인간 혈소판에서 조직 인자 발현의 유동세포분석(flow cytometry analysis)

요약

이 글은 전혈 유동 세포분석을 이용해 조직인자(TF) 양성 혈소판의 비율을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다. 단백질을 평가하여: (1) 휴식 상태에서 세포 내 분포, (2) 휴식 상태와 활성화 상태 모두에서 검사합니다. 또한 혈소판 풍부 혈장 내 TF 양성 혈소판 평가에 대한 지침도 제공됩니다.

초록

순환하는 인체 혈소판의 일부는 혈액 응고의 연쇄 반응과 혈전 형성의 핵심 활성화자인 조직 인자(TF)를 세포 내에 저장합니다. 혈소판이 활성화되면 TF가 세포막에 노출되어 FVII에 결합하여 궁극적으로 트롬빈 생성을 촉진합니다. (1) 다양한 임상 환경에서 TF 양성 혈소판 수치가 증가하여 환자의 혈전성 표현형에 기여하고, (2) 다양한 약물이 혈소판 관련 TF 발현을 조절할 수 있다는 점을 고려할 때, TF 양성 혈소판을 평가하는 표준화된 방법은 과거에 논란이 있었던 만큼 가치가 있습니다. 여기서는 전혈 및 혈소판 풍부혈장(PRP)/세척된 혈장에서 유세포검사를 이용한 TF 양성 혈소판 비율을 측정하는 프로토콜을 개략적으로 설명합니다. 이 프로토콜은 (1) 휴식 상태에서 세포 내 단백질을, (2) 휴지 상태와 활성화 상태 모두에서 단백질을 평가하여 TF-양성 혈소판의 비율을 상세히 정량하는 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다. 첫 번째 섹션은 사전 분석 절차가 결과에 영향을 미치지 않도록 혈액 빼기를 올바르게 수행하는 데 필수적인 정보를 제공합니다. 다음으로, 프로토콜은 유세포분석 분석을 위한 샘플 준비 및 라벨링 절차에 중점을 둡니다. 세포 자극, 표지, 고정, 투과화 등 필요한 경우 상세한 단계가 제시되어 있습니다. 마지막으로, 혈소판 집단을 올바르게 식별하고 TF-양성 사건을 분석하기 위한 유세포검사 설정에 대한 지침이 설명됩니다. 마지막으로, 이 방법은 분리된 혈소판에서 TF 양성 혈소판을 측정할 경우 PRP 준비 절차를 포함합니다. TF를 포함하는 혈소판의 일부만이 포함되어 있으므로, PRP를 얻기 위해 필요한 원심분리 과정에서 이 혈소판들이 손실되지 않도록 하는 것이 중요합니다.

서론

조직인자(TF)는 막을 관통하는 당단백질이자 혈액 응고 연쇄의 핵심 활성화자로, 특히 크기²를 가진 혈액 혈소판¹의 ~20%-30% 일부에 의해 발현됩니다. 아데노신 이인산(ADP)과 트롬빈과 같은 고전적 혈소판 작용제에 의해 활성화되면, 혈소판은 표면에 기능성 TF를 농도에 따라 노출시켜 인자 VII/VIIa에 결합하여 궁극적으로 트롬빈 1,3,4,5,6 생성으로 이어집니다. 특히 관상동맥질환(CAD)⁷, 중증급성호흡기증후군-코로나바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염⁸, 난방공과 관련된 오라 동반 편두통(MHA-PFO)⁹, 암¹⁰, 패혈증¹¹과 같은 병리학적 상태에서는 TF 양성 혈소판 수가 유의미하게 증가하여 임상 환경에서 혈전성 위험이 증가하는 데 기여합니다.

이러한 설득력 있는 증거에도 불구하고, TF 양성 혈소판 검출은 과학계 내에서 여전히 논쟁의 주제로 남아 있습니다 ^6,12,13. 사전 분석 변수, 샘플 준비, 항체 특이성 등 방법론적 문제들이 문헌에서 보고된 상반된 결과의 가능한 이유로 제기^{되었습니다.} 따라서 인간 혈소판에서 TF 측정을 위한 명확한 프로토콜에 기반한 표준화된 검사법을 확립하는 것이 매우 중요합니다.

이 맥락에서 전혈류세포검사는 최소한의 샘플 취급으로 TF 양성 혈소판을 분석할 수 있는 유일한 기술로, 이 혈소판 소집의 손실을 방지하는 데 매우 중요합니다.

본 논문에서는 전혈구 유량 세포분석을 이용해 혈소판 관련 TF를 측정하는 프로토콜을 제안하며, (1) 휴식 상태에서 세포 내 단백질을, (2) 휴식 및 활성화 상태 모두에서 단백질을 평가합니다. 혈소판 풍부 혈장(PRP)에서 TF 양성 혈소판 평가가 필요할 경우 지침도 제공됩니다.

