방법 논문

삼투압 조절을 통해 Bursaphelenchus xylophilus 의 3단계 분산 청소년의 Cryptobiosis 진입 유도

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DOI:

10.3791/67350

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2024년 12월 27일

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11State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Tianjin Institute of Forestry Science, Chinese Academy of Forestry, 4Ningbo Yongsen Biotechnology Co. Ltd, 5Xiangshan Natural Resources and Planning Bureau of Zhejiang

이 논문에서

요약

본 프로토콜은 염화칼륨(KCl) 이온의 삼투압 조절을 통해 Bursaphelenchus xylophilus의 3기 유년기(pre-dauer juveniles, JIII.)를 cryptobiosis로 분산시키는 방법을 설명합니다. 이 방법은 B. xylophilus의 응력 저항 메커니즘에 대한 연구를 위한 기술 지원을 제공할 수 있습니다.

초록

크립토바이오시스(Cryptobiosis)는 유기체가 거의 모든 내부 수분을 잃고 극도의 환경 스트레스 하에서 무수생물 상태에 들어가는 상태입니다. Bursaphelenchus xylophilus의 분산 3단계 유년기(pre-dauer 유년기, figure-abstract-1)는 탈수를 통해 크립토바이오시스에 들어갈 수 있으며 환경 조건이 개선되면 재수화 시 부활할 수 있습니다. 삼투압 조절은 이 과정에서 그들의 생존에 매우 중요합니다. 이 연구에서는 중국 저장성 닝보에서 소나무 시들음병으로 인해 죽은 Pinus massoniana에서 B. xylophilus의 표본 figure-abstract-2 을 수집했습니다. 8% 염화칼륨(KCl) 용액에 침지한 후, figure-abstract-3 B. xylophilus는 자연적인 수분 증발에 의한 외부 삼투압 증가로 인해 점진적인 탈수 후 크립토바이오틱 상태에 진입했습니다. figure-abstract-4 B. xylophilus는 -20°C에서 저온 스트레스를 견딜 수 있습니다. figure-abstract-5 B. xylophilus는 재수화 시 92.1%의 생존율로 회복할 수 있습니다. 이 과정은 B. xylophilus가 figure-abstract-6 크립토바이오시스에 진입하는 것을 조절하여 극한의 환경에 저항할 수 있도록 합니다. 본 연구에서 설명한 이 방법은 간단하고 신뢰할 수 있으며 B. xylophilus의 응력 저항 메커니즘을 연구하기 위한 기술적 지원을 제공합니다.

서론

소나무 시들음병은 중국에서 가장 심각한 산림 질병중 하나입니다 1. 소나무 선충 Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus)는 숙주 내에서 번식하여 Pinus massoniana (P. massoniana)와 같은 소나무 종에 심각한 위협을 가하여 빠른 시들음과 죽음을 초래합니다. 숙주의 사후 불리한 환경 조건하에서, B. xylophilus 의 생식 청소년은 다우어 이전 청소년으로 들어갈 수 있습니다 (figure-introduction-1). 이 어린 소나무는 이동을 계속하고 퍼뜨리기 위해 곤충 매개체를 찾아 광범위한 소나무 숲 죽임을 초래합니다2.

크립토바이오시스(Cryptobiosis)는 유기체가 거의 모든 내부 수분을 잃고 극도의 환경 스트레스 하에서 무수생물증(anhydrobiosis)에 들어가는 상태입니다3. 이 과정에서 유기체는 점차 탈수되어 움직임이 멈추고 신진대사가 감소하며 수명 주기가 중단됩니다4. 적절한 조건에서는 수분 보충 시 회복할 수 있습니다. 크립토바이오시스(Cryptobiosis)는 유기체가 저온과 같은 극한 환경에 저항하고 수명을 연장할 수 있도록 합니다5. 30,000년 동안 크립토바이오시스에서 살아남은 선충은 남극 영구 동토층6에서 발견되었습니다.

