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방법 논문

C-배당체-절단 장내 세균의 스크리닝 및 분리

945 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67346

⸱

2025년 2월 28일

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 C-배당체를 절단할 수 있는 장내 세균을 효율적으로 스크리닝하고 분리하기 위한 일련의 표준 운영 절차(SOP)를 확립합니다.

초록

C-배당체는 일반적으로 약용 식물에서 발견되며 항균, 항염증, 항바이러스, 항산화 및 항종양 활성을 포함한 다양한 생체 활성과 함께 광범위한 구조적 다양성을 나타냅니다. C-배당체에서 당 부분의 아노머 탄소는 탄소-탄소 결합을 통해 아글리콘에 직접 연결됩니다. O-배당체와 비교하여 C-배당체는 구조적으로 안정적이며 산과 효소에 내성이 있습니다. 결과적으로, 일반적으로 깨지지 않기 때문에 흡수성이 떨어지고 생체 이용률이 낮습니다. 흥미롭게도, 일부 장내 박테리아는 C-C 글리코시드 결합을 절단할 수 있으며, 이는 C-배당체를 분해하기 위한 특이적이고 환경 친화적인 생물학적 접근 방식을 제공합니다. 이 연구에서는 천연 화합물의 생체 내 변환 모델을 기반으로 C-C 글리코시드 결합을 절단할 수 있는 장내 박테리아를 스크리닝하기 위해 일련의 표준 운영 절차(SOP)를 개발했습니다. SOP에는 장내 세균의 준비 및 농축, 활동 지향 스크리닝, 저탄소 소스 매체에서의 활성 검증이 포함됩니다. 이 방법론은 이러한 특수 기능 박테리아를 분리하고 연구하는 것을 목표로 하는 연구자에게 기초 참고 자료를 제공합니다.

서론

C-배당체는 C-C 결합을 통해 글리코실기와 아글리콘이 직접 연결되는 것을 특징으로 하는 화합물 그룹입니다1. 자연에서 오리엔틴, 바이텍신, 푸에라린 및 그 유도체는 일반적으로 C-배당체2로 식별됩니다. 이러한 화합물은 Trollius chinensis3와 같은 약용 식물과 Styela plicata4와 같은 동물에서 자주 발견됩니다. 연구에 따르면 이러한 화합물은 항균 5,6,7, 항염증 8,9,10,11,12, 항바이러스 3,12,13, 항산화제 14,15,16 및 항종양 작용17.

C-C 결합을 통해 글리코실기와 골격의 결합으로 인해 이러한 화합물은 산성 및 효소 가수분해에 대한 높은 안정성과 내성을 나타내며(18), 흡수성이 낮고 생체이용률이 낮습니다19. 이러한 제한은 C-배당체의 개발 및 활용에 영향을 미칩니다. 그러나 종종 경구로 투여되는 C-배당체를 함유한 약물은 특정 효소에 의해 탈당화되어 더 강력한 생체 활성 아글리콘을 생성합니다 20,21,22,23. 숙주 자체의 효소는 C-배당체를 탈글리코실화할 수 없지만, 장내 세균은 특정 유형을 대사하는 것으로 보고되었습니다. 예를 들어, 일부 장내 세균은 망기페린을 노라티리올(norathyriol)로 전환하는데, 이는 항당뇨병 또는 항종양제로서 더 큰 효능을 나타낸다24. 이러한 발견에도 불구하고 C-배당체를 쪼갤 수 있는 박테리아의 수가 제한되어 규명되었으며 기본 메커니즘은 잘 이해되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이러한 박테리아에 대한 효율적이고 표준화된 스크리닝은 박테리아의 기능에 대한 이해를 높이고 C-배당체의 발달을 가속화할 것입니다.

스크리닝 방법은 시간이 지남에 따라 개발되고 성숙한 시스템으로 개선되었습니다. 핵심 접근 방식에는 농축(enrichment), 활동 지향 스크리닝(activity-oriented screening) 및 저탄소 소스 매체에서의 활동 검증(activity validation)이 포함됩니다. 이 방법은 순수한 표적 균주의 분리뿐만 아니라 표적 미생물의 종, 게놈 데이터 및 형질의 식별을 용이하게 합니다. 이 시스템을 사용하면 C-배당체를 절단할 수 있는 장내 박테리아를 효과적으로 스크리닝하고 분리할 수 있습니다.