프로토콜

프로토콜은 기관 윤리 위원회(번호 70/24, CE 18.06.24)에서 승인되었으며, 모든 헌혈자로부터 서면 동의를 받았습니다. 프로토콜은 사용자가 7가지 주요 단계를 거치도록 안내합니다(그림 1). 첫 번째 단계는 혈액 채취 절차를 다룹니다. 2단계와 3단계는 피코에리트린(PE) 표지된 αCD142/HTF1 단클론 항체(mAb)를 이용한 세포내 TF 발현 분석을 위한 항체 조절 프로토콜과 샘플 준비를 설명합니다. 4단계는 αCD142/HTF1 mAb를 이용한 간접 염색법을 이용해 혈소판 표면에 노출된 단백질을 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 플루오로크롬의 입체 장애로 인해, 세포 내 염색에 사용되는 PE 표지 mAb는 표면에 노출된 단백질의 촉매 도메인에 결합하지 않습니다. 따라서 Alexa Fluor 633 표지된 2차 mAb를 이용한 간접 염색 프로토콜이 제안되었습니다. 5단계와 6단계는 유세포분석 단계에 대해 자세히 설명합니다. 마지막 단계는 대용량 혈소판 소집단의 손실을 방지하기 위해 혈소판 풍부 혈장(PRP) 제조 절차를 설명합니다. 사용된 시약과 장비의 세부 사항은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 혈액 철단

참고: 인간 혈액 채취는 윤리위원회의 승인을 받은 후에만 수행되어야 합니다.

1. 말초 정맥 주입에 영향을 받지 않는 팔, 가능하면 주관절정맥에서 말초정맥 또는 바늘 캐뉼라 샘플로 혈액 샘플을 채취하세요.
   1. 말초 정맥 샘플링의 경우, 지혈대를 적용한 후 G19 버터플라이 바늘을 정맥에 삽입한 후 혈소판 활성화를 막기 위해 지혈대를 제거하세요(그림 2).
      참고: 혈소판 활성화를 피하기 위해 G21보다 작은 버터플라이 바늘은 사용하지 마세요.
   2. 바늘 캐뉼라를 이용한 정맥 샘플링 시에는 샘플링 중 지혈대를 절대 착용하지 마십시오. 필요하다면 샘플을 0.9% 식염수로 세척한 후 채취하세요. 튜브를 채우기 시작하기 전에 항상 첫 5mL의 혈액을 버리세요.
2. 혈액 2mL를 EDTA 진공기(혈액 세포 수에 사용)에 채취하세요. 혈액과 항응고제가 완전히 섞이도록 튜브를 세 번 부드럽게 섞으세요.
3. 혈소판 관련 TF 발현을 분석하기 위해 0.129M 시트레이트 나트륨 진공체에 혈액을 채취합니다. 진공기를 지정된 농도로 조심스럽게 채워 올바른 혈액/항응고제 비율을 유지하세요. 혈전과 항응고제가 완전히 섞이도록 튜브를 다섯 번 부드럽게 뒤집어 혈전 형성과 용혈을 방지하세요.
   참고: 0.129 M 시트레이트 항응고제 사용은 αCD142 mAb의 HTF1 클론과 함께 혈소판 관련 TF의 검출을 최적화하기 위해 권장됩니다. 전혈에서 혈소판을 분리해야 한다면, 혈소판 풍부혈장(PRP) 제제를 위해 0.129M 시트레이트나트륨 진공체를 두 번째 추출합니다.
4. 진공청소기는 튜브 홀더에 똑바로 세워두세요. 회전하거나 기울어지는 판에 흔들지 말고, 공압식 운송 시스템을 피하세요. 혈소판 활성화를 막기 위해 혈액 샘플을 냉장 보관하지 마세요.
   참고: 다른 과립 관련 혈소판 활성화 지표를 TF와 함께 측정하려면 혈액 샘플을 제거 후 15분 이내에 처리하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 샘플은 채취 후 3시간 이내에 처리해야 합니다(그림 3).

2. 항TF 항체의 적정 (세포내 TF 평가를 위한 것)

참고: 세포 내 저장 TF의 결정은 PE-αCD142/HTF1 mAb를 사용하여 수행됩니다.