이전 연구에 따르면 선충은 표면 투과성을 조절하여 탈수 중에 저온, 가뭄 및 높은 삼투압과 같은 다양한 비생물적 스트레스 요인에 적응할 수 있습니다7. 또한 선충은 표면적을 줄이고 수분 손실률을 최소화하기 위해 몸을 말릴 수 있습니다. 예를 들어, Caenorhabditis elegans 는 삼투압 균형을 조절하여 이온과 작은 분자가 표피를 자유롭게 통과할 수 있도록 하는 반면 큰 분자는 통과할 수 없습니다8. figure-introduction-2 B. xylophilus 는 또한 cryptobiosis를 나타냅니다. 크립토바이오시스(cryptobiosis)의 탈수 및 재수화 단계(rehydration stage)에서 삼투압 조절은 큐티클 전체의 물질 교환을 제어하는 데 필수적이며, 이는 크립토바이오시스(cryptobiosis)에 들어가거나 회복하는 데 매우 중요합니다9.

본 연구에서는 B. xylophilus에서 figure-introduction-3 삼투압 조절을 통해 cryptobiosis를 유도하는 방법을 소개하고 있다. 이 방법은 간단하고 효율적이며 신뢰성이 높으며 B. xylophilus의 응력 저항 메커니즘을 figure-introduction-4 연구하기 위한 기술 지원을 제공합니다.

프로토콜

1. B. xylophilus 수집 figure-protocol-1

  1. P. massoniana의 감염된 디스크 수집
    참고: 모든 절차는 소나무 시들음병 전염병 전염병 지역 및 감염된 목재에 대한 행정 조치 및 기타 해당 규정을 준수했습니다. 저장(Zhejiang)성 닝보시(Ningbo)시 샹산(Xiangshan)현에서 B. xylophilus에 감염된 P. massoniana 숲이 샘플 장소로 선정되었습니다. 소나무 시들음병으로 죽은 P. massoniana는 샘플 사이트 내에서 벌목되었습니다.
    1. 쓰러진 나무의 주요 줄기의 위쪽, 중간 및 아래쪽 부분에서 둥근 통나무(5cm 두께)를 수집합니다.
    2. 수집된 P. massoniana의 둥근 통나무를 0.5-1cm 두께로 자른 다음 2-3cm 길이의 작은 조각으로 자릅니다.
    3. 작은 나무 조각을 밀봉된 가방에 넣고 나중에 사용할 수 있도록 실험실에 보관하십시오.
  2. B. xylophilus 추출 figure-protocol-2
    1. 직경이 약 15cm인 목이 긴 유리 깔때기의 좁은 끝에 고무 튜브를 부착합니다. 핀치콕으로 고무 튜브를 고정합니다. 조립된 깔때기를 깔때기 스탠드에 놓습니다.
    2. 작은 나무 조각을 한 겹의 티슈 페이퍼로 완전히 감싼 다음 깔때기에 넣습니다. 모든 나무 조각이 잠길 때까지 깔때기에 증류수를 추가합니다.
      참고: 12-24시간 동안 서 있던 후, 선충은 나무 조각에서 이동하여 깔때기10의 바닥에 정착했습니다. 티슈 페이퍼는 선충이 통과할 수 있도록 하면서 나무 파편이 가라앉는 것을 방지했습니다.
    3. 깔때기 바닥에 있는 핀치콕을 천천히 풀고 혼합물의 2000-5000 μL가 현미경 검사 및 형태학적 식별을 위해 페트리 접시(직경 5cm)로 누출되도록 합니다.
    4. B. xylophilus는 탐침, 중간 식도구, 지질 방울, "손가락 모양의" 꼬리 모양과 같은 특징을 관찰하여 식별 figure-protocol-3 한다11.
    5. 현미경으로 매번 10μL 피펫을 사용하여 10μL의 액체와 1개의 선충을 흡입하여 개별 figure-protocol-4 B. xylophilus 를 슬라이드로 옮깁니다. 이 과정을 30회 반복하여 선충을 함유한 혼합물 약 300μL를 수집합니다.
    6. B. xylophilus 추출 figure-protocol-5 후 남은 나무 조각과 감염된 목재 재료를 살균하여 추가 오염을 방지합니다.

