방법 논문

형광 밴딩과 45S 및 5S rDNA-FISH를 사용한 Lycoris aurea 허브 개체군의 비교 핵형 분석

DOI:

10.3791/67363

⸱

2024년 11월 29일

 ,  , 
1Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province, Huaihua University, 2College of Biological and Food Engineering, Hunan University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 결합된 PI 및 DAPI 염색체 염색, 18S-5.8-26S rRNA 유전자 영역(45S rDNA 영역)을 사용한 형광 제자리 혼성화(FISH) 및 5S 리보솜 DNA 프로브를 사용하여 Lycoris aurea (L'Her) 허브의 8개 개체군에서 헤테로크로마틴 분포를 조사합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

8개 집단의 핵형 변이를 이해하기 위해 염색체 측정, 형광 밴드 및 rDNA FISH 신호를 사용하여 상세한 핵형을 세심하게 설정했습니다. 45S rDNA 부위의 수는 개체군당 1쌍에서 5쌍까지 다양하며, 핵형당 가장 일반적인 수는 4쌍입니다. 45S rDNA 자리는 주로 염색체의 짧은 팔과 말단 영역에 위치한 반면, 5S rDNA 자리는 주로 짧은 팔과 말단 또는 근위 영역에서 발견됩니다. HBWF, HNXN, HBBD 및 HNZX 집단은 GXTL, HBFC 및 SCLS와 마찬가지로 45S rDNA 부위의 유사한 분포를 보였으며, 이는 유사한 45S rDNA 부위 분포를 가진 집단 간의 밀접한 관계를 나타냅니다. 연구된 모든 집단의 핵형은 대칭이며 안정 및 준안정 중심체 또는 배타적으로 안정적인 중심체로 구성됩니다. MCA 및 CVCL의 산점도는 핵형 구조를 효과적으로 구별합니다. 분석에는 6개의 정량적 매개변수(x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI)가 포함됩니다. 또한, 이 6가지 매개변수를 기반으로 하는 PCoA가 8개 집단 간의 생물학적 핵형 관계를 결정하는 강력한 방법임을 나타냅니다. Lycoris 집단의 염색체 수는 x = 6-8입니다. 현재 연구 및 문헌을 기반으로 이러한 개체군의 게놈 분화는 게놈 크기, 이염색질, 45S 및 5S rDNA 부위, 핵형 비대칭 측면에서 논의됩니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lycoris 는 몇 가지 중요한 원예 식물을 포함하는 가족입니다1. Lycoris aurea (L' Hér.) 향초. 오랜 역사를 가진 중국 전통 약용 식물입니다. 식물 화학 분석은 Lycoris aurea (L'Her.) 허브에는 갈란타민 및 기타 알칼로이드가 함유되어 있어 아세틸콜린 감수성을 향상시키고 콜린에스테라아제 억제제로 알츠하이머병을 치료할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다2.

고등 식물에서 핵형 분석은 유전 및 물리적 지도를 통합하는 데 중요하며 식물 생물학에 중요한 실질적 영향을 미칩니다. 이 분석을 통해 염색체 수준의 게놈 특성화, 집단 간의 세포 분류학적 관계 규명, 유전적 이상 식별, 염색체 진화 추세에 대한 이해 3,4,5를 얻을 수 있습니다. 일반적으로 핵형 설명에는 염색체 수, 절대 및 상대 염색체 길이, 1차 및 2차 수축 위치, 이색성 단편 분포, rDNA 부위 번호 및 위치, 기타 DNA 서열 특성, 핵형 비대칭 6,7,8이 포함됩니다. 핵형 매개변수 중 비대칭은 염색체 길이(염색체 간 비대칭)와 중심체 위치(염색체 내 비대칭)의 변화에 의해 결정됩니다. 핵형 비대칭은 염색체 형태를 반영하는 중요한 특징이며 식물 세포 분류학에 널리 사용됩니다 9,10,11,12.

종종 염색체 마커가 없으면 핵형 분석이 제한되고 개별 염색체의 식별이 방해됩니다. 최근 몇 년 동안 Giemsa 염색, 형광 밴딩 및 FISH(Fluorescence in situ hybridization)가 식물 염색체 분석에서 인기를 얻고 있습니다. CMA (chromomycin A3) / DAPI (4, 6-diamino-2-phenylindole) 염색 및 PI (요오드 프로필) / DAPI 염색 (CPD 염색이라고 함)과 같은 이중 형광 염색 방법은 염색체 4,13에서 GC가 풍부하고 AT가 풍부한 이색 영역을 나타냅니다. 식물 유사분열의 중기 또는 파키텐 동안, 반복되는 DNA 염기서열 또는 긴 DNA 분절은 FISH 혼성화를 통해 식물 개체군에서 특정 신호를 생성할 수 있습니다 14,15,16.

형광 밴드와 FISH 신호는 염색체 식별에 유용한 마커를 제공합니다. 염색체 길이를 측정하고, 형광 밴딩 특성을 분석하고, FISH 신호 차이를 비교함으로써 다양한 식물 생식질 또는 개체군의 상세한 분자 세포유전학적 핵형을 구성할 수 있습니다. 이러한 핵형은 다양한 생식질 또는 집단에서 염색체 형태를 효과적으로 표시하여 헤테로크로마틴 분포 및 DNA 염기서열 국소화를 비교하고 추가 연구를 장려할 수 있습니다 4,8,17. 분자 세포유전학적 핵형 비교는 관련 집단의 계통발생학적 관계와 염색체 진화에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다 8,14,18,19.

Amaryllis 계통의 다양하고 흥미로운 그룹 인 Lycoris 속은 다년생 구근으로 유명합니다. 약 20종으로 구성되어 있으며 그 중 15종은 중국 고유종으로 풍부한 생물 다양성을 보여줍니다. 이 속은 중국 남서부, 한국 남부, 일본을 포함한 동아시아의 따뜻한 온대 및 아열대 지역에서만 발견되며 일부 개체군은 인도 북부와 네팔까지 확장됩니다20. 초기 세포유전학 연구는 주로 Lycoris radiata21에 초점을 맞춰 속의 기본 염색체 번호를 확립하고 특정 집단의 염색체 형태를 설명하기 위해 염색체 계수를 포함했습니다. 이 속에서 관찰되는 총 염색체 수는 12에서 33 또는 44 사이이며 각각 이배체, 비정상 이배체, 삼배체, 사배체 및 이수체 수준을 나타냅니다. 기본 염색체 번호 x는 6, 7, 8, 11입니다.

