Method Article

비색 분석을 통한 엘라스타제 효소 활성의 조절 정량화

DOI:

10.3791/67331

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Research, Development and Innovation in Health Biotechnology of Elche (IDiBE), Miguel Hernández University (UMH), 2CIBER, Pathophysiology of Obesity and Nutrition, CIBERobn, Carlos III Health Institute (CB12/03/30038)

In This Article

Summary

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이 프로토콜은 엘라스타제 활성을 억제하거나 활성화하는 화합물의 능력을 결정하기 위한 비색 분석 방법의 개발을 설명합니다.

Abstract

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세린 프로테아제인 엘라스타제는 엘라스틴 분해에 필수적인 역할을 합니다. 엘라스틴은 폐, 피부, 혈관의 조직 탄력을 유지하는 데 도움이 되는 세포외 단백질입니다. 엘라스타제 활성의 엄격한 조절은 조직 항상성에 매우 중요한데, 조절 장애는 폐기종, 주름 및 죽상동맥경화증과 같은 병리학에 기여할 수 있기 때문입니다. 자연적으로 발생하는 파이토케미컬(phytochemicals)과 같은 일부 화합물은 치료적 개입의 잠재력을 보여주었고 상당한 관심을 끌었습니다. 억제성 또는 자극성 여부에 관계없이 엘라스타제에 대한 다양한 화합물의 조절 효과를 규명하는 것은 엘라스타제 관련 질환을 대상으로 하는 새로운 치료 및 미용 전략을 개발하는 데 중요합니다. 엘라스타제 활성을 측정하기 위해 널리 사용되는 방법은 비색 엘라스타제 분석입니다. 이 분석에서는 특정 기질을 사용하여 엘라스타아제를 분해하여 검출 가능한 노란색 화합물인 p-니트로아닐린(pNA)을 방출합니다. 생성된 pNA의 양은 샘플의 엘라스타제 활성을 반영하며 비색계로 측정할 수 있습니다. 이 분석은 단순성, 높은 감도, 빠른 결과 및 다양한 연구 요구에 대한 적응성을 포함한 여러 가지 이점을 제공합니다. 비색 엘라스타제 분석은 화합물이 엘라스타제 활성에 미치는 영향을 연구하는 데 유용한 도구로 남아 있습니다. 사용 편의성과 효과로 인해 이 분석법은 이 분야 연구의 초석입니다.

Introduction

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엘라스타제는 폐, 피부, 혈관 등 신체의 다양한 조직에 탄력을 제공하는 단백질인 엘라스틴을 분해하는 데 중요한 역할을 하는 세린 프로테아제 효소입니다. 엘라스타제 활성은 조직의 항상성을 유지하기 위해 엄격하게 조절되며, 조절 장애는 폐기종, 죽상동맥경화증, 피부 주름과 같은 병리학적 및 피부 질환을 유발할 수 있습니다1.

엘라스타제에는 여러 유형이 있으며 각각 특정 특성과 기능을 가지고 있습니다. 호중구에 의해 생성되는 호중구 엘라스타제는 면역 반응과 염증에 중요한 역할을 합니다. 이러한 효소는 다양한 세포외 단백질을 분해할 수 있으며 만성 염증성 질환에 관여합니다2. 반면에 췌장 엘라스타제는 소장에서 단백질 소화에 중요한 역할을 한다3. 이러한 엘라스타제를 구별하는 것은 다양한 질병에 대한 특정 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다.

건강한 수준의 엘라스틴과 엘라스타아제 활성을 조절하는 경로는 피부의 탄력을 보존하고 조기 노화를 예방하는 데 도움이 됩니다. 노화, 자외선, 염증, 유전적 소인, 환경 오염 ....

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Protocol

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이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 0.2M Tris 염기 반응 완충액 (RB)의 제조

  1. 분석 저울을 사용하여 해당 Tris 염기의 무게를 측정합니다.
  2. Tris 베이스를 비커로 옮기고 눈금이 매겨진 실린더를 사용하여 탈이온수를 추가합니다.
  3. Tris 베이스가 완전히 용해될 때까지 자석 교반기로 용액을 저어줍니다.
  4. 4N HCl을 적가하여 pH를 8.0으로 조정합니다. pH 측정기를 사용하여 pH를 모니터링하십시오.
  5. 원하는 pH에 도달하면 용액을 부피 플라스크로 옮기고 탈이온수로 원하는 부피 표시까지 채웁니다.
  6. 버퍼를 라벨이 부착된 보관 병에 옮기고 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오.

2. 시료 전처리

  1. 분석 저울을 사용하여 필요한 양의 샘플을 정확하게 칭량합니다. 이 연구에서는 각 샘플의 1mg으로 충분합니다.
  2. RB의 샘플을 원하는 농도로 용해....