1. 비즈를 이용한 항체 적정
   참고: 비즈를 사용하면 적절한 항체 양(즉, 양성과 음성 샘플 간 형광 피크 간격이 가장 큰 항체 농도)을 정의할 수 있습니다. 이 분석은 두 개의 샘플을 사용하여 수행되며, 하나는 진짜 양성과 다른 하나는 완전히 음성입니다. 항체 농도는 제조사에서 보고하지 않으므로( 재료표 참조), 항체 적정은 다섯 개의 희석점을 사용해 수행됩니다.
   1. 항체를 17,000 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 5개의 항체 희석 지점을 준비하기 위해, 항체 40 μL을 튜브 1에, PBS 20 μL을 튜브 2부터 5에 피펫 주입합니다. 튜브 1에서 튜브 2로 20 μL를 전달하여 연속 4회 1:2 희석을 수행합니다.
   2. 항체 부피마다 시험관 1개를 준비해 검사하세요. 각 시험관에 음성 구슬 1방울과 양성 구슬 1방울을 추가하세요. 각 항체 희석액 20 μL을 시험관에 넣고 즉시 소용돌이로 배출하세요. 실온에서 어두운 곳에서 20분간 배양하세요.
   3. 각 튜브에 Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺가 없는 1x PBS 1mL, pH 7.4를 각 튜브와 소용돌이에 추가합니다.
   4. 제조사의 지침에 따라 유세포계에서 샘플을 확보하고, '비즈' 게이트에 10,000건의 사건 데이터를 기록하세요. 최적의 항체 농도는 양성과 음의 피크 사이에 가장 큰 분리를 제공하는 농도입니다.
2. 혈소판에 대한 항체 조절
   참고: 일반적으로 구슬을 사용해 최적의 항체 농도를 염색할 세포, 즉 전혈소판에서 확인해야 합니다.
   1. 고정
      1. 시트레이트나트륨 진공기를 부드럽게 다섯 번 뒤집어 혈액과 항응고제를 완전히 섞으세요. 50 μL의 혈액을 1.5 mL 튜브에 옮기고, 1% 파라포름알데히드(PFA)를 950 μL 첨가한 후 부드럽게 섞은 후 상온에서 90분간 배양합니다.
      2. 샘플을 1,500 x g 압력에서 5분간 브레이크를 사용하고, 실온에서 원심분리합니다.
      3. 상청액을 제거하고 1mL의 1x PBS를 Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺ 없이 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다. pH 7.4입니다.
   2. 투과화
      1. 각 항체 부피마다 한 개의 튜브를 준비하세요(비즈 적정에 따라 확인된 부피와 함께 높고 낮은 희석도, 예를 들어 5 μL일 경우 10 μL, 5 μL, 2.5 μL 검사), 그리고 형광 마이너스 1(FMO) 대조용으로 한 개의 튜브를 준비합니다.
      2. 각 튜브에 100 μL의 고정 혈액을 분사한 후, 1,500 x g 압력으로 5분간 브레이크 장치를 사용해 실온에서 원심분리합니다.
      3. 상원액을 제거하고, 0.1% Triton-PBS 100 μL 소액에 펠릿을 재현탁하여 샘플을 투과시키고, 실온에서 10분간 배양합니다.
   3. 착색
      1. 항체를 17,000 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다. 2.2.2.1에서 결정된 각 시험관에 필요한 항체 부피를 추가하고 혼합합니다.
      2. 샘플을 실온에서 어두운 곳에서 15분간 배양하세요.
      3. 각 튜브에 Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺가 없는 1x PBS 300 μL pH를 첨가하고 혼합합니다. 플로우 사이토미터에서 샘플을 확보하세요(5단계 참조).
      4. 다음 식¹⁵에 따라 얼룩 지수를 계산하세요:
                                
         여기서 MFI_pos 는 양성 사건의 평균 형광 강도, MFI_음 성은 음성의 형광 강도, SD는 음수 군단의 표준편차입니다.
      5. 가장 낮은 항체 농도를 선택해 가장 높은 염색 지수를 제공하세요.
         참고: 현재 실험 조건에서 PE-αCD142/HTF1 mAb의 최고 염색 지수는 5 μL 항체를 사용하여 달성됩니다.

3. 세포내 TF 발현의 유세포 분석용 샘플 준비

1. 전혈 고정과 투과화
   1. 세포내 TF 분석을 위해서는 2단계에서 설명한 절차에 따라 전혈을 고정하고 투과시킵니다.
2. 염색 절차
   참고: 다음 프로토콜에서는 혈소판 집단을 αCD61-PerCP 염색을 사용하여 확인합니다. 운영자의 재량에 따라 다른 개체군 표지판을 사용할 수도 있습니다.
   1. 형광 마이너스 1(FMO) 대조용으로 한 튜브와 TF 염색용 튜브 한 개를 준비합니다. 각 튜브에 표 1에 나열된 항체와 함께 고정 및 투과성 전혈 100 μL을 추가합니다.
   2. 샘플을 실온에서 어두운 곳에서 15분간 배양하세요.
   3. 각 튜브에 Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺가 없는 1x PBS 300 μL pH를 첨가하고 혼합합니다. 염색된 샘플은 유세포분석 분석(5단계 참조)까지 어두운 곳에 보관하세요.
      참고: 보상 행렬을 계산하려면 표 2에 설명된 샘플을 준비하세요.

4. 휴지 및 활성화된 혈소판에서 세포 표면 연관 TF 발현의 유동 세포 분석용 샘플 준비

참고: 세포 표면 관련 TF 검출을 위해서는 신호 검출을 위한 2차 항체로 표지되지 않은 αCD142/HTF1 mAb(1 mg/mL)와 Alexa Fluor 633 염소 항생쥐 IgG(2 mg/ml)를 사용하세요. 아데노신 5'-이인산(ADP)은 세포 표면에 TF를 노출시키기 위해 혈소판 작용제로 사용됩니다. PE 표지된 항체는 혈소판 집단 표지자로 사용되어 스필러를 최소화하며, 이는 신호 보상으로 확인됩니다.