Lycoris aurea (L' Hér.) Lycoris 속의 주목할만한 종인 허브는 중국 전역에 널리 분포합니다22. 편안하고 습한 환경에서 번성하며 작은 구근을 통해 번식합니다. 리코린(lycorine)과 갈란타민(galantamine)을 함유한 이 구근은 두 가지 주요 의약 화합물로, 수 세기 동안 중국 전통 의학에서 사용되어 왔습니다. Lycoris aurea 는 또한 가을에는 눈에 띄는 붉은 꽃, 겨울에는 상록수 잎으로 원예가를 사로 잡습니다. 그러나 연구된 모든 Lycoris aurea (L'Hér.) 허브 개체군은 기존의 세포학적 방법을 사용하여 염색체를 식별하는 데 중요한 문제를 제기합니다.

핵형 분석(metaphase analysis) 23,24,25, 비교 세포유전학적 분석(comparative cytogenetic analysis) 26,27, 세포유전학적 맵 구성(cytogenetic map construction)28,29, 염색체 특이적 분석(chromosome-specific assay) 30에 반복적인 DNA 염기서열 및 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한 FISH, fosmid 또는 BAC(박테리아 인공 염색체)의 클로닝이 사용되었다. 최근에는 FISH 기법이 Lycoris 집단31의 염색체 분석에 적용되었습니다. 염색체 수와 핵형은 Lycoris 집단에서 다양하지만 총 염색체 수는 일정하게 유지되며 중앙 중심체 염색체(M-), 원위 중심체 염색체(T-) 및 근위 중심체 염색체(A-)의 세 가지 기본 유형이 관찰됩니다. 또한, 자연 개체군에서 다양한 염색체 모양과 크기가 관찰됩니다32.

RNA 형광 in situ hybridization(FISH)은 중심체 융합, 반전, 유전자 증폭 및 단편 삭제와 같은 염색체 변화를 감지하는 데 유용합니다. RNA-FISH(Fluorescence In Situ Hybridization) 기술을 통해 염색체의 고해상도 시각적 분석을 통해 염색체 중심 영역의 융합, 새로운 염색체 구조의 형성, 염색체 영역의 역전, 유전자 또는 유전자 단편의 증폭, 특정 염색체 영역의 유전자 서열 손실을 포함한 여러 복잡한 변화를 감지하고 식별할 수 있습니다33. 500개의 클론 중 5개는 중심 중심체 염색체(M-)의 중심체 영역에서는 강한 FISH 신호를 보였지만 원위 중심체 염색체(T-)에서는 그렇지 않았습니다 34. 각 염색체의 고유한 FISH 신호 분포 패턴으로 인해 이전에는 전통적인 염색 방법을 사용하여 Lycoris 집단에서 어려웠던 개별 염색체를 식별할 수 있었습니다31. 현재 Lycoris aurea (L'Hér.)의 분자 세포 유전학에 대한 연구는 거의 없습니다. Herb는 이 분야에 대한 추가 연구가 시급히 필요하다고 강조했습니다.

이 연구에서는 Lycoris aurea (L'Hér.)의 8개의 잘 분화된 중기 염색체를 발견했습니다. 허브 개체군은 효소 침지 및 화염 건조(EMF) 방법을 사용하여 준비되었습니다. FISH 식별을 위해 CPD 염색과 45S 및 5S rDNA 프로브를 사용했습니다. 이러한 집단의 상세한 분자 세포유전학적 핵형은 염색체 측정, 형광 띠, 45S 및 5S rDNA FISH 신호의 결합된 데이터를 사용하여 구성되었습니다. 이들 간의 핵형 관계를 식별하기 위해 각 모집단에 대해 6개의 서로 다른 핵형 비대칭 지수를 계산했습니다. 분자 세포유전학적 핵형 데이터의 평가는 8개 집단의 게놈 분화 및 진화 관계에 대한 중요한 통찰력을 제공하여 잠재적으로 Lycoris 염색체에 대한 이해를 재구성할 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 자세히 설명되어 있으며, 사용된 프로브는 보충 파일 1에 제공됩니다.

1. 정점 염색체의 준비

  1. 수경법으로 뿌리를 내리십시오. 전구의 지상 부분을 제거한 후 물을 채운 테이퍼 형 병에 넣고 Song et al.35에 설명 된 방법에 따라 3 일마다 물을 교체합니다.
  2. 활발하게 성장하는 뿌리 끝은 길이가 약 1.0-2.0cm에 도달 할 때 절제하고 포화 α-브로 모나 프탈렌에서 처리하십시오 28 ° C에서 1.0 시간 동안.
  3. 뿌리 끝을 약 1cm로 자르고 갓 준비한 메탄올과 빙초산의 혼합물에 실온(약 20-25°C)에서 2-3시간 동안 3:1 부피 비율로 놓습니다. 그런 다음 She et al.36에 설명된 대로 4°C의 냉장고에 보관하십시오.
  4. 고정된 뿌리 끝(2-3mm)을 이중 증류수로 철저히 씻으십시오.
  5. pH 4.5에서 0.01mM 구연산-구연산나트륨 완충액에 셀룰라아제와 펙틴 가수분해효소의 혼합물을 준비하고 셀룰라아제와 펙틴 가수분해효소는 각각 1%입니다. 사전 처리된 뿌리 끝을 혼합물에 넣고 28°C에서 1.0-1.5시간 동안 분해합니다.
  6. 소화된 뿌리 끝을 이중 증류수로 씻고 유리 슬라이드에 옮기고 가늘고 뾰족한 집게를 사용하여 정착물로 철저히 으깬다.
  7. 물 안개가 사라질 때까지 알코올 램프의 불꽃 위에서 슬라이드를 건조시킵니다. 위상차 현미경에서 5개 이상의 분할 위상이 있고 겹치는 염색체가 없는 슬라이드를 선택합니다. 나중에 사용할 수 있도록 슬라이드를 -20°C에서 보관하십시오.