2. 삼투압 조절 공정 제어

  1. 삼투압 조절 혼합물의 제조
    1. 8% KCl 수용액을 준비합니다.
    2. 피펫을 사용하여 B. xylophilus의 혼합물 figure-protocol-6 이 포함된 슬라이드에 8% KCl 수용액 10μL를 첨가하여 선충과 KCl 용액의 혼합물을 약 310μL로 생성합니다.
  2. B. xylophilus의 figure-protocol-7 증가된 삼투압 및 탈수 조절
    1. 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓아 물이 자연적으로 증발하도록 합니다. 그것은 주변 환경의 삼투압을 점차적으로 증가시켜 선충이 약 30-60분에 걸쳐 탈수되도록 합니다.
      참고: 작업자는 KCL 결정이 침전될 때까지 물이 자연적으로 증발할 때까지 기다렸다가 현미경으로 선충의 상태를 관찰하기만 하면 됩니다. KCL 결정이 침전될 때까지 혼합물 310μL가 자연적으로 증발하는 데 약 30-60분이 걸립니다.
    2. 현미경으로 B. xylophilus의 figure-protocol-8 탈수 과정(예: 바디 컬링, 응집 등)을 관찰합니다. 물이 완전히 증발하고 KCl 결정이 침전되면 figure-protocol-9 B. xylophilus는 움직임을 멈추고 cryptobiosis에 들어갑니다.
  3. 크립토바이오틱스 figure-protocol-10 B. xylophilus의 저온 스트레스 처리
    1. 크립토바이오틱 figure-protocol-11 B. 자일로필루스 를 -20°C의 일정한 온도 환경에 24시간 동안 놓습니다.
  4. 감소된 삼투압 조절 및 B. xylophilus의 figure-protocol-12 재수화
    1. 피펫으로 저온 처리를 한 유어 주위에 약 300μL의 증류수를 추가합니다. 약 30-60분 동안 지속되는 재수화 과정은 주변 환경의 삼투압을 점차적으로 감소시킵니다.
    2. 현미경으로 B. xylophilus의 figure-protocol-13 재수화 과정(예: 신체 스트레칭, 운동 재개 등)을 관찰합니다. 24시간 후 생존율을 계산합니다.

결과

8% KCl 용액에서 물이 증발 figure-results-1 함에 따라 B. xylophilus는 운동성을 유지하면서 처음에는 눈에 띄는 "말림"을 보였습니다(그림 1A). 일단 물이 완전히 증발하자, 선충은 움직임을 멈추고 말렸으며, 표면이 함몰되고 지질 방울이 쌓였는데(그림 1B), 이는 그들이 크립토바이오틱 상태로 진입했음을 나타냅니다. 주변 환경에 증류수를 첨가하자 선충은 재수화되고 재생되었습니다(그림 1C). 물이 증발한 후 KCL 결정이 나타납니다(그림 1D). 그림 1E는 B. xylophilus의 figure-results-2 형태학적 특성을 보여줍니다.

탈수 실험에 따르면 초기 8% KCl 용액에서 수분 증발로 figure-results-3 인해 B. xylophilus가 수분을 잃는 것으로 나타났습니다. 탈수 figure-results-4 후 B. xylophilus는 -20°C에서 24시간 동안 저온 스트레스를 받았고 평균 생존율은 92.1%11였습니다. 크립토바이오틱 상태에 진입하지 않은 대조군의 생존율이 0%인 것과 비교했을 때, 위의 데이터는 탈수가 저온 조건에서 B. 자일로필루스의 figure-results-5 생존율을 크게 향상시킬 수 있음을 시사했습니다.

B. xylophilus의 figure-results-6 크립토바이오시스(cryptobiosis) 후 재수화 단계(rehydration phase)에서 선충의 100%가 40% KCl 용액에서 증류수로 전달될 때 생체 내에서 "기포"를 나타내는 것을 관찰했습니다(그림 2).

figure-results-7
그림 1: B. xylophilus의 figure-results-8 탈수-크립토바이오시스-재수화 과정. 이 이미지는 (A) 탈수 단계, (B) 크립토바이오시스 단계, (C) 재수화 단계, (D) KCL 결정화 단계 및 (E) B. 자일로필루스를 포함한 B. xylophilus의 figure-results-9 크립토세움 과정을 보여줍니다.figure-results-10 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-11
그림 2: 재생 figure-results-12 되지 않은 B. xylophilus의 지방 과립 축적. 이 이미지는 재수화 후 B. xylophilus의 figure-results-13 상태를 보여주며, in vivo 거품 모양의 지방 과립의 존재를 특징으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 연구 figure-discussion-1 에서 B. xylophilus는 저장성 닝보의 죽은 P. massoniana에서 수집되었습니다. B. xylophilus는 서로 다른 instars를 가진 혼합 개체군에서 선택되었다는 점에 유의 figure-discussion-2 해야 합니다. 구체적으로, B. xylophilus의 밀도가 높은 둥근 통나무를 선택한 후 B. xylophilus를 figure-discussion-3 스크리닝했습니다. 겨울철, 랴오닝성의 일일 최저 기온이 -20 °C 정도일 때, 죽은 Pinus tabuliformis에서 많은 수의 single-instar figure-discussion-4 B. xylophilus를 얻을 수 있으며, 이는 본 실험12에서 선택 과정을 단순화했다.