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프로토콜

수행된 실험은 각 균주와 관련된 특정 생물안전성 위험에 적합한 지역, 국가 및 국제 생물안전성 봉쇄 규정을 준수했습니다. 대변 샘플은 적어도 일주일 동안 약물을 복용하지 않은 건강한 지원자로부터 수집되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 인체 장내 세균 형질전환 모델 in vitro 구축

  1. 일반 혐기성 배지(GAM)의 제조25
    1. 용액 A의 준비
      1. 500mL 삼각 플라스크에 트립톤 10.0g, 프로테오스 펩톤 10.0g, 대두 펩톤 3.0g, 소화 혈청 분말 13.5g, 간 추출물 분말 1.2g, 쇠고기 추출물 2.2g, 효모 추출물 5.0g을 결합합니다.
      2. 증류수 500mL를 넣고 물질이 완전히 용해될 때까지 가열하에서 저어줍니다.
    2. 용액 B의 준비
      1. 250mL 삼각 플라스크에 포도당 3.0g, 용해성 전분 5.0g, 인산수소이칼륨 2.5g, 염화나트륨 3.0g을 결합하는 것을 제외하고 용액 A와 동일한 절차에 따라 용액 B를 준비합니다.
    3. 용액 C의 준비
      1. 100mL 삼각 플라스크에 0.3g의 L-시스테인 염산염과 0.3g의 티오글리콜산나트륨을 결합하는 것을 제외하고 용액 A 및 B와 동일한 절차에 따라 용액 C를 준비합니다.
      2. 1000mL 삼각 플라스크에 세 가지 용액을 모두 혼합하고 10% 수산화나트륨 용액을 사용하여 pH를 7.2로 조정한 다음 증류수를 추가하여 최종 부피 1000mL를 구성합니다.
      3. 배지를 250mL 삼각 플라스크에 분배하고 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다. 실온으로 식히고 4 °C에서 보관하십시오.
    4. 고체 일반 혐기성 매체의 제조
      1. GAM 액체 매체에 1%-2% 한천을 넣고 완전히 용해될 때까지 가열합니다. 250mL 삼각 플라스크에 분배하고 121°C에서 30분 동안 오토클레이브합니다.
    5. 저탄소 원료 매체의 준비
      1. GAM과 동일한 절차를 사용하여 저탄소 소스 매체를 준비하되 효모 추출물, 포도당 및 수용성 전분은 생략합니다.
  2. 혼합 인간 장내 세균총의 준비
    1. 질소 가스로 채워진 일회용 멸균 대변 수집 튜브에 신선한 인간 배설물 1-2g을 수집합니다. 즉시 튜브를 밀봉하십시오. 멸균 혐기성 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 5mL의 GAM 배지, 밀봉 및 배양을 추가합니다.
      알림: 산소 측정기를 사용하여 혐기성 인큐베이터의 산소 수준을 모니터링하고 혐기성 상태를 유지하기 위해 필요에 따라 질소 가스를 교체하십시오.
  3. 혼합된 인간 장내 세균총의 활성화
    1. 24시간 후, 0.5mL의 인간 장내 세균 현탁액을 4.5mL의 새로운 GAM 배지가 들어 있는 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    2. 혐기성 조건에서 24시간 동안 37°C에서 밀봉하고 배양하여 활성 혼합 인간 장내 세균총을 얻습니다.
  4. 참조 용액 준비
    1. 오리엔틴과 루테올린을 각각 5mg씩 계량하고 DMSO 1mL에 따로 용해시켜 5mg/mL 농도의 오리엔틴과 루테올린 기준 용액을 제조합니다.
  5. C-배당체를 절단할 수 있는 활성 장내 세균총 스크리닝
    1. 260μL의 활성 장내 세균총을 40μL의 오리엔틴 기준 용액을 함유한 6mL의 새로운 저탄소 소스 배지와 혼합하고 37°C에서 배양합니다.
    2. 대조군(6mL의 저탄소 소스 배지, 40μL의 오리엔틴 기준 용액 및 260μL의 생리 식염수) 및 블랭크 그룹(6mL의 저탄소 소스 배지, 40μL의 생 식염수 및 260μL의 활성 장내 세균총)을 포함합니다.
      참고: 모든 테스트는 혐기성 인큐베이터에서 세 번 수행합니다.
  6. transformation solution의 전처리
    1. 24시간 및 48시간 후, 반응 용액 1mL를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 실온에서 15분 동안 13,400 x g 으로 원심분리하여 박테리아를 제거합니다.
    2. 600μL의 메탄올에 200μL의 상등액을 첨가하고 혼합한 후 실온에서 15분 동안 13,400 x g 의 원심분리를 하여 단백질을 제거합니다.
  7. 변환 제품 감지
    1. 0.22μm 미세다공성 멤브레인을 사용하여 상층액을 여과하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 여과액을 분석합니다. C18 컬럼(4.6mm × 250mm, 5μm)이 장착된 기기에서 HPLC 분석을 수행합니다.
    2. 컬럼 오븐 온도를 40°C에서 1mL/분의 유속으로 유지합니다. 아세토니트릴을 이동상 A로 사용하고 정제수 중 0.1% 포름산을 이동상 B로 사용합니다.
      참고: 다음과 같이 선형 그라디언트 시스템을 사용합니다: 0-20분에 5%-55% A, 20-25분에 55%-95% A, 25-30분에 95%-5% A, 30-32분에 5% A.

