억제함으로써 간 보호를 제공한다는 것을 입증했다37. Dolejsi 등은 CD8+ T 세포의 감소와 심근 복구 능력의 현저한 감소를 보고했다38. Qin 등은 전신 면역 염증 지수의 일부인 호중구가 NAFLD 환자의 소변 알부민 배설과 관련이 있음을 발견했다39. Zhang 등은 호중구 침투 및 탈과립이 MI27 동안 손상 및 회복 과정 모두에 관여한다고 밝혔습니다.

이러한 연구 결과와 일치하여, 본 연구 결과는 건강한 대조군에 비해 NAFLD 및 MI 환자에서 CD8+ T 세포, 세포 용해 활성 및 TIL이 감소한 반면, CCR, MHC 클래스 I, 호중구, 파라염증 및 Tfh 세포의 침투가 증가한 것으로 나타났습니다. 또한, 상관 관계 분석은 THBS1이 CCR, MHC 클래스 I, 호중구, parainflammation 및 Tfh 세포와 양의 상관관계를 보였으며 NAFLD 및 MI 환자에서 CD8+ T 세포, 세포 용해 활성 및 TIL과 음의 상관관계를 보였다. 이러한 관찰은 THBS1이 NAFLD 및 MI의 발달 및 진행 중에 CD8+ T 세포, 세포 용해 활성 및 TIL을 감소시키는 동시에 CCR, MHC 클래스 I, 호중구, 소염증 및 Tfh 세포를 증가시켜 면역 반응의 조절에 기여할 수 있음을 시사합니다. 그러나 이러한 추측은 이러한 과정에서 THBS1의 정확한 역할을 확인하기 위해 추가 조사를 필요로 합니다.

이 연구는 포괄적인 생물정보학 및 기계 학습 접근 방식을 사용하여 NAFLD와 MI 사이의 분자 연결을 밝히는 것을 목표로 했습니다. 그 결과, NAFLD에서 96개의 차등 발현 유전자(DEG)와 MI에서 126개의 차등 발현 유전자(DEG)가 확인되었으며, 두 질환 사이에 14개의 DEG가 겹쳤습니다. 기능 강화 분석을 통해 이러한 DEG는 지방 세포 분화, 백혈구 화학주성 및 IL-17, TNF 및 NF-κB를 포함한 다양한 신호 경로와 같은 중요한 생물학적 과정 및 경로에 관여하는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 NAFLD와 MI에서 염증 및 대사 경로의 복잡한 상호 작용을 강조합니다. 기계 학습 분석(SVM-RFE 및 LASSO)과 결합된 단백질-단백질 상호 작용(PPI) 네트워크 다이어그램의 구성을 통해 THBS1을 핵심 허브 유전자로 식별했습니다. THBS1은 NAFLD의 경우 0.981, MI의 경우 0.900의 곡선 아래 면적(AUC)으로 우수한 진단 성능을 보여주었으며, 이는 두 질환 모두에 대한 강력한 바이오마커로서의 잠재력을 시사합니다.

또한, 면역 침윤 분석을 통해 NAFLD 및 MI 환자에서 건강한 대조군과 비교하여 뚜렷한 면역 세포 프로필이 밝혀졌습니다. 구체적으로, NAFLD 및 MI 환자는 CCR, MHC class I, 호중구, parainflammation 및 Tfh 세포의 침투가 증가한 반면 CD8+ T 세포, 세포 용해 활성 및 TIL 수준은 감소했습니다. 이러한 면역 특징은 두 질환의 염증 특성을 강조하고 면역 반응을 조절하는 THBS1의 역할을 강조합니다.

이 연구는 THBS1이 진단을 위한 새로운 바이오마커이자 잠재적인 치료 표적으로 부상하면서 NAFLD와 MI의 기저에 있는 공유 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다. 이 연구 결과는 이러한 상호 연결된 상태를 가진 환자를 위한 표적 중재 및 맞춤형 치료 전략에 대한 향후 연구를 위한 길을 열어줍니다. 이 연구는 생물정보학, 머신 러닝 및 면역 침투 분석을 통합함으로써 NAFLD 및 MI의 임상 관리를 개선하기 위한 의료 의사 결정 지원 플랫폼 개발에 기여합니다.

감사의 글

본 연구는 중국국립자연과학재단(No. 62271511, U21A200949), 남방극장사령부 종합병원 유차이재단(2022NZC011), 광저우과학기술프로그램프로젝트(2023A03J0170), 국립노인임상연구센터(NCRCG-PLAGH-2023006), 광둥성 기초 및 응용기초연구재단(No.2020A1515010288, No.2021A1515220101)의 지원을 받았다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CytoscapeCytoscape Consortium버전 3.6.1PPI(단백질-단백질 상호 작용) 네트워크
MI 데이터 세트 GSE66360(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)NCBI-GEO 데이터베이스 -분석을 위한 RNA 마이크로어레이 데이터 세트 수집
R 패키지clusterProfilerBioconductor -GO, KEGG 및 DO 농축 분석에 사용
R 패키지ggplot2CRAN&nbsp;-벤 다이어그램 및 기타 시각화 생성에 사용
R 패키지GSEABaseBioconductor -유전자 세트 농축 분석을 위해 GSVA와 함께 사용
R 패키지GSVABioconductor -단일 샘플 유전자 세트 농축 분석(ssGSEA)에 사용R
패키지limmaBioconductor -차등 발현 유전자(DEG)를 식별하는 데 사용됩니다.
R 패키지 pheatmapCRAN -히트맵 생성에 사용됨
R 패키지 vennCRAN -벤 다이어그램 RNA
마이크로어레이 데이터 세트 생성에 사용(GSE66360, GSE89632)NCBI-GEO  -RStudio 분석에 사용되는 공개적으로 사용 가능한 RNA 마이크로어레이 데이터 세트
RStudio, PBC버전 1.4.1717
String 데이터베이스STRING (www.string-db.org/) -PPI 네트워크 구축을 위한 온라인 도구를 위한 통합 개발 환경
을 시각화하는 데 사용됩니다. R

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