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Results

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프로토콜이 완료되면 관련 계산을 수행하고 엘라스타제 활성을 조절하기 위한 샘플의 용량을 정량화하는 데 필요한 흡광도 데이터를 얻을 수 있습니다. 그림 3 은 다양한 대조군과 샘플이 있는 웰의 위치를 보여줍니다. 이 예에서 사용된 것과 같은 유색 샘플의 경우, 색상이 410nm에서 pNA의 노란색 측정을 방해할 수 있으므로 분광 광도계 간섭을 최소화하기 위해 색상 제어를 추가해야 합니다.

흡광도 결과를 얻고, 각 샘플의 억제 비율을 계산하고, 결과를 대조군을 기반으로 정규화한 후에는 그림 4 와 유사한 막대 그래프를 생성해야 합니다. 백분율 억제 값이 높을수록 샘플에서 더 강한 엘라스타제 억제 활성을 나타냅니다. 100%에 가까운 값은 강한 억제를 나타내고, 0%에 가까운 값은 엘라스타제의 약하거나 전혀 억제되지 않음을 나타냅니다. 음의 억제 값은 엘라스타제 활성화를 나타냅니.......

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Discussion

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본 방법에서는 엘라스타제 효소에 대한 파이토케미컬의 조절 효과를 비색 분석을 사용하여 검사합니다. 엘라스틴 분해에 중요한 세린 프로테아제인 엘라스타제는 다양한 장기에서 조직 탄력을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 연구에서 설명된 비색 엘라스타제 분석은 엘라스타제 활성을 측정하기 위한 간단하고 민감하며 빠른 방법을 제공합니다.

이러한 맥락에서 연구자들은 엘라스타제 활성을 조절할 수 있는 잠재력 때문에 식물 추출물 및 순수 파이토케미컬과 같은 조절제에 초점을 맞추었습니다. 이러한 조절제는 천연 치료제 또는 화장품 제제의 개발에 응용할 수 있는 잠재력을 보여준다22. 여러 연구에서 녹차 추출물을 포함한 다양한 식물 추출물 및 식물 화학 물질23; 포도 덩굴, 석류 및 회향 종자 추출물24; .......

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Disclosures

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 스페인 과학혁신부(MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER, UE; 프로젝트: RTI2018-096724-B-C21, TED2021-129932B-C21, PID2021-125188OB-C32) 및 발렌시아나 총국(PROMETEO/2021/059)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 또한 스페인 정부의 생물의학 연구를 위한 공식 자금 지원 기관, CIBEROBN(CB12/03/30038), Agencia Valenciana de la Innovación: INNEST/2022/103을 통해 Carlos III 보건 연구소(ISCIII)의 지원을 받았습니다. 유럽 지역 개발 기금(European Regional Development Fund)이 공동 자금을 지원합니다. E.B.-C 및 M.H.-L. 2021/2023 보조금을 위한 스페인 대학 시스템 재자격의 지원을 받았습니다. F.J.Á.-M. 2021/2023년 젊은 의사 교육을 위해 Margarita Salas Grants의 지원을 받았습니다. 이 프로토콜의 개발에 큰 도움이 된 행정 및 기술 지원 직원에게 진심 어린 감사를 표하고 싶습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 웰 세포 배양 플레이트Corning Incorporated3599뚜껑이 있는 평평한 바닥, 폴리스티렌
세포 이미징 다중 모드 리더AgilentBioTek Cytation 1Gen5 소프트웨어와 함께 사용
췌장Sigma-AldrichE7885CAS 39445-21-1;25,9 kDa
이소프로판올 99.5%피셔 사이언티픽AC184130010CAS 67-63-0; 씨3H8O; 60.10 g / mol
N- 숙시닐 - (알라) 3- 니트로 아닐라이드시그마 - 알드리치S4760CAS 52299-14-6; C19H25N5O8 ; 451.43g/mol
pH 측정기Hach LangesensION+ PH31자석 교반기 및 센서 홀더 포함
페닐메탄설포닐 플루오라이드시그마-알드리치P7626CAS 329-98-6; C7H7FO2S;
분자 생물학PanReac AppliChemA2264; C4H11NO3; 121,14g/몰
돼지 CAS 77-86-1을 위한 174,19 g/mol 트리스

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Imokawa, G., Ishida, K. Biological mechanisms underlying the ultraviolet radiation-induced formation of skin wrinkling and sagging I: Reduced skin elasticity, highly associated with enhanced dermal elastase activity, triggers wrinkling and sagging. Int J Mol Sci. 16 (4), 7753-7775 (2015).
  2. Voynow, J. A., ....

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