1. TF 염색
   1. Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺ 없이 1x PBS에 αCD142/HTF1 mAb 1:100을 희석하여 pH 7.4의 작동 농도를 얻습니다. Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺ 없이 1x PBS에 1x PBS에 Alexa Fluor 633 염소 항생쥐 IgG 1:10을 희석하여 pH 7.4로 200 μg/mL의 작동 농도를 얻습니다.
   2. 세 개의 샘플 튜브를 준비하고 표 3에 표시된 대로 Ca⁺⁺와 Mg⁺⁺ 없이 pH 7.4인 1x PBS를 분사합니다.
   3. 희석된 αCD142/HTF1 mAb 7.5 μL를 분사하고 ADP 5 μL(200 μM)을 첨가하여 최종 농도는 10 μM ADP를 얻습니다. 시트레이트 진공제를 부드럽게 5번 뒤집어 혈액과 항응고제를 완전히 섞은 후, 각 튜브에 5 μL의 전혈을 분사합니다. 샘플을 부드럽게 섞으세요.
   4. 샘플을 상온에서 20분간 배양하세요.
2. 샘플 고정
   1. 각 샘플에 1% 파라포름알데히드(PFA) 300 μL를 첨가하여 고정하고, 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
      참고: 1% PFA로 고정되어 4°C에 보관된 표지된 샘플은 최대 4일간 안정적으로 보관됩니다.
   2. 각 튜브에 Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺ 없는 1x PBS 300 μL pH를 1500 x g에서 5분간 실온에서 브레이크를 사용해 추가합니다.
   3. 상원액을 제거하고 Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺ 없이 pH 7.4인 1x PBS 95 μL 용량에 부드럽게 피펫팅하여 재현탁합니다.
3. 2차 항체로 염색하기
   1. 희석된 알렉사 플루오 633 IgG 5 μL를 분사하고 샘플을 실온에서 어두운 곳에서 15분간 배양합니다.
   2. 각 튜브에 Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺ 없는 1x PBS 300 μL pH를 1500 x g에서 5분간 실온에서 브레이크를 사용해 추가합니다. 상청액을 제거하고 Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺ 없이 1x PBS 95 μL, pH 7.4에 펠릿을 재현탁합니다.
   3. 각 튜브에 5μL의 αCD41-PE를 투여합니다( 표 4 참조). 샘플을 실온에서 어두운 곳에서 15분간 배양하세요.
   4. 각 튜브에 Ca⁺⁺ 와 Mg⁺⁺가 없는 1x PBS 300 μL pH를 첨가하고 혼합합니다.
   5. 염색된 샘플은 유세포분석 검사(6단계 참조)가 끝날 때까지 어두운 곳에 보관하세요.
      참고: 보상 행렬을 계산하려면 4.1-4.3 단계와 표 5 및 표 6에 명시된 대로 샘플을 준비하십시오.

5. 세포내 TF 발현의 유동 세포 분석

참고: 다음 절차는 참조 유세포계에서의 획득을 의미합니다; 따라서 보고된 배경과 플롯은 대표성으로 간주되어야 합니다. 이 프로토콜은 모든 고감도 신세대 유세포계에 적용할 수 있습니다. 레이저 안정성을 보장하기 위해 샘플 채취 전에 유세포계를 충분히 켜세요. 혈소판이 작기 때문에 유체 및 유동 셀을 철저히 세척해야 하며, 세포 이물질이 전방 산란 영역/측면 산란 영역(FSC-A/SSC-A) 점플롯에서 혈소판 집단 시각화에 방해가 될 수 있습니다. 제조사 지침에 따라 품질 관리 비즈를 사용해 품질 관리를 수행하고, 잔여 비즈를 제거하기 위해 유체를 다시 세척하세요.

1. 획득 설정
   1. 로그 축척에 FSC-A/SSC-A 점플롯을 만들어 모든 사건을 표시합니다(그림 4A). 모든 사건을 표시하는 로그 축척에 CD61-A/SSC-A 점플롯을 만듭니다(그림 4B).
   2. PE(Y-585)와 PerCP(B690) 이득을 일일 품질 관리에 따라 조정하세요. SSC-H에서는 약 2000, PerCP(B690-H)에서는 1000으로 임계값을 설정하여 혈소판 개체수를 시각화합니다. 유량을 LOW로 설정하세요.
   3. 10³에서 10⁵ 사이의 영역인 'CD61⁺'를 그리면 혈소판 개체군을 식별할 수 있습니다.
   4. 단일 염색 제어를 획득하여 보상 매트릭스를 계산한 후 샘플을 획득합니다. "CD61⁺" 게이트 내에서 10,000개의 이벤트 데이터 파일을 기록합니다(그림 4D,E). 샘플 채취 시작 후 5-10초 후에 녹음을 시작하세요.

6. 표면 TF 발현의 유동 세포분석

1. 모든 사건을 표시하는 로그 축척에 FSC-A/SSC-A 점선을 만들고(그림 5A), 로그 축척에 CD41-A/SSC-A 점표를 작성하여 모든 사건을 표시합니다(그림 5B).
2. Alexa Fluor 633 이득과 PE(Y-585) 이득을 일일 품질 관리에 따라 조정하고, SSC-H는 약 1000, PE(Y585-H)는 2500으로 임계값을 설정하여 그림 5B에 나타난 대로 혈소판 개체군을 시각화합니다. 유량을 LOW로 설정하세요.
3. 10⁴ 와 10⁵ 사이의 영역인 "CD41⁺"를 그리면 혈소판 개체군을 식별합니다.
4. 단일 염색 제어를 획득하여 보상 매트릭스를 계산한 후 샘플을 획득합니다. "CD41⁺" 게이트 내에 10,000개의 이벤트가 포함된 데이터 파일을 기록합니다(그림 5D, E). 샘플 채취 시작 후 5-10초 후에 녹음을 시작하세요.