2. CPD 염색

  1. PI 농도가 0.6 μg·mL-1 이고 DAPI 농도가 3 μg·mL-1인 30%(v/v) 항형광 감쇠기에 PI 및 DAPI를 첨가하여 CPD 용액을 준비합니다.
  2. 염색체 슬라이드를 65°C에서 30분 동안 건조시킵니다.
  3. 염색체 슬라이드당 100μL의 RNase A 희석제(2x SSC(구연산식염수 나트륨)로 100배 희석된 RNase A 저장 용액을 추가하여 최종 농도 100μg/mL를 생성합니다. 슬라이드를 덮고 37°C의 습한 챔버에서 30-60분 동안 데웁니다.
  4. 염색체 슬라이드를 실온에서 각각 5분씩 3회 간격으로 2x SSC로 세척합니다.
  5. 염색체 슬라이드를 실온에서 1-2분 동안 세척합니다.
  6. 염색체 슬라이드당 200μL의 펩신 희석제(0.01N HCl로 100배 희석하여 최종 농도 5μg/mL를 달성한 펩신 저장 용액)를 추가합니다. 슬라이드를 덮고 37°C의 습한 챔버에서 5-20분 동안 배양합니다.
  7. 염색체 단면을 실온에서 초순수로 2분 동안 세척한 다음 실온에서 각각 5분씩 2회 간격으로 2 xSSC로 세척합니다.
  8. 슬라이드를 메탄올: 빙초산(3:1) 용액으로 10분 동안 고정합니다.
  9. 실온에서 2x SSC로 각각 5분씩 3회 간격으로 세탁합니다.
  10. -20°C에서 70%, 95%, 100% 에탄올로 각각 5분씩 처리한 후 실온에서 건조시킵니다.
  11. 처리 및 건조된 염색체 슬라이드를 가져와서 각 슬라이드에 30μL의 CPD 염색 용액을 추가하고 24mm x 50mm 커버슬립으로 덮고 어둠 속에서 30분 이상 염색합니다. 광범위한 염색체 물질은 밤새 염색해야 합니다.
  12. PI 염색을 위한 녹색 여기 필터(WG)와 DAPI 염색을 위한 자외선 필터(UV)를 사용하여 형광 현미경으로 염색체 슬라이드를 관찰합니다. 호환 가능한 소프트웨어로 이미지를 캡처합니다.
    1. 두 필터를 통해 노출 시간을 조정하여 이미지를 캡처하는 동안 유사한 적색 및 청색 형광 강도를 얻을 수 있습니다. CPD 이미지는 PI 및 DAPI로 염색된 회색조 이미지에서 얻습니다. 염색체 측정 및 이미지 처리는 Adobe Photoshop 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

3. 형광 현장 교잡

  1. FAD(10 μL), ssDNA(2 μL), 20× SSC(2 μL), 5S rDNA(1 μL), 45S rDNA(1 μL) 및 50% 글루칸 설페이트(4 μL)의 하이브리드 용액을 준비합니다. 준비 후 하이브리드 용액(2500 x g, 5-10분, 실온)을 원심분리하여 얼음 위에 놓습니다.
  2. 스캔한 슬라이드를 65°C의 오븐에 30-60분 동안 넣습니다.
  3. 베이크된 슬라이드를 제거하고, 100μL의 70% FAD 변성 용액을 첨가하고, 커버 유리로 덮고, 85°C 분자 혼성로에서 2.5분 동안 변성시킵니다.
  4. 커버 유리를 제거하고 즉시 슬라이드를 70%, 90% 및 100% 차가운 에탄올에 담그고 각각 5분 동안 연속적으로 탈수합니다.
  5. 슬라이드를 제거하고 실온에서 30분 이상 건조시킵니다.
  6. 슬라이드에 20μL의 하이브리드 용액을 추가하고 액체가 완전히 확산될 때까지 커버 유리를 위에 부드럽게 놓고 슬라이드의 덮인 부분을 촉촉하게 하기 위해 10분 동안 실온에 둡니다.
  7. 2× SSC로 적신 하이브리드 접시에 슬라이드를 넣고(하이브리드 접시는 빛을 피해 쉽게 작동할 수 있도록 주석 호일로 감싼 뚜껑이 있는 큰 페트리 접시여야 함) 37°C에서 밤새 배양합니다(최소 6시간 동안).
  8. Vectashield H-100의 30%(v/v) 용액에 3 μg·mL-1 DAPI를 장착하여 염색체를 상쇄합니다. 필터의 보라색 빛에 의해 여기되는 DAPI의 파란색 형광과 녹색 빛에 의해 여기되는 PI의 빨간색 형광으로 호환 가능한 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
    참고: FISH 혼성화는 She et al.36에 의해 기술된 방법에 따라 이전에 CPD 염색된 슬라이드에서 45S 및 5S rDNA 프로브를 사용하여 수행되었습니다.