2. 인간 장내 세균총에서 단일 균주의 분리

  1. 혼합된 인간 장내 세균총의 활성화
    1. 1.3단계에서 설명한 대로 오리엔틴을 절단할 수 있는 혼합된 인간 장내 세균총을 활성화하여 활성화된 인간 장내 세균총 용액을 얻습니다.
  2. 고체 GAM 플레이트의 준비
    1. 준비된 고체 GAM 배지를 가열하여 용해시키고 혐기성 인큐베이터의 일회용 멸균 페트리 접시에 붓습니다. 매체가 응고되어 고체 GAM 플레이트를 준비하도록 합니다.
  3. 인간 장내 세균총에서 단일 균주에 대한 예비 스크리닝
    1. 활성 박테리아 용액 100μL를 1mL의 생리식염수가 들어 있는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 피펫팅합니다.
    2. 일회용 접종 링을 사용하여 페트리 접시에 적절한 양의 박테리아 용액을 접종합니다. 접시를 밀봉하고 혐기성 인큐베이터에서 배양하십시오.
  4. 군체 형태학의 관찰
    1. 37 ° C에서 48 시간의 배양 후 플레이트에있는 식민지의 크기, 형태 및 색상을 관찰하십시오.
  5. 단일 균주를 얻기 위한 개별 콜로니 선택
    1. 뚜렷한 단일 박테리아 콜로니를 선택하고 4.5mL의 새로운 GAM 배지를 포함하는 10mL 마이크로 원심분리 튜브에서 배양합니다. 37 ° C에서 24 시간 동안 혐기성 조건에서 배양하여 단일 균주를 얻습니다.
  6. 단일 변형 활성의 검증
    1. 1.5단계, 1.6단계, 1.7단계에 설명된 대로 단일 균주의 활성을 확인합니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 플레이트 마킹25를 사용하여 활성 검증을 수행합니다.
  7. 인간 장내 세균총에서 단일 균주의 정제
    1. 2.1단계에서 설명한 대로 활성 단일 균주를 정제합니다. 1.5, 1.6, 1.7단계에 설명된 절차에 따라 orientin을 사용한 변환 실험을 통해 그 활성을 확인합니다.

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결과

10명의 건강한 지원자의 대변 샘플을 형질전환 실험을 사용하여 스크리닝한 결과, 탈글리코실화 오리엔틴의 활성을 입증한 1개의 샘플이 나왔습니다. 이 발견은 활성 샘플에 대한 스크리닝의 타당성을 확인했습니다. 활성 샘플은 플레이트 마킹 방법을 사용하여 분리되었습니다. 군체의 형태와 특성을 기반으로 추가 분석을 위해 노란색 또는 흰색 착색, 다양한 모양 및 고르지 않은 가장자리를 가진 약 18개의 단일 박테리아 군락을 선택했습니다. 이 중 단 하나의 군체만이 오리엔틴을 아글리콘인 루테올린(luteolin)으로 절단할 수 있는 능력을 보여주었습니다. 콜로니는 앞서 설명한 방법론에 따라 플레이트 마킹 공정을 5회 반복하여 순수 활성 균주를 얻기 위해 추가로 정제되었습니다. 탈당화 생성물을 검출하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석이 사용되었습니다. 오리엔틴과 루테올린의 머무름 시간은 각각 11.5분과 16.5분이었습니다(그림 1). 탈당화 활성을 가진 순수 균주를 성공...