7. 혈소판 풍부 혈장 내 TF-양성 혈소판 분석

1. 혈소판 풍부 혈장(PRP) 준비
   참고: 혈소판 분리는 세포 활성화를 막기 위해 상온에서 수행되어야 합니다. 시약과 기기의 온도가 18 °C에서 22 °C 사이인지 확인하세요. 절차 내내 빠른 피펫팅과 격한 흔들림을 피하세요.
   1. 0.129 M 시트레이트 나트륨 진공 세척기를 부드럽게 5번 섞고, 혈구 카운터로 혈소판 수치를 두 번 측정하여 회수된 혈소판 비율을 계산하세요.
      참고: 두 측정값의 평균값을 혈소판 농도로 사용하세요.
   2. 0.129 M 시트레이트 나트륨 진공기를 100 x g 압력으로 10분간 상온에서 브레이크 없이 10분간 원심분리합니다(그림 6). 얻은 PRP를 수집하여 10mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고, 채취한 부피를 기록합니다.
      참고: 혈소판 활성화를 피하기 위해 폴리스티렌 튜브는 사용하지 마세요.
   3. 혈구 계수기를 사용해 PRP 내 혈소판을 두 번 세고 혈소판 회복률을 다음과 같이 계산합니다:
      
      참고: 회복률이 65% 미만이라면, 혈소판 수치가 전혈에서 이를 완전히 대표하지 못합니다. 준비물을 버리는 것도 고려해 보세요.
2. PRP에서 세포 내 및 표면 관련 TF 발현의 유세포 분석 샘플 준비
   1. PRP에서 세포 내 및 표면 관련 TF 발현을 분석하려면, 전혈 분석에 설명된 동일한 프로토콜을 사용하세요(3-6단계 참조).

결과

혈소판 관련 TF 발현 분석의 요약은 그림 1에 표시된 흐름도에 설명되어 있습니다. 단계에는 다음과 같은 것이 포함됩니다: (1) 혈액 채취: G19 나비 바늘이나 지혈대 없이 항응고제 함유 진공기를 사용하여 인간 말초정맥, 가능하면 주위정맥에서 혈액을 채취합니다. (2) 샘플 처리: 수행할 TF 평가 유형에 따라 샘플을 처리합니다. (3) 샘플 표지: 특정 항체로 표지합니다. (4) 유동 세포 분석: 표면 및 세포 내 세포 내 세포 내 단백질을 검출하기 위해 샘플을 분석합니다.

혈액 빼기 시에는 혈소판 활성화를 피하기 위해 특별한 주의가 필요합니다. 이를 위해 두 가지 주의사항이 지켜집니다: 바늘을 정맥에 삽입한 직후 지혈대를 제거하고, 첫 번째 진공기에서 혈액을 버리는 것입니다. 지혈대를 사용하지 않아도 FSC-A/SSC-A 점플롯에 표시된 혈소판 집단은 그림 2A에서 보듯이 전형적인 형태를 보입니다. 반대로 지혈대를 사용할 때는 혈소판 집단의 물리적 특성이 고전적 혈소판 작용제(예: ADP)로 자극한 후 관찰되는 형태와 유사한 길게 늘어진 형태를 만듭니다(그림 2B, C).

혈액 채취 후 3시간 동안 혈소판 관련 TF 발현의 안정성을 평가하기 위한 실험 결과, 3시간 동안 안정적임이 확인되었습니다(그림 3). TF 발현 측정과 P-셀렉틴 같은 혈소판 활성화 지표의 측정을 결합할 때, 혈소판 탈과립을 피하기 위해 가능한 한 빨리 혈액 샘플을 처리하는 것이 권장됩니다.

세포내 저장 TF 분석을 위해 전혈을 1% PFA로 고정하고, PBS-Triton으로 투과한 후 PE 표지된 항체로 염색합니다. 혈소판 집단은 로그 FSC-A/SSC-A 플롯(그림 4 A,D)과 αCD61 mAb 염색(그림 4 B,E)에서 확인됩니다. 건강한 대상자에서 세포내 TF 분석 결과(n = 377)는 순환 혈소판의 26.8% ± 4.8% 내에 TF가 존재함을 보여주었습니다(그림 4F).

표면 연관 TF 발현에 대한 유세포 분석은 휴식 상태와 ADP 10 μM으로 세포 자극 후 수행되었습니다. 전체 혈소판 집단은 αCD41 mAb로 표지되었으며, 로그 FSC-A/SSC-A 플롯(그림 5A,B)에서 확인되었습니다. 결과 건강한 대상자(n = 377)에서 TF는 휴식 혈소판의 2.8%± 1.4%로 발현되며(그림 5D-F), 활성화 시 최대 24.5%± 5.8%까지 증가하는 것으로 나타났습니다(그림 5G-I). TF는 가장 큰 크기를 가진 혈소판 부분집합으로 표현됩니다(그림 5D, G, 녹색 점). 더불어, 영상 유세포검사 분석 결과, TF 신호는 αCD61 양성과만 연관되며 αCD45 양성 반응과는 관련이 없음이 드러납니다(그림 7).