4. 핵형 분석

  1. She et al.4에 설명된 방법론에 따라 염색체가 잘 분산되고(겹치지 않음) 적당히 응축된(염색체가 최대로 응집되어서는 안 되지만 말단이 함께 뭉쳐서는 안 됨) 각 집단에 대해 5개의 중기 유사분열 세포를 선택합니다.
  2. 세포 분열 중 농도가 가장 높은 5개의 염색체를 선택하여 각 염색체의 절대 길이를 결정합니다.
  3. 각 염색체의 긴 팔(L)과 짧은 팔(S)의 길이와 염색체의 각 형광 색소 띠의 크기를 꼼꼼하고 정확하게 측정합니다.
  4. 다음 매개 변수를 계산하십시오 : (1) 상대 염색체 길이 (RL, 반수체 백분율); (2) 팔 비율 (AR = L / S, 긴 팔 / 짧은 팔); (3) 총 반수체 염색체 길이 (TCL; 핵형 길이); (4) 평균 염색체 길이 (C); (5) 형광 밴드의 크기(염색체의 길이에 대한 형광 밴드의 백분율); (6) 중심체에서 rDNA 부위까지의 거리; (7) 평균 중심체 지수 (CI, 각 염색체의 짧은 팔 길이를 해당 염색체의 총 길이로 나눈 값으로 계산 한 다음이 값의 평균으로 계산); (8) 중심체 지수(CVCI), 변동 계수(CV), 염색체 길이 변동 계수(CVCL), 평균 중심체 비대칭 계수(MCA) 및 스테빈스 비대칭 범주를 포함한 핵형 비대칭의 4가지 지표.
    참고: Paszko10 및 Peruzzi et al.11 의 방법을 참조하여 비대칭 지수를 계산합니다. Levan의 5가지 분류 방법에 따라 팔 비율이 다른 염색체를 분류합니다. Lycoris aurea (L'Hér.)의 염색체를 배열합니다. Han et al. 프로토콜37에 설명된 대로 길이의 내림차순으로 된 허브.
  5. 형광 밴드 정보와 결합된 염색체 측정 데이터, rDNA-FISH의 위치 및 크기를 기반으로 염색체 핵형 패턴을 그려 방법론의 정밀도와 정확성을 보장합니다.
  6. 8개 개체군의 핵형 비대칭 관계를 시각화하는 것은 명확한 통찰력을 제공하는 핵심 단계입니다. 이는 MCA 및 CVCL을 얻는 데 사용되는 2차원 산점도를 통해 달성됩니다.
  7. She et al.38의 방법에 따라 중요한 구성 요소인 Gower 유사성 계수를 사용하여 주좌표 분석(PCoA)을 수행합니다.
  8. 6개의 정량적 매개변수(x, 2n, TCL, MCA, CVCL, CVCI)를 계산하여 8개 집단의 세포유전학적 핵형을 결정합니다.
  9. 데이터 분석 및 시각화 프로그램을 사용하여 통계 분석을 수행하여 UPGMA 기반 덴드로그램 및 PCoA 산점도를 생성합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세심한 효소 침지 및 화염 건조(EMF) 방법을 사용하여 Lycoris aurea (L'Hér.)의 흩어지고 잘 분화된 중기 염색체를 사용합니다. 허브를 얻어 Lycoris aurea 의 세포유전학적 염색체 핵형을 구성했습니다(그림 1). 응축 정도가 가장 높은 중기 염색체는 형태학적 차이가 감소하여 핵형 분석에 적합하지 않습니다. 그러나 반수체 염색체(TCL)의 총 길이는 개체군 간에 비슷하기 때문에 TCL 값의 차이를 비교함으로써 서로 다른 Lycoris aurea 개체군의 핵형을 구별할 수 있습니다. Lycoris aurea 의 8개 개체군의 핵형 특성과 핵 DNA 함량은 표 1에 나와 있습니다. 형광 밴드의 분포와 45S 및 5S rDNA 부위의 위치는 표 2에 나와 있습니다. 그림 2 는 형광 밴딩 특성과 함께 염색체의 측정값과 45S 및 5S rDNA FISH 신호의 위치 및 크기를 보여줍니다.

이배체 염색체 번호는 다음과 같습니다: GXTL의 경우 2n = 16 = 8m + 8t, HBFC의 경우 2n = 14 = 8m + 6t, GZDS의 경우 2n = 14 = 8m + 6t, HNZX의 경우 2n = 16 = 6m + 10t, HBBD의 경우 2n = 14 = 8m + 6t, HBWF의 경우 2n = 16 = 6m + 10t, SCLS의 경우 2n + 1 = 15 = 7m + 8t입니다(표 1). She et al.4에 의해 프로토콜에 기술된 바와 같이, 8개의 L. aurea 집단의 중기 염색체는 작으며, 평균 염색체 길이는 1.01μm(HNZX)에서 2.08μm(GZDS) 사이이고 TCL은 16.14μm(HNZX)에서 29.13μm(GZDS) 사이입니다. 8개 집단의 TCL은 보고된 핵 DNA 함량과 상관관계가 있습니다(표 1). 가장 작은 상대 길이 범위(RRL)는 HNXN(1.52-3.81)에서 관찰되고 가장 큰 것은 GZDS(2.73-5.86)에서 관찰됩니다. 집단 HNXN과 GZDS는 각각 염색체 길이에서 가장 작은 변화와 가장 큰 변화를 보였습니다. 게놈의 평균 중심체 지수(CI)는 61.02± 5.63(집단 HBFC)과 70.70 ± 4.63(집단 HBWF) 사이에서 다양했습니다. 개체군 HBFC는 중심체질량 지수에서 가장 적은 변화를 보인 반면, 개체군 HBWF는 가장 광범위한 변화를 보였다.

핵형은 메타중심(m) 염색체와 텔로중심(t) 염색체로 구성됩니다(표 1; 그림 2)는 연구된 8개 집단 중 가장 흔한 염색체 형태를 나타냅니다. 8개의 서로 다른 핵형 비대칭 지수가 표 1에 나와 있습니다. 이러한 지표 중 중심체 변동 계수(CVCI) 및 평균 중심 비대칭(MCA)은 염색체 내 비대칭을 특성화하는 반면, 염색체 길이 변동 계수(CVCL)는 염색체 간 비대칭을 측정합니다. CVCI 및 MCA의 범위는 CVCI = 10.97(HBBD)에서 18.25(HBWF)까지, MCA = 28.85(HNZX)에서 39.30(HBWF)까지입니다. 이러한 값은 HBBD가 가장 낮고 HBWF가 염색체 내 비대칭이 가장 높다는 것을 일관되게 나타냅니다. CVCL의 범위는 14.98(GZDS)에서 23.32(HBWF)로, GZDS는 가장 비대칭적인 핵형을 나타내는 반면 HBWF는 8개 집단 중에서 가장 비대칭적인 핵형을 나타냅니다. Stebbins9의 분류 원칙에 따르면, 이러한 핵형은 클래스 1B에 속하며, 이는 연구된 모든 집단이 상대적으로 대칭적인 핵형을 가지고 있음을 나타냅니다.

8개의 Lycoris aurea (L'Hérit.) 사이의 핵형 비대칭 관계 허브 개체군은 CVCI 대 CVCL 및 MCA 대 CVCL의 2차원 산점도를 사용하여 설명됩니다(그림 3). CVCI, CVCL 및 MCA의 세 쌍의 매개변수에 의해 밝혀진 바와 같이 이러한 집단의 핵형 구조는 중요한 의미를 갖습니다. 이러한 매개변수는 유사한 핵형 비대칭을 보여줍니다. 산점도의 결과는 연구의 잠재적 영향을 강조하며, 개체군 HNXN이 가장 대칭적인 핵형을 가지고 있는 반면, 개체군 HBFC 및 HBWF는 각각 가장 많은 염색체 내 및 염색체 간 비대칭을 나타낸다는 것을 보여줍니다(그림 3).