크립토바이오틱(cryptobiotic) 과정에서 선충의 느린 탈수 속도는 생존에 도움이 되고 단백질의 구조적 손상을 방지합니다13. 탈수 시간은 B. xylophilus의 figure-discussion-5 생존율을 결정하는 데 매우 중요합니다. 본 연구에서는 초기 농도 8%의 KCl 용액을 사용하였으며, 물의 자연 증발에 따라 농도를 점진적으로 증가시켜 B. xylophilus가 서서히 탈수되어 크립토바이오시스에 진입할 수 있도록 figure-discussion-6 하였다. 물이 너무 빨리 증발하거나 선충을 고농도 KCl 용액에 직접 넣으면 생존율이 크게 떨어집니다.

이 연구에서 설명한 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다. 실험 물질은 쉽게 접근할 수 있으며 KCl 용액과 증류수만 있으면 B. xylophilus의 figure-discussion-7 탈수 및 재수화를 조절할 수 있습니다. 절차는 간단합니다: 탈수는 자연 증발을 통해 발생하고, 재수화는 증류수를 첨가하여 이루어집니다. 전체 프로세스는 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 방법은 높은 성공률과 생존율을 자랑하며, 대부분의 figure-discussion-8 B. xylophilus는 탈수 후 크립토바이오시스에 들어가고 대다수는 재수화 후 부활합니다11.

제안된 방법은 B. xylophilus와 4단계 분산 유년기 (figure-discussion-9)14 모두의 figure-discussion-10 크립토바이오틱 상태를 조절하는 데 적용할 수 있습니다. 그러나 번식하는 B. xylophilus에는 효과적이지 않을 수 있습니다.

최근 몇 년 동안 B. xylophilus에 의한 소나무 시들음병은 중국 남부에서 북부 지역으로 확대되었습니다. figure-discussion-11 이 추운 북부 지역의 소나무에 서식하는 B. xylophilus는 더 큰 추위에 저항하는 경향이 있습니다15. 제안된 방법은 B. xylophilus의 figure-discussion-12 크립토바이오시스를 유도하여 추위와 가뭄에 대한 저항력을 향상시킬 수 있습니다. 총체적으로 이 방법은 B. xylophilus의 응력 저항 메커니즘과 소나무 시들음병의 전염 메커니즘을 연구하기 위한 기술적 지원을 제공할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중앙 공익 과학 기관인 국가 핵심 수목 유전학 및 육종 연구소의 기초 연구 기금(보조금 번호 CAFYBB2020ZY001-2), 기업 연구 프로젝트(202404016-4320) 및 중국 국립 자연 과학 재단(NSFC 32271896)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
유리 슬라이드바이오랜드GS7101-752575mm & 25mm & 1 밀리미터
목이 긴 유리 깔때기난징 Kangluoda 실험 기술해당 사항 없음150 밀리미터
현미경피닉스XSP-35-1600XPH100-2B41L-IPL
페트리 접시난징 Kangluoda 실험 기술  TB-62493579274550mm & 50 밀리미터
핀치콕난징 Kangluoda 실험 기술  TB-62497331174336mm & 11mm  &시간; 55 밀리미터
피펫에펜도르프312300001210– 100 & 마이크로; L
염화칼륨(KCL)솔라바이오 생명과학P9921500 그램
고무 튜브난징 Kangluoda 실험 기술TB-6249234570947mm & 5 밀리미터
살 균 제빈장 https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm=
a2615.7691456.co_0_0_wangpu
_score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0		75리터
티슈 페이퍼 마음과 마음의 각인엠322.5 cm & 21.5 센티미터

참고문헌

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