앞서 언급했듯이, TF는 전체 개체군 내에서 가장 큰 크기를 가진 혈소판 하위 집합에 저장됩니다. 따라서 PRP 준비 과정에서 이 혈소판 분획을 잃지 않는 것이 중요합니다. 방법 섹션(7단계)에서 제시된 적응증에 따라, PRP 내에서 전혈에 존재하는 혈소판 집단을 분리하여 대표하는 혈소판 집단을 분리할 수 있습니다. 그림 6에서 보듯, 100 x 전혈 원심분리로 얻은 혈소판 집단의 유세포 도트플롯은 FSC 분포 측면에서 전혈과 매우 유사합니다(그림 6 A, B). 반면, 문헌 12,14,16에서 자주 보고된 것처럼 더 높은 힘과 더 긴 원심분리 시간을 사용할 때, 회수된 혈소판 집단은 전혈에 비해 FSC가 낮아(그림 6C), 이는 TF가 매우 높은 양성인 더 큰 혈소판의 손실을 시사합니다.

그림 1: 혈소판 관련 TF 발현 분석 및 혈소판 분리의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

그림 2: 전혈류세포측법으로 분석한 혈소판 집단의 대표성 밀도 플롯. (A) 지혈대 없이 채취한 혈액 샘플 또는 (B) 지혈대를 사용한 혈액 샘플에서 분석된 혈소판 집단. (C) 비교를 위해 ADP로 자극된 혈소판 집단이 보고됩니다. 백혈구: 백혈구; 적혈구: 적혈구. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 세포 표면 관련 TF 발현의 시간에 따른 안정성. 혈액 철수 후 x축에 다음과 같이 보고된 휴식 혈소판의 혈소판 관련 TF 발현은 다음과 같이 분석되었습니다: T0 = 채혈 직후; T1 = 채혈 후 1시간; T2 = 채혈 후 2시간; T3 = 혈액 채취 후 3시간. 데이터는 평균 표준편± n=3으로 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 세포 내 저장 TF의 대표적인 유세포 분석 결과. 전혈 내 혈소판 집단(빨간색)은 FSC/SSC-A 점플롯(A,D)과 αCD61 mAb 염색(B,E)에서 확인됩니다. TF 발현은 PE- αCD142/HTF1 mAb(녹색 점)를 사용하여 분석합니다. 히스토그램 플롯은 음성(C)과 양성(F) 사건을 식별하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5: 표면 관련 TF 양성 혈소판의 대표적인 유세포 분석 결과. 신선한 전혈은 αCD142/HTF1 mAb로 표지한 후 1% PFA로 고정된 후 2차 mAb와 αCD41 mAb로 표지합니다. 전혈 내 혈소판 개체군(빨간색)은 FSC/SSC-A 점플롯(A, D, G)과 αCD41 mAb 염색(B, E, H)에서 확인됩니다. 휴식 상태(D-F)와 ADP 자극 후(G-I) 시의 TF 발현은 αCD142/HTF1 mAb(녹색 점)로 표지하여 정량화합니다. 음성(C)과 양성(F,I) 샘플의 대표적인 히스토그램 플롯이 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 6: 다양한 원심분리력이 PRP 준비에 미치는 영향. (A-C) 전혈소판 집단에 대한 유세포분석, PRP는 100 x g, 350 x g에서 준비됨. FSC-H/SSC-H의 혈소판 개체 수 기준 범위는 점선으로 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 7: 영상 유세포분석을 통한 혈소판 및 백혈구 내 TF 발현 평가. 밝은 영역(BF, 회색), 조직 인자(TF, 녹색), αCD61(빨간색), αCD45(회색), 호에스트(마젠타)로 염색된 핵, 그리고 합성 이미지(합쳐짐)를 60배 배율로 촬영한 대표적인 채널 이미지가 보여집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

샘플 튜브 ID	고정/고정 전혈(μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

표 1: 세포내 TF 발현의 유동 세포 분석용 염색 프로토콜.

샘플 튜브 ID	고정/고정 전혈(μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
얼룩 없는	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

표 2: 세포 내 TF 발현의 보상 기진에 대한 단일 염색 대조.

샘플 튜브 ID	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	신선한 전혈(μL)	PFA 1% (μL)
FMO	95	-	-	5	300
휴식	87.5	7.5	-	5	300
ADP 활성화	82.5	7.5	5	5	300

표 3: 표면 TF 발현의 유동 세포분석용 염색 프로토콜.

샘플 튜브 ID	PBS 1x (μL)	알렉사 플루어 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
휴식	90	5	5
ADP 활성화	90	5	5

표 4: 표면 관련 TF 분석을 위한 2차 항체 염색 프로토콜.

샘플 튜브 ID	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	신선한 전혈(μL)	PFA 1% (μL)
얼룩 없는	90	-	5	5	300
TF + 알렉사 플루어 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

표 5: 세포내 TF 분석을 위한 보상 기질 준비.