이 연구는 5개의 핵형 매개변수가 있는 UPGMA 트리 다이어그램을 기반으로 8개의 Lycoris aurea 개체군을 3개의 주요 그룹으로 꼼꼼하게 분류했습니다(그림 4). 모집단 SCLS로 표시되는 첫 번째 클러스터는 독립적인 군집을 형성합니다. 두 번째 그룹은 HNXN과 HBWF로 구성됩니다. 세 번째 군집은 두 개의 하위 그룹으로 나뉩니다: 하나는 집단 HBFC만 포함하고, 다른 하나는 집단 HBWF, GZDS 및 GXTL을 포함하며, 모집단 HBBD 및 GZDS는 더 작은 분기에 군집합니다. 주좌표분석(PCoA)에 의해 밝혀진 연구된 집단 간의 핵학적 관계는 그림 5에 설명되어 있습니다. PCoA 산점도는 8개의 모집단을 68.36%의 신뢰 수준으로 두 그룹으로 나눌 수 있음을 나타냅니다. 첫 번째 그룹에는 HBWF, HBBD 및 GXTL이 포함되며, 앞의 세 개체군은 밀접하게 함께 군집합니다. 두 번째 그룹은 HBFC, HNXN, HNZX 및 SCLS로 구성되며, 여기서 HBFC는 두 그룹 사이의 중간 위치를 차지하고 SCLS는 가장 고립된 위치에 있습니다(그림 5).

CPD(요오드화 프로피듐과 DAPI의 조합) 및 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌) 역 염색은 핵 구조 및 염색질 분포를 관찰하는 데 사용되는 표준 기술입니다. 이 연구의 결과는 Lycoris aurea (L'Hérit)의 8개 개체군에서 명백한 이염색질 현상을 밝혔습니다. 허브(그림 1 및 그림 2; 표 2). 각 집단에 대한 FISH 혼성화 결과는 모든 염색체 영역이 45S 및 5S rDNA 유전자좌에 해당함을 나타냅니다. CPD 대역의 특성은 그림 1A, C, E, G, I, K, M, O에 나와 있습니다.

집단 HBFC 및 HBBD에서, CPD 띠는 중심체 및 중심주위 영역에서 관찰되었다(그림 1G,K; 그림 2D,F). 그러나 특정 염색체는 CPD 밴드를 나타내지 않았습니다: SCLS의 3번째 및 8번째 염색체, HNXN의 1번째 염색체, HNZX의 1번째 염색체, HBWF의 1번째 염색체, GZDS의 2번째 염색체, GXTL의 2번째 염색체(그림 1A,C,E,I,J,M,O; 그림 2A-C,E,G,H). 특히, CPD 띠는 SCLS 및 HNXN의 5, 6, 7번 염색체 쌍의 짧은 팔 말단에서, HNZX의 4, 5, 6, 7, 8 쌍에서, HBFC의 5, 6, 7 쌍에서도 발견되었습니다. 또한, CPD 밴드는 HBWF에서 염색체 4, 5, 6, 7 및 8의 짧은 팔 끝, HBBD에서 염색체 5, 6 및 7의 짧은 팔 끝, GXTL에서 염색체 5, 6, 7 및 8의 짧은 팔 끝에 존재했습니다(그림 1A 및 그림 2A).

FISH 혼성화 후 DAPI 역염색은 GZDS에서 염색체 5, 6, 7의 중심 입자 주위에 밝은 형광 띠를 형성했습니다. post-FISH DAPI+ 밴드라고 하는 이러한 밴드는 이러한 헤테로크로마틴 영역에 많은 수의 A-T 염기쌍이 포함되어 있음을 나타냅니다(그림 2G). 8개 집단에서 관찰된 (주)중심성 CPD 대역의 범위는 25.00%에서 57.14%였으며(표 2), 말단 CPD 대역의 총량은 40.00%에서 71.43%였습니다(표 2). 집단 GZDS에서 FISH 이후 DAPI+ 띠는 핵형 길이와 상관관계가 있어 전체의 42.86%를 차지했습니다. FISH 이후 rDNA CPD 밴드, 비-rDNA CPD 밴드 및 DAPI+ 밴드의 크기는 Lycoris aurea (L'Hérit)의 다양한 염색체 쌍 간에 크게 달랐습니다. 허브(그림 2; 표 2).

FISH 기술은 그림 1과 같이 45S 및 5S rDNA 프로브를 CPD 염색 염색체에 삽입하는 데 사용되었습니다. Lycoris aurea (L'Hérit)의 8개 개체군에서 45S 및 5S rDNA 부위의 수와 위치에 대한 요약입니다. 허브는 표 2 에 제시되어 있으며 그림 2에 나와 있습니다. 특히, 8개 집단 간의 rDNA 유전자좌의 수, 크기 및 위치의 상당한 차이는 이러한 발견의 중요성을 강조합니다. 총 8개 집단에 걸쳐 30개의 45S rDNA 유전자좌가 있었습니다. 이 중 4개의 유전자좌(13.33%)는 중앙 중심체 영역에, 9개(30.00%)는 중앙 근 중심체 영역에, 17개(56.67%)는 각 염색체팔의 말단 영역에 위치했습니다(그림 2; 표 2).

GXTL 집단에서 1개의 45S rDNA 유전자좌 신호는 4번 염색체의 짧은 팔의 중심체 영역에서 발견되었으며, 4개의 추가 신호는 5, 6, 7 및 8번 염색체의 장팔의 중심체 영역에서 발견되었습니다(그림 1P; 그림 2G). HBFC 집단에서 하나의 45S rDNA 유전자좌는 염색체 4의 짧은 팔에 있는 중심체 영역에 위치했으며, 염색체 5, 6 및 8의 짧은 팔에 있는 중심주위 헤테로염색질 영역에서 3개의 유전자좌가 발견되었습니다(그림 1H; 그림 2D). GZDS 집단에서 45S 유전자 자리는 메타센트릭 염색체 4의 짧은 팔의 중심체 영역에 위치했습니다(그림 1N; 그림 2G). HNZX에서는 염색체 쌍 4, 5, 6, 7 및 8의 짧은 팔의 말단 영역에서 5개의 45S rDNA 유전자좌가 관찰되었습니다(그림 1H; 그림 2D). HBBD에서 45S 부위의 분포(그림 1J; 그림 2E) 및 HNXN(그림 1L; 그림 2F) 염색체 4의 짧은 팔의 중심체 영역에 있는 하나의 유전자좌와 염색체 5, 6, 7의 짧은 팔의 중심체 영역에 있는 세 개의 유전자좌가 비슷했습니다.