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토론

C-배당체를 절단할 수 있는 인간 장내 세균을 스크리닝하기 위한 표준 운영 절차(SOP)가 확립되었습니다. 이러한 절차를 사용하여 순수 활성 균주를 성공적으로 얻었고, 형질전환 시험을 통해 탈당화 특성을 확인했습니다. SOP는 장내 세균의 준비 및 농축, 활동 지향 스크리닝, 저탄소 소스 매체에서의 활성 검증으로 구성됩니다.

스크리닝 프로세스의 가장 중요한 측면은 박테리아 활동을 유도하고 스크리닝 성공률을 높이기 위해 저탄소 소스 매체를 사용하는 것입니다. 형질전환 실험 중 저활성 박테리아는 GAM 배지를 사용하여 식별하기 어렵지만 저탄소 소스 배지를 사용하면 더 쉽게 검출됩니다25. 준비 및 농축 기술은 비표적 균주를 최소화하면서 표적 균주를 최대화합니다. 선별 과정은 활동 테스트의 안내에 따라 단계적으로 수행되어 성공률을 높이고 거짓 긍정 비율을 최소화합니다. 이 SOP는 ...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (National Natural Science Foundation of China 82374134)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토니트릴써모 피셔 사이언티픽F2408R205HPLC
혐기성 인큐베이터상하이 CIMO 의료 기기 제조 유한 회사YQX-II
쇠고기 추출물베이징 Abxing Biotechnology Co., LTD01-009BR
소화 혈청 분말베이징 Abxing Biotechnology Co., LTD01-087BR
다이칼륨 인산수소Beijing Chemical WorksM26298AR
일회용 멸균 대변 수집 튜브Lang Fu Co., LTD5mL
증류수바이오 제약학과, 베이징 전통 중국 의학
DMSOSigma-Aldrich CorporationWXBD2861VAR
EP 튜브Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD10 mL/1.5 mL
Eppendorf CentrifugeEppendorf AG5418
GlucoseBeijing Chemical WorksGC205003
AR 고성능 액체 크로마토그래프Shimadzu CorporationLC-20
고압 증기 멸균기Sanyo Denki Shanghai Co., LTDMLS-3780
Innoval C18 크로마토그래피 컬럼Agela Technologies Co., LTD4.6 mm × 250 mm, 5 µ m
L-시스테인 염산염Beijing Abxing Biotechnology Co., LTDBGASY01BR
간 추출물 분말Beijing Abxing Biotechnology Co., LTD01-085BR
루테올린국립 식품 의약품 통제>98%
Magnetic StirrerIka Werke Co., LTDRCT basic
메탄올Thermo Fisher Scientific20240901312AR
Millipore 필터 멤브레인Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.0.22 & 마이크로; L &시간; 50mm
OrientinYishiming (Beijing) Biotechnology Co., Ltd19120601>98%
펩톤Beijing Abxing Biotechnology Co., Ltd1685787BR
페트리 접시Beijing Biodee Biotechnology Co., LTD150mm
염화나트륨Beijing Abxing Biotechnology Co., LTDBN20008AR
나트륨 티오글리콜레이트Shanghai Jianglai Biotechnology Co., LTDJ031S219019AR
용해성 전분Beijing Abxing Biotechnology Co., LTDS9765
BR Soya PeptoneBeijing Abxing Biotechnology Co., LTD2147955BR
TryptoneAgela Technologies Co., LTD1685787BR
초음파 세척기Kun Shan Ultrasonic Instruments Co., LTDKQ-500DE
효모 추출물베이징 Abxing 생명 공학 Co., LTD01-014BR
대학 연구소

참고문헌

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