샘플 튜브 ID	PBS 1x (μL)	알렉사 플루어 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
얼룩 없는	100	-	-
TF + 알렉사 플루어 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

표 6: 표면 연관 TF 분석을 위한 보상 매트릭스 준비.

토론

이 원고는 혈소판 표면 내외에서 발현된 단백질 분석을 고려하여 전혈류세포분석을 통한 TF 양성 혈소판 평가 프로토콜을 상세히 보고합니다.

지난 20년간 인간 혈소판에서 TF의 존재가^확실하게 확인되었으며, 1,2,3,4,5,17,18이 확실합니다. 전체 순환 혈소판 집단의 20%-30%를 차지하는 일부 혈소판이 단백질을 발현하여, 이 분야에서 점점 더 중요해지고 있는 혈소판 이질성 개념을 강화합니다^19,20. TF 양성 혈소판은 이전에 고민감도 영상 유세포²에서 보인 바와 같이 평균 혈소판 부피가 높다는 점도 언급할 가치가 있습니다. 특히 TF 발현을 다른 혈액 세포 구성 요소에서 분리하여 분석해야 할 때 이 특징을 고려하는 것이 매우 중요합니다. 실제로 혈소판 분리를 위해 사용되는 원심분리 단계가 대용량 혈소판 손실을 초래할 가능성도^{있습니다.} 이 사전 분석 문제는 아마도 수년 전까지 이어졌던 논란의 주요 원인 중 하나일 것이다. 이 논란은 혈소판^{7, 12, 13}에 존재하는지에 관한 것이다. 전혈류세포검사는 이 점에서 매우 유용한 접근법으로, 모든 혈소판 소집을 분리하지 않고도 분석할 수 있게 합니다.

소판 내 TF 존재에 대한 논의를 촉진한 두 번째 이유는 분석에 사용된 항인간 TF 항체의 선택이었습니다. 혈소판 관련 TF 평가에 사용되는 상업적으로 이용 가능한 항체가 많이 있으며, 단백질의 다양한 에피토프를 인식합니다. TF9-10H10 ^3,21,22 및 VIC7 ^1,3 클론과 같은 일부 항체는 FVII/FVIIa 결합에는 영향을 주지 않고 TF의 비기능 영역에 결합합니다. VD8 ^1,2,3과 HTF1¹⁸ 클론 등 다른 항체들(현재 프로토콜에 사용된 후자)은 단백질의 촉매 부위를 인식하여 FVII/FVIIa와 결합 경쟁하여 단백질의 응고 촉진 기능을 차단합니다. 세포외 도메인의 당화 상태와 특정 조건(예: 세포 활성화 또는 질병)에서 변형될 수 있는 TF²³의 촉매 부위의 구조에 따라, 일부 항체는 유세포분석을 통해 혈소판 관련 TF의 표면 발현을 차이적으로 인식할 수 있다는 점을 유의해야 합니다. 더불어, 분석할 샘플이 신선한지, 고정되어 있는지, 또는 투과성인지 등 염색 조건도 에피토프 구성에 영향을 미치고, 따라서 항원-항체 결합에 영향을 줄^{수 있다.}

추가로 주목할 만한 점은 항체에 결합된 형광색소 선택입니다. TF는 혈소판 개체군의 20%-30%만이 발현되기 때문에, 저방출 형광색소와 저감도 유세포계 사용은 낮은 양성 신호를 구별하는 데 적합하지 않을 수 있습니다. 이 때문에 PE나 APC와 같은 밝은 형광색소로 표지된 항체가 선호됩니다. 다만, PE와 같은 형광색소의 큰 크기는 표지된 항체가 단백질에 결합하는 것을 방해할 수 있다는 점을 유의^{해야 합니다.} 이 문제를 극복하기 위해 본 프로토콜에서는 표면 TF 염색을 비접합 αCD142/HTF1 mAb로 간접 표지한 후 2차 항체를 사용하여 표지하는 방식으로 수행되었습니다. PE-steric 장애는 촉매 부위가 항체 결합에 더 쉽게 접근할 수 있는 세포 내 저장 TF에 αCD142/HTF1 mAb의 결합에 영향을 미치지 않습니다. 간접 표지보다 직접 표지로 혈소판 관련 TF의 표면 발현을 평가하는 것이 샘플 처리 시간을 단축하는 데 가능하다면, 이는 분명합니다. 그러나 이 접근법은 위에서 언급한 중요한 문제들과 단백질 자체의 구조, 염색 조건, 그리고 사용된 다양한 형광색소의 입체 장애로 인한 여러 상업용 항체의 결합 능력과 관련된 문제를 반드시 고려해야 합니다. 따라서 위음성 결과를 피하기 위해 표면 발현된 혈소판 관련 TF의 직접 표지에는 반드시 신중한 최적화 과정이 필요합니다. 이러한 측면들은 모두 사용 중인 형광색소로 표지된 다양한 상용 항체 클론을 이용한 직접 염색의 효율성을 평가하는 지속적인 연구의 주제입니다.