HBWF에서 5개의 45S rDNA 유전자좌 신호가 염색체 쌍 4, 5, 6, 7 및 8의 단팔 중심체 영역에서 나타났습니다(그림 1N; 그림 2G). SCLS에서 하나의 45S rDNA 유전자좌 신호는 염색체 쌍 1과 2의 단팔 중심체 영역과 염색체 쌍 5와 6의 단팔의 중심주위 영역에서도 발견되었습니다(그림 1P; 그림 2H). 5S rDNA 유전자좌의 경우, 8개 분류군에서 총 9개가 확인되었으며, 3개(33.33%)는 근위 영역에, 3개(33.33%)는 주변 영역에, 3개(33.33%)는 각 염색체팔의 말단 영역에 위치했습니다(그림 2; 표 2). GXTL에서 하나의 5S rDNA 유전자좌 신호가 염색체 쌍 6의 긴 팔의 말단 끝 근처에서 나타났습니다(그림 1P; 그림 2G). 5S 부위의 분포는 HBFC에서 유사했습니다(그림 1H; 그림 2D) 및 GZDS(그림 1N; 그림 2G), 둘 다 염색체 7의 짧은 팔의 근위 영역에 하나의 5S rDNA 유전자좌를 포함합니다. HNZX에서 5S rDNA 유전자 자리는 8번 염색체의 긴 팔의 말단 근처에서 발견되었습니다(그림 1H; 그림 2D), HBBD에서는 염색체 7에서 5S rDNA 자리가 확인되었습니다(그림 1J; 그림 2E). HBWF에서 두 개의 5S rDNA 유전자좌가 4번 염색체와 8번 염색체의 긴 팔 말단 부근에서 나타났고, 두 개는 염색체 7번 염색체의 긴 팔에서, 하나는 중심체 영역에서, 다른 하나는 끝 부근에서 나타났다(그림 1N; 그림 2G).

말단 CPD 분절 특성과 함께 45S 및 5S rDNA FISH 신호의 조합은 Lycoris aurea (L'Hérit)의 다른 집단에서 모든 유사분열 염색체를 효과적으로 구별했습니다. 향초. SCLS, HBFC, HBBD, GZDS 및 GXTL 집단에서 염색체 1은 중심체 영역에서 강한 CPD 신호를 보였습니다. 염색체 2는 GZDS 및 GXTL을 제외하고 중심 영역에서 강한 CPD 신호를 표시했습니다. 염색체 3은 SCLS를 제외한 중심영역에서 강한 CPD 신호를 보였습니다. 염색체 4는 중심체 영역에서 일관되게 강한 CPD 신호를 나타냈습니다. 염색체 5, 6, 7의 경우, 짧은 팔 끝에서 강한 CPD 신호가 관찰되었습니다. 염색체 4는 또한 짧은 팔 끝에서 강한 45S rDNA 신호를 보인 반면, 염색체 5와 6은 GZDS를 제외한 말단 영역에서 강한 45S 신호를 보였습니다. 특히, GZDS 집단에서 강력한 DAPI 신호가 존재했습니다. 또한 HBFC, HBWF, HBBD 및 GZDS 집단에서 7번 염색체의 근위 영역에서 약한 5S rDNA 신호가 나타났습니다.

figure-results-1
그림 1: 8개의 Lycoris aurea (L' Hér.)의 유사분열 염색체 허브 개체군. 8개의 서로 다른 Lycoris aurea(L' Herit.)의 유사분열 중기 염색체 검사 모집단 SCLS(A,B), 모집단 HNXN(C,D), 모집단 HNZX(E,F), 모집단 HBFC(G,H), 모집단 HBWF(I,J) 및 모집단 HBBD(K,L)를 포함한 허브 개체군이 표시됩니다. CPD 염색 후 비오틴 표지 45S 및 디곡신 표지 5S rDNA 프로브와 함께 FISH를 사용하여 GZDS(M,N) 및 GXTL(O,P)의 혼성화를 수행했습니다. CPD 염색 후 염색체의 결과 이미지는 45S(녹색) 및 5S(빨간색) rDNA 신호를 표시합니다. 총 DNA를 DAPI 염료로 역 염색하여 파란색을 얻었습니다. 스케일 바 = 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 8개의 Lycoris aurea (L' Hér.) 허브 개체군. Lycoris aurea (L' Herit.)의 8개 개체군에 대한 염색체 패턴 다이어그램 Herb는 45S 및 5S rDNA FISH 신호의 위치 및 크기와 함께 형광 밴드 특성을 나타냅니다. 모집단 SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS 및 GXTL은 각각 (A-H)로 표시됩니다. 세로좌표 척도는 염색체의 상대적 길이(반수체 게놈에서 해당 염색체의 비율)를 나타내고 상단의 숫자는 염색체의 일련 번호를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 8개의 Lycoris aurea(L' Hér.)에 대한 산점도 세 가지 핵형 매개변수를 기반으로 한 허브 개체군. (A) CVCI 지수는 CVCL 지수에 대해 표시됩니다. (B) MCA 지수는 CVCL 지수에 대해 표시됩니다. 개체군 SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS 및 GXTL이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 8개의 Lycoris aurea(L' Hér.) 허브 개체군. UPGMA 덴드로그램은 8개의 Lycoris aurea(L' Hér)에 대한 매개변수 x, 2n, TCL, MCA, CVCL 및 CVCI를 기반으로 합니다. 허브 개체군: SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS 및 GXTL. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 8개의 Lycoris aurea(L' Hér.) 6 개의 핵형 매개 변수를 기반으로 한 허브 품종. PCoA는 SCLS, HNXN, HNZX, HBFC, HBWF, HBBD, GZDS 및 GXTL을 나타내는 매개 변수 x, 2n, TCL, MCA, CVCL 및 CVCI를 기반으로 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: Lycoris aurea (L' Hér.) 8개의 이름 허브 개체군. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 여덟 개의 Lycoris aurea(L' Hér.)에서 형광 색소 띠 및 rDNA 부위의 분포 허브 개체군. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 이 연구에 사용된 프로브. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lycoris aurea (L' Hér.)의 준비 허브 뿌리 염색체는 다음과 같은 몇 가지 중요한 단계를 포함합니다: (1) 수경법을 통한 뿌리 배양, (2) 뿌리 끝을 포화 α-브로모나프탈렌으로 처리, (3) 알코올-아세트산 용액을 사용하여 뿌리 고정, (4) 효소 용액으로 뿌리 끝에 효소 가수분해 수행, (5) 소화된 뿌리를 철저히 으깨고 알코올 램프 불꽃 위에서 슬라이드를 건조.

