다운스트림 응용을 위한 조류 배란 전 여포 granulosa 및 Theca 세포층 분리

달걀을 생산하는 닭은 세계 식량 공급망의 핵심 구성 요소이며 생식력 및 난소암 연구를 위해 진화하는 동물 모델입니다. 닭은 인플루엔자 백신¹에 대한 난자 연구에서 암성 종양 성장^연구2에 이르기까지 오랫동안 실험실에서 사용되어 왔으며 생식선 발달에 대한 통찰력을 제공하는 핵심 동물입니다 ^3,4,5. 암탉의 생식 기관의 역할, 특히 난소 여포 발달의 주기적 특성과 관련된 세포의 유형을 이해하는 것은 큰 관심과 잠재적인 응용 분야입니다. 암탉 난소를 조사하기 위한 다중 오믹스 접근법은 생산성 분석을 통해 농업 수확량을 늘리고 암탉을 생식 질환의 모델로 삼아 인간 건강에 대한 요인을 규명하는 데 응용할 수 있습니다.

조류 난소는 (1) 작은 원시 및 원발성 난포(>1mm), (2) 다양한 크기의 모집 전 여포(흰색에서 옅은 노란색, 2-8mm) 및 (3) 큰 난황으로 채워진 배란 전 여포(노란색)로 구성된 매우 뚜렷한 발달 여포 단계를 가지고 있습니다(그림 1)^5,6,7. 성적으로 성숙한 조류 난소는 난포가 있는 외피질(outer cortex)과 평활근(smooth muscle), 신경, 혈관구조(vasculature)로 구성된 내수질(inner medulla)로 구성되어 있다⁸. 여포 발달의 전체 주기는 피질에서 일어난다. 그러나 생후 약 5개월이 되어서야 왼쪽 난소만이 배란 전(즉, 노란색) 난포의 완전한 발달 계층을 보여주고 닭은 첫 배란과 산란(난자 산란)을 겪게 됩니다. 배란 전 여포는 약 5-6개의 난포의 전체적으로 보이는 계층 구조를 형성하며, 가장 크고 배란 다음으로 많은 여포(F1 여포)에서 덜 발달하고 가장 작은 여포(F5 또는 F6)에 이르기까지 다양합니다. 배란 전 여포는 더 큰 크기, 광대한 신경 분포 및 짙은 노란색 난황으로 인해 더 작은 모집 전 여포와 쉽게 구별할 수 있습니다.

모든 여포는 배란 전 여러 단계를 거치면서 난포의 신호전달, 성장 및 발달에 다양한 역할을 지원하는 특수 세포 유형을 포함하고 있으며, 이들은 과립층 세포(granulosa cell), 테카 세포(theca cell) 및 난모세포(oocyte, 여성 배우자)입니다(그림 2A). 특히, 과립층 세포층은 난포의 내벽을 형성하고, 테카 세포는 난모세포를 둘러싼 다른 벽을 형성합니다. 난포가 배란 전 계층을 통해 진행됨에 따라 테카 세포층과 과립층 세포층이 얇아지기 시작하며, 특히 배란 전 여포의 줄기 바로 맞은편 지점을 따라 얇아지기 시작합니다. 줄기는 난포가 난소에 부착되는 지점입니다(그림 2B). 줄기 맞은편에 있는 granulosa 및 theca 층의 이 선을 암술머리(stigma)라고 합니다(그림 2C). 혈관 조직이 전혀 없으며 F1 여포의 배란 중 여포 파열의 지점이 됩니다. 또한 생식 디스크 또는 난모세포를 둘러싸고 있는 푹신푹신한 흰색 지지 세포층도 볼 수 있습니다(그림 2B).

과립층 세포와 테카 세포는 모두 복잡한 호르몬 신호를 통해 난모세포를 둘러싸고 지원하기 때문에 난포 발달의 핵심 구성 요소입니다. 과립 세포층은 프로게스테론 생산을 일으키기 위해 순환 AMP (cAMP) 신호를 통해 스테로이드 생성 경로를 지원합니다 ^9,10,11. 반면에 테카 세포는 시간적으로 에스트라디올을 생성하는데, 이는 테카 세포가 안드로겐과 프로게스테론 12,13,14를 생산하는 포유류와는 크게 다릅니다. 외부 신호전달과 함께 과립층 세포와 테카 세포는 여포 성숙과 산란에 중요한 동인입니다. 과립층과 테카층을 분리하는 기술은 1977년 Gilbert et al.에 의해 처음 보고되었다¹⁵. granulosa 층과 theca 층을 포괄적으로 분리하고 granulosa 물질이 남아 있지 않도록 하는 것은 Gilbert 방법에서 어려움을 줄 수 있습니다. 또한 분리를 완료하기 위한 명확한 시각적 가이드가 없으면 작업을 수행하기 어려울 수 있습니다. 이 연구는 배란 전 여포에서 granulosa, theca 및 난모세포 층의 추출 및 분리를 설명하고, 이미지와 비디오를 모두 사용하여 적응을 제공하고 명확한 시각적 표현을 제공하는 것을 목표로 합니다(그림 3). 이 기술을 시각화하면 조류 난포를 연구하는 과학자들이 농업 및 생물 의학 다중 오믹스 접근 방식 모두에서 과립층 및 테카 층을 재현성 있게 캡처할 수 있습니다.