여러 연구에서 TF의 발현은 높은 혈전성 위험이 특징인 다양한 병리학적 조건에서 상승하는 것으로 나타났습니다: ^8,9,10,11,17. 최근에는 유세포검사 분석을 통해 정확히 정량화된 TF-양성 혈소판 수치가 아스피린과 P2Y₁₂ 길항제 약물 치료에 최적의 반응을 보였음에도 불구하고 높은 혈전성 위험을 유지하는 심혈관 환자를 식별할 수 있다는 증거가 제시되었습니다²⁵. 실제로 혈소판 관련 TF는 기능적으로 활성하여 트롬빈^{생성 1,3,4}를 지원할 수 있습니다. 이 맥락에서 몇 마이크로리터의 혈액에 대해 유세포검사 분석을 수행할 수 있는 능력은 혈소판 관련 TF 분석을 임상 환경으로 확장할 수 있게 하는 중요한 장점입니다. 이를 위해, 유세포검사를 통한 혈소판 관련 TF 측정의 검증은 최근 국제 혈액 지혈 및 혈전증 학회의 지원을 받아 조정한 국제 프로젝트의 목표였으며, 이는 평가 방법론적 지침을 제공하는 데 목적이 있습니다.

P-셀렉틴이나 혈소판-백혈구 집합체와 같은 혈소판 활성화의 다른 고전적 표지자들과 달리, 이들은 혈소판 샘플링 직후 인위물을 피하기 위해 바로 분석해야 하지만, TF 발현은 훨씬 더 안정적입니다. 실제로 혈액 샘플은 혈액 채취 후 몇 시간 내에 소판-TF 발현에 큰 변화 없이 처리될 수 있습니다; 더불어, 샘플을 고정하고 이후 라벨링/처리할 수 있는 가능성 덕분에 이 분석은 많은 병원과 실험실에서 적합합니다. 이 원고에 설명된 프로토콜은 비교적 간단하지만, 유세포검사 기술은 여전히 전문적인 기술 교육이 필요하다는 점이 주목할 만합니다. 이러한 이유로 기술은 점검(point-of-care) 검사용 점점 더 단순한 세포계 개발로 나아가고 있습니다.

결론적으로, 제안된 프로토콜은 혈소판 관련 TF의 올바른 분석 방법을 제공하며, 유세포분석 기반 기법의 장점을 강조합니다. 또한, 이 단백질의 분석에 영향을 미칠 수 있는 사전 분석 변수들을 강조하며, 이를 방지하기 위한 조치들을 강조합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아데노신 5'-디인산(ADP)	시그마-올드리치	A-2754	그리고 nbsp; 혈소판 작용제
Alexa Fluor 633 염소 및 알파 마우스 IgG	인비트로젠	A21052	2차 항체
바이오튜브 10 mL	바이오시그마	BSP048	PRP 수집을 위해
버터플라이 니들 G19	PIC 솔루션	02044019030010	혈액 수거를 위해
CytExpert 소프트웨어	벡먼 쿨터		유세포측 데이터 분석
사이토플렉스 S	벡먼 쿨터		유세포계
에펜도르프 튜브 1.5 mL	에펜도르프	1,20,086	그리고 nbsp; 혈액 고정
이미지스트림X Mk II	사이텍 바이오사이언스		영상 유세포계
칼루자 소프트웨어	벡먼 쿨터		유세포분석(플로우 셀토메트리) 데이터 분석 및 nbsp;
파라포름알데히드	항생제와 ndash; 디비시오네 카를로 에르바 레아젠티	387507	혈액과 혈소판을 정비하기 위해
PerCP-& CD45	BD	345809	백혈구 개체 표지
PerCP-& CD61	BD	347408	혈소판 소화 마커
PE-& 알파; CD142	BD	550312	항인간 조직 인자 항체
PE-& 알파; CD41	벡먼 쿨터	A07781	혈소판 소화 마커
인산염 완충 식염수(PBS) 1회 칼슘과 마그네슘 없이	깁코	10010-015	항체 및 샘플 희석에 관해
피펫 팁 10 & 마이크로; L  그리고 nbsp;	길슨	F161630	샘플을 준비하기 위해
피펫 팁 1000 & 마이크로; L	길슨	F161670	샘플을 준비하기 위해
피펫 팁 200 & 마이크로; L	길슨	F161930	샘플을 준비하기 위해
둥근 바닥 튜브 5 mL	코닝	352052	유세포계 획득을 위해
염화나트륨 0.9%	BD	306575	출혈 후 바늘 캐뉼라를 세척하기 위해
시스멕스 XN-450	다싯		혈액 세포 분석기
트리톤 X-100	카를로 에르바 레아젠티	9002-93-1	혈액 세포막을 투과시키기 위해
진공 시트레이트 0.129M 튜브	BD	363079	혈액 채취를 위해
진공 상태 K2 EDTA 튜브	BD	368857	혈액 채취를 위해
Vacutainer 다중 샘플 루어 어댑터	BD	367300	그리고 nbsp; 혈액 수거를 위해
진공 청소기 1회 사용 홀더	BD	364815	그리고 nbsp; 혈액 수거를 위해
버사컴프 항체 캡처 비즈 키트	벡먼 쿨터	B22804	항체 적정
α CD142 (클론 HTF-1)	인비트로젠	16-1429-82	항인간 조직 인자 항체