정확한 염색체 측정은 세포유전학 연구에서 핵형 분석에 필수적입니다. 염색체는 눈에 띄는 응축과 명확하게 정의된 경계를 보여야 합니다. 그렇지 않으면 염색체 매개변수를 정확하게 계산하는 것이 어려워집니다5. 이전의 세포 유전 학적 연구는 유사 분열 염색체의 형태 학적 분화가 응축 정도에 따라 달라진다는 것을 보여주었습니다 4,36. 응결이 충분하지 않은 경우 염색체팔의 끝이 여전히 재화되어 염색체 경계가 불분명해질 수 있습니다. 그러나 염색체가 최대 응축에 도달하면 염색체 간의 형태학적 차이가 감소합니다. 따라서 적당히 응축된 염색체를 선택하는 것은 특히 염색체가 적은 집단에서 염색체 식별 및 측정에 중요합니다.

프로브 라벨링은 성공적인 FISH in situ hybridization, 특히 5S rDNA 프로브 솔루션의 경우 매우 중요합니다. 5S rDNA의 짧은 염기서열로 인해 PCR에 의해 표지된 표적 염기서열의 농도는 일반적으로 낮아 약한 혼성화 신호로 이어집니다. 그러나 플루오레세인 표지 프로브를 직접 합성하면 더 강력한 혼성화 신호가 생성되고 공정이 단순화됩니다. 45S rDNA 프로브 용액의 경우, 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나의 5.8S, 18S 및 25S rRNA 코딩 영역의 부분 염기서열을 5' 및 3' 말단에서 6-카르복실-테트라메틸 로다민(TAMRA)으로 라벨링한 후 혼합했습니다. 플루오레세인 5S rDNA 프로브 용액은 애기장대 5S rRNA 유전자 코딩 영역에서 1-59 및 60-118 뉴클레오티드 서열을 사용하여 얻었으며, 각 서열은 5' 말단에 6-카르복실 플루오레세인(6-FAM)으로 표지된 후 혼합되었습니다.

이 연구에서는 DNA 결합에서 DAPI 염료와 PI 염료의 차이점을 활용하고 이를 결합하여 명확한 형광 띠를 얻었습니다. PI(프로피듐 요오드화물) 염료는 세포막을 관통하여 세포 내 DNA 분자에 결합할 수 있습니다. 대조적으로, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)는 AT가 풍부한 DNA 영역에 우선적으로 결합하여 선명하고 대비가 높은 염색을 제공합니다. 이러한 상호 보완적인 특성으로 인해 DAPI와 PI는 핵과 세포질에 대한 정보를 동시에 수집하기 위해 CPD 염색으로 알려진 함께 사용되는 경우가 많습니다. CPD와 DAPI+ 밴드의 존재, 위치 및 크기의 차이는 Lycoris aurea의 8개 개체군에서 상당한 이염색질 분화를 보여주었습니다. CPD 염색은 중심체 및 중심주위 영역과 텔로센트릭 염색체 내에서 GC 함량이 풍부한 이종염색질 영역을 보여주었습니다.

핵형 비대칭에 대한 연구는 정성적 및 정량적 측정, Stebbins 분류 매개변수 및 다양한 정량적 지수를 포함한 다양한 매개변수와 지표를 통합하는 인기 있고 저렴하며 널리 사용되는 세포유전학적 분류학적 접근 방식입니다(예: Paszko10; Peruzzi et al.11). 이 중 R 비율과 CVCL은 염색체 비대칭을 측정하는 데 사용되며 CVCI 및 MCA는 염색체 비대칭의 주요 지표를 나타냅니다. 특히, CVCL은 염색체 간 비대칭10을 추정하기 위한 강력한 통계적 매개변수로 간주되며, 염색체 비대칭 메트릭(MCA)은 염색체 내 비대칭11을 평가하기 위한 효과적인 척도로 인식되고 있습니다. 집단 간의 핵형 비대칭을 가장 잘 나타내려면 2차원 산점도가 권장되며, 두 개의 비대칭 추정기가 각각 x축과 y축에 배치되며, 여기서 각 표본은 점11,12로 표시됩니다. 그 결과, CVCL의 2차원 산점도 대 . CVCI 및 MCA 대 CVCL은 Lycoris aurea(L'Herit)의 8개 개체군 간의 핵형 비대칭 관계를 효과적으로 설명합니다. Herb, 염색체 비대칭을 평가하는 데 있어 이러한 지표의 신뢰성을 지원합니다.

8개 집단 간의 핵형을 비교하고 핵학적 관계를 재구성하기 위해 본 연구는 매개변수 x, 2n, TCL, MCA, CVCL 및 CVCI를 사용하여 Peruzzi 등[11]이 제안한 방법론을 적용했습니다. 연구 결과에 따르면 HBWF, GZDS, HBBD 및 GXTL 집단은 밀접한 관련이 있으며 HBFC는 이 그룹 사이에 위치했습니다. 결과적으로, 이러한 6가지 매개변수를 기반으로 한 PCoA는 8개 집단 간의 관계를 구별하는 매우 효과적인 방법임이 입증되었습니다. 그러나 어떤 복잡한 패턴은 또한 구성된 분자 진화 나무로부터 나타났다. 예를 들어, HNZX는 분자 계통발생 나무에서 HBWF와 밀접한 관련이 있는 것으로 보였지만 PCoA 산점도에서는 더 먼 관련이 있었습니다. 이러한 복잡성은 분자 분류 특성을 보완하는 Lycoris 내에서 핵형 진화의 추세를 예측하기 위해 여러 정량적 접근 방식을 사용하는 것의 중요성을 강조합니다.