이 연구에 사용된 모든 동물은 델라웨어 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 프로토콜 110R)에서 승인한 프로토콜에 따라 유지 및 안락사되었습니다.

1. 준비

1. 멸균
   1. 중력 변위 오토클레이브(121°C에서 20분 동안)를 사용하여 5oz 유리 그릇을 오토클레이브하고, 알루미늄 호일로 덮고, 상단에 오토클레이브 테이프를 붙여서 무균 상태를 유지하고 표시합니다.
      참고: 분리가 수행되는 각 난포에 대해 하나의 그릇이 필요합니다.
   2. 중력 변위 오토클레이브(121°C에서 20분 동안)를 사용하는 고압증기멸균 도구에는 멸균 파우치에 담긴 가위, 곡선형 집게 및 직선 집게가 포함됩니다.
2. 분리 영역 설정
   1. 그림 4와 같이 여포 분리 영역을 설정합니다. 난포 분리 직전에 용기에 얼음을 채우고 난포 분리 과정 전반에 걸쳐 필요에 따라 보충합니다.
3. 솔루션
   1. PBS 농도를 10배로 희석하여 작업 재고를 1배로 늘리고 해부 전날 +4°C 냉장고에 넣습니다.
   2. 스프레이 병에서 이소프로판올을 작업 재고 농도의 70%로 희석합니다.

2. 해부

1. 성적으로 성숙한 암컷 새를 안락사시킵니다.
   1. 성적으로 성숙한 암컷 새(현재 알을 낳고 있어야 함)를 선택하고 자궁 경부 탈구와 같은 기관 관리 및 사용 프로토콜에 따라 승인된 방법(AVMA 지침)으로¹⁶ 마리를 안락사시킵니다.
   2. 가장 큰 F1 여포를 포획하려면 하루 동안 빛이 시작된 후 처음 4시간 이내에 동물을 안락사시킵니다. 안락사 전에 하복부를 촉진하여 자궁에 딱딱한 껍질을 가진 난자를 확인합니다. 이렇게 하면 산란이 이루어지지 않아 다음 배란이 아직 일어나지 않았습니다.
2. 난소에 접근합니다.
   1. 외부 지육과 깃털에 70% 이소프로판올을 뿌립니다. 이렇게 하면 깃털이 적시고 절개 부위가 깨끗해집니다.
   2. 해부 가위와 장갑을 낀 손을 사용하여 약 7.5cm(3인치) 길이의 수평(가로) 정중선 절개 부위를 꼬집어 자릅니다. 장기에 구멍이 나지 않도록 절개 전에 피부, 근육 및 지방층을 꼬집습니다.
   3. 새의 오른쪽 절개 부위를 옆으로 넓히고 장갑을 낀 손가락으로 살짝 조사하여 내장 기관을 가위로 밀어냅니다. 동물의 갈비뼈 중 2-3 개가 오른쪽에서 잘릴 때까지 계속하십시오.
   4. 오른쪽에서와 같이 새의 왼쪽으로 절개 부위를 넓힙니다. 난소의 배란 전 여포가 여기에 있고 난소 표면에서 돌출되어 쉽게 파열될 수 있으므로 각별한 주의로 진행하십시오. 새의 왼쪽에서 2-3개의 갈비뼈를 자르므로 배란 전 모낭이 가위에서 멀어지도록 손가락으로 부드럽게 누릅니다.
   5. 한 손은 새의 하복부에 놓고 다른 손은 가슴뼈 아래쪽에 단단히 놓고 새의 가슴을 수동으로 위로 집어넣어 새의 응강에 더 많이 접근할 수 있도록 합니다.
   6. 새의 각 허벅지를 호크 관절 가까이에 잡고 수동으로 뒤로 밀어 양쪽 고관절을 동시에 탈구시킵니다. 이제 시각적으로나 공간적으로 난소에 완전히 접근할 수 있습니다.
3. 배란 전 여포를 제거합니다.
   1. 일상적인 육안으로 모든 단계를 수행하십시오. 개인이 어느 단계에서든 시각화하는 데 문제가 있는 경우 해부 현미경을 사용하십시오.
   2. 장갑을 낀 손가락만 사용하여 눈에 보이는 노란색 배란 전 여포를 부드럽게 컵으로 만들어 난소에서 추출합니다. 줄기를 절단하는 데 도움이 되도록 추출하는 동안에만 줄기를 꼬집으십시오. 모낭 자체를 꼬집지 마십시오. 그렇지 않으면 파열될 수 있습니다.
   3. 각 모낭을 얼음처럼 차가운 PBS가 있는 멸균 용기에 넣습니다.
   4. 난황이 응고될 수 있도록 배란 전 난포를 얼음 위에 최소 5분 동안 그대로 두십시오. 따뜻한 난황은 주변 난포 세포층에 부착되어 후속 분리 기술을 수행하기 어렵게 만듭니다.

3. 실험실 내 분리

1. 멸균 용기에서 분리된 난포를 꺼내 남은 난포가 있는 용기를 얼음 위에 다시 놓습니다. 조작하기 전에 여포를 연구하여 줄기, 암술머리, 생식 디스크의 세 가지 특징의 위치를 기록하십시오(그림 2).
2. 여포 표면에서 장막을 제거하는 것으로 시작합니다. 마른 종이 타월 위에 모낭을 부드럽게 굴려 장막층을 제거하고 필요한 경우 부드럽게 잡아당깁니다.
3. PBS로 채워진 그릇 위의 줄기로 모낭을 잡습니다. 중력을 사용하여 줄기가 여포 표면에서 끝나는 위치를 시각화하고 가위를 사용하여 여포 표면에 구멍을 뚫지 않고 줄기만 잘라냅니다. 더 이상 보이지 않을 때까지 serosa 제거를 계속합니다.
4. 라이트박스를 사용하여 조명을 비추고 생식 디스크를 참조로 사용하여 암술을 반대쪽으로 재배치하고 암술머리 면이 보이도록 여포를 부드럽게 잡습니다. 얼음처럼 차가운 PBS 그릇 바로 위에 모낭을 잡습니다.
5. 메스를 집어 암술머리의 길이를 따라 부드럽게 자른 다음 노른자가 떨어지기 시작하면 즉시 난포를 PBS에 떨어뜨립니다. 난포를 꽉 잡으면 노른자가 중력에 의해 떨어지지 않고 노른자가 밖으로 밀려나게 됩니다.
6. 톱니가 없는 곧은 조직 집게를 사용하여 슬라이스의 한쪽 면에 있는 노른자에서 난포 벽의 분홍색 층을 부드럽게 벗겨냅니다. 난포벽을 난황에서 들어 올리는 약간의 꼬집고 당기는 동작을 사용하여 이 추출을 완료합니다.
7. 층 분리는 한 번에 약 5mm의 여포 벽 조직이 난황에서 후퇴할 때 가장 잘 작동합니다. 난포벽의 5mm 부분이 난황에서 성공적으로 후퇴하면 각진 집게를 직선 집게와 나란히 사용하여 모낭 껍질을 따라 탐색합니다.
8. 어떤 경우에는 과립층이 테카층보다 난황과 더 밀접하게 연관되어 있을 수 있습니다. 이 상황에서는 한 쌍의 집게를 사용하여 노른자 표면을 매우 부드럽게 탐색하여 노른자에서 티슈 종이 같은 층을 당겨 내십시오. 과립층 층이 발견되면 테카 층에 단단히 집어 넣고 앞에서 설명한 대로 두 층을 모두 노른자에서 당겨 빼냅니다.
9. 구부러진 집게를 사용하여 꼬집은 층에서 노른자를 가볍게 털어냅니다. 그릇에서 여분의 노른자를 쓸어내거나 제거합니다. 과립 층을 긁지 마십시오. 찢어짐이 발생할 수 있습니다. 격렬한 동작으로 인해 PBS 솔루션이 흐려지고 시각화가 줄어듭니다. 신중하고 신중한 동작으로 진행하십시오.
10. 여포 벽의 각 5-10mm 절편을 후퇴시킨 후 잠시 멈추고 각 집게 세트의 테카 및 과립층 층을 취하고 두 층이 모두 난황에서 벗겨지는 것처럼 서서히 서로 벗겨지고 있는지 확인합니다. 모낭 바깥쪽 주위에서 이 과정을 계속합니다. granulosa-theca 층의 피판으로 인해 조작이 어려워지면 난포를 돌려 절편의 다른 쪽에서 과정을 시작합니다.
11. 분리 과정에서 생식 디스크(여성 배우자 및 생식 소포)를 만나게 됩니다. 이것은 과립층과 난황 모두에 매우 부착되어 있는 영역입니다. 구부러진 집게는 과립층 세포에서 난황 표면으로 생식 디스크를 밀어내기 위해 가벼운 칫솔질 동작에 사용되므로 직선 집게를 사용하여 과립층 층을 테카 층에 단단히 고정하여 생식 디스크에 조심스럽게 접근합니다.
    1. 생식 디스크를 연구 표본으로 원하는 경우 이 시점에서 각진 집게로 노른자를 털어내고 원하는 대로 보관하십시오.
12. 구부러진 집게로 난포벽에서 난황을 계속 분리하여 난포의 전체 구에서 난황이 제거될 때까지 계속합니다.
13. 노른자의 나머지 부분이 층에서 솔질되면 과립층 층의 마지막 부분을 테카 층에서 분리합니다. 완전히 분리된 과립층 층에는 난황 물질이 전혀 없을 수 없지만 난황 물질로 코팅되어 있지 않은지 확인하십시오. 과립층 층과 칼 층을 4 °C 온도 PBS의 별도 용기에 넣습니다.
    1. 과립층이 테카층과 분리된 용기에 들어가면 집게로 PBS에서 테카층을 앞뒤로 부드럽게 교반하여 과립층의 잔여물이 분리되도록 합니다.
       참고: 분리 후 특정 처리 방법은 원하는 연구에 따라 분해 또는 원심분리에 의한 지질 파편 제거를 설명할 수 있습니다.
    2. 이 기술을 처음 실습할 때는 분리된 대표 표본을 조직학적으로 준비하고 분석하여 정확한 층 분리 및 수집을 확인합니다.
       1. 이를 위해 메쉬 조직 카세트 또는 스폰지를 사용하여 분리된 조직의 일부를 중성 완충 포르말린으로 고정하여 표본 손실을 방지한 다음 파라핀을 삽입하고 절편을 절단하고 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색합니다.
       2. 섬세한 특성으로 인해 세포층이 손상되지 않도록 조직학적 카세트의 생검 스폰지에 과립층 층을 조심스럽게 다루고 배치하십시오.
       3. 테카 층을 조직학적 카세트 안에 직접 넣습니다. 이렇게 하면 다른 여포 조직(즉, 난황 단백질 또는 대골 세포가 부착된 과립층 세포층 표본)에 의한 표본 오염 수준을 시각화할 수도 있습니다.
          참고: 여포 조직의 밀접한 연관성으로 인해 관심 층만 얻는 것이 항상 가능한 것은 아닙니다. 그러나 가능한 오염 수준을 알면 후속 다중 오믹스 접근 방식의 해석에 영향을 줄 수 있습니다.