이 연구를 위한 식물은 광시(廣西)성 톈린(天林)현(GXTL), 후베이성(湖北省) 팡현(HBFC), 구이저우(貴州)성 두산현(GZDS), 후난성(湖南省) 쯔싱현(HNZX), 후베이성(湖北省) 바동현(HBBD), 후난성(湖南省) 신닝현(HNXN), 후베이성(湖北省) 우펑현(HBWF), 쓰촨성(四川省) 루산현(SCLS)을 포함한 중국 중서부에서 표본을 추출했다. 바우처 표본은 Huaihua University의 식물 표본실에 보존되어 있습니다. 이 연구는 45S 및 5S rDNA FISH 신호와 말단 CPD 분절 특성의 조합이 Lycoris aurea (L'Herit)의 다른 집단에서 모든 유사분열 염색체를 효과적으로 구별한다는 것을 발견했습니다. 향초. 여기에 제시된 프로토콜은 Lycoris aurea (L'Herit)의 서로 다른 개체군 간의 헤테로크로마틴 분포를 조사하는 것을 목표로 합니다. 향초. CPD(PI와 DAPI의 조합) 및 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌) 역 염색은 핵 구조 및 염색질 분포를 관찰하기 위해 확립된 기술입니다. 염색체 FISH 부합화를 위한 18S-5.8-26S rRNA 유전자 영역(45S rDNA 영역) 및 5S 리보솜 DNA의 직접 형광 라벨링은 간단하며 강력한 부합화 신호를 제공합니다. 이러한 질적 구분은 다양한 인구 집단을 분석하는 데 점점 더 중요해질 것입니다.

이 방법은 활성 유사 분열 중에 뿌리 끝 배양이 필요하기 때문에 빠른 뿌리 끝 배양이 가능한 식물 종에 가장 적합합니다. 짧은 5S 염기서열로 인해 이 연구는 애기장대 탈리아나의 5S rRNA 유전자 코딩 영역의 1-118bp 뉴클레오티드 염기서열을 5S rDNA 프로브로 사용했습니다. 염기서열이 짧고 신호가 약하기 때문에 이 방법은 5S rRNA 유전자의 1-118bp 영역에서 염기가 상대적으로 보존된 종을 식별하는 데만 효과적입니다. 적당히 응축된 중기 염색체를 선택하는 것은 이 방법의 성공에 매우 중요합니다. 염색체 응축은 뿌리 수확 시기, 전처리 기간 및 화염 베이킹과 밀접한 관련이 있습니다. 따라서 이 기술은 실험의 성공을 보장하기 위해 각 단계를 정밀하게 제어해야 합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 상충하는 이해관계가 존재하지 않는다고 선언했다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 자연과학재단(32070367)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알코올Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A500737-0005(70%,  90%,  100%)
1&회; TNTSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (TNT Sangon Biotech (상하이)B5481081×, 10×
2&시간; SSCSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (SSC Sangon Biotech (상하이) Co., Ltd.B5481092×, 20×
45초  rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (영문TAMRA는 양쪽 끝 (5 '및 3'말단)에 추가됩니다)
4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E60730320ml
5S  rDNASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (영문5 '엔드 플러스 6-FAM(FITC)
어도비 포토샵 소프트웨어어도비 시스템즈 주식회사CS6
알파 브로모 - 나프탈렌Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A602718포화
방지 소진제Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Vectashield H-100010mL
생화학 인큐베이터Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTDLRH-70
셀룰라아제Sangon Biotech(Shanghai) Co., Ltd.A426068
구연산10g Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A50170210g
탈이온화 포름아미드(FAD)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600211-05000.7
덱스트란 설페이트Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A42822910 mL
형광 현장 혼성화 장치USA/Abbott ThermoBriteS500-24
형광 현미경Olympus  중국  Co.ltdBX60
빙하 아세트산Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A501931500 mL
HCl알라딘 시약 Co. Ltd. (상하이)H399657500 mL
제빙기Dan Ding Shanghai International Trade Co., Ltd.ST-70
Leica 생물학 현미경독일 Leica 계기 Co., 주식 회사DM6000B
메틸 알콜Sangon Biotech (상해) Co., 주식 회사.A601617500 mL
MetMorph 소프트웨어분자 장치버전 7.35
오븐Thermo Scientific™ 헤라썸&트레이드;THM#51028152
PectinaseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (영어)A00429710g
PepsinSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (펩신 상곤 바이오텍 (상하이)1.07185100g
Propidium iodide(PI)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (영어)A4252591 g
RNaseASangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (RNaseA Sangon Biotech (상하이) 주식회사R464210 mg
연어 정자 DNA(ssDNA)알라딘 시약 Co. Ltd. (상하이)D1198711 g
구연산알라딘 시약 Co. Ltd. (상하이)S189183
Windows 10.0용 10 g Statistica 통계 분석용
주식회사)) 주식회사나트륨

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Heywood, V., Casas, A., Ford-Lloyd, B., Kell, S., Maxted, N. Conservation and sustainable use of crop wild relatives. Agric Ecosyst Environ. 121 (3), 245-255 (2007).
  2. Rong, W., Sun, J., Zhang, H., Wang, H., Liu, H. Cloning and characterization of a tyrosine decarboxylase involved in the biosynthesis of galanthamine in Lycoris aurea. PeerJ. 7, e6729(2019).
  3. Guerra, M. Cytotaxonomy: The end of childhood. Plant Biosyst. 146 (3), 703-710 (2012).
  4. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Karyotype analysis of Lablab purpureus (L.) Sweet using fluorochrome banding and fluorescence in situ hybridization with rDNA probes. Czech J Genet Plant Breed. 51 (3), 110-116 (2015).
  5. Kadluczka, D., Grzebelus, E. Using carrot centromeric repeats to study karyotype relationships in the genus Daucus (Apiaceae). BMC Genomics. 22 (1), 508(2021).
  6. Levin, D. A. The role of chromosomal change in plant evolution. , Oxford Univ Press. 49-52 (2002).
  7. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Molecular cytogenetic characterization and comparison of the two cultivated Canavalia varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 11 (4), 579-600 (2017).
  8. She, C. W., Qin, X., Lu, Y., Wang, H., Li, Y. Comparative molecular cytogenetic characterization