이 프로토콜은 난포에서 과립층과 척추 세포층을 분리합니다(그림 5 및 그림 6). 그런 다음 성공적인 분리를 확인하기 위해 조직학적 검사를 위해 이러한 층을 준비할 수 있습니다. 공인 수의학 병리학자(EMB)가 검토하고 캡처한 이러한 조직학적 이미지는 F1 및 F5 배란 전 여포 모두에 대한 과립층과 테카층의 효과적인 분리를 명확하게 보여줍니다(그림 7). 특히, granulosa layer는 복잡한 주름을 나타내는데, 이는 인접한 척골 조직에서 추출하고 분리한 후 취약한 특성의 결과입니다. 과립층 세포는 원주형에서 pseudostratified 원주형으로 식별할 수 있으며, 서로 밀접하게 부착되어 있고 뚜렷한 세포막 경계가 특징입니다(그림 7A, B).

테카 세포층은 작고 조밀한 핵을 가진 방추형 세포를 특징으로 하며 큰 황체 세포(활성 스테로이드 호르몬 생산을 나타내는 투명하거나 거품이 많은 세포질이 있는 확대된 다각형 세포)를 포함할 수 있습니다. 혈액 세포(조류 종의 핵이 있는 난형 세포)와 작은 구경의 혈관은 척추층에서 일반적이며 예상할 수 있습니다. 기저에 있는 난소 기질은 척추층 샘플에서도 볼 수 있을 것입니다(그림 7C,D)8. 기질 조직은 테카층(thecal layer)에 비해 세포 밀도가 감소하는 경향이 있으며, 원주(세포가 서로 평행하고 소낭 내강에 원주층으로 정렬됨)에서 다방향(세포가 여러 방향으로 정렬)으로 세포 방향의 급격한 변화에 의해 시각화될 수 있으며, 과립층 세포가 테카층과 함께 유지되는 경우, 원주형 granulosa 세포의 얇은 층이 TheCA 세포 바로 위에 분명하게 나타날 것입니다(그림 8). 완전한 층 분리를 보장하려면 전체 반전된 테카 층을 철저히 관찰하는 것이 중요합니다. 3.10.1단계에서는 층 분리 후 과립층 세포가 거의 또는 전혀 남지 않도록 하기 위해 추가 헹굼 단계를 식별합니다. 결론적으로, 조직학적 검사는 배란 전 여포에서 과립층과 척골층의 성공적인 분리를 확인하여 각 층의 뚜렷한 특성을 강조하고 제안된 분리 방법을 검증합니다.

그림 1: 난소, 성숙한 산란계. 모든 난포가 부착된 암탉 난소. 배란 전 여포는 가장 큰 여포(F1)와 가장 작은 여포(F5 또는 F6)의 대략적인 크기 비교를 보여주기 위해 (F1-F5)로 표시됩니다. 일부 암탉 난소에는 최대 6개의 배란 전 난포가 있을 수 있습니다(표시되지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 난소 배란 전 여포 해부학, 성숙한 산란계. (A) 배란 전 여포를 구성하는 세포 유형과 중요한 조직 구성 요소가 있는 세포층의 개략도(BioRender를 사용하여 생성). 그림은 축척되지 않습니다. (B) 여포 구조에서 줄기(난포가 난소에 부착된 지점)와 생식 디스크(여성 배우자의 부위)의 총체적 식별. (C) 여포 구조에 있는 암술머리의 총체적 식별. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 가금류에서 난포 채취 및 분리의 일반적인 작업 흐름. 세포층을 얻고 수집하는 프로세스의 개략도(BioRender를 사용하여 생성됨). 이 과정은 성적으로 성숙한 암탉을 구하여 난포를 추출하는 것으로 시작됩니다. 그런 다음 이 난포는 1x PBS가 있는 용기에 수집되어 얼음 위에 보관됩니다. 그런 다음 단일 여포를 얼음 위에 1x PBS가 포함된 접시로 옮기고, 여기서 라이트박스를 사용하여 세포층을 분리합니다. 분리가 완료되면 연구원들은 DNA 분석, RNA 분석, 단백질 분석, 세포 배양 또는 조직학을 포함한 다양한 목적으로 샘플을 활용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 난포 분리를 위한 실험실 내 설정. 적절한 시각화를 위해서는 라이트박스와 해부 현미경이 필요합니다. 샘플의 최적 보존을 위해 유리 그릇과 PBS는 사전 냉각하고 분리가 완료될 때까지 얼음 위에 보관해야 합니다. 멸균 유리 접시, 수집 용기, 메스 블레이드 및 해부 도구가 필요합니다. 분리가 얼마나 잘 발생하는지 기록하는 시트도 사용하는 것이 좋습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 암탉 난소층에서 여포층의 초기 분리. 겸자는 테카(theca, 분홍색 상층)와 과립층(granulosa, 얇고 하얀 하층) 층을 모두 고정하는 데 사용됩니다. 이 시점에서, 분리 과정에서, 여포 벽의 두 층은 여전히 부분적으로 서로 붙어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 가금류에서 난소낭층의 대표적인 총 해부학적 분리. (A) 고립된 과립층. (B) 고립된 테카 층. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 암탉의 난소 조직에서 F1 및 F5 과립층과 테카층의 대표적인 조직학적 분리. 400x 배율에서 (A) F1 및 (B) F5 배란 전 여포에서 분리된 과립층의 조직학적 식별. 400X 배율로 (C) F1 및 (D) F5 배란 전 여포에서 분리된 theca 세포층. 과립층 세포는 뚜렷한 세포막 경계가 있는 원주형에서 유사성층화된 원주형 모양을 나타내는 반면, 테카 세포는 작고 조밀한 핵을 가진 방추형 형태를 나타냅니다. 또한, 기저 난소 기질과 함께 혈액 세포와 소구경 혈관의 존재는 척추층 샘플에서 일반적으로 관찰됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 가금류 난소에서 여포층 분리 후 과립층의 유지. 소수의 분리에서 과립층 세포(위)의 고르지 못한 저류가 척골층(가운데)에 부분적으로 부착되어 여포 기질(아래)을 오버레이하는 것을 관찰할 수 있으며, 이는 순수 세포층에 대한 정밀한 취급 및 분리의 필요성을 강조합니다. 이미지는 200배 배율입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 보고할 경쟁 이해관계가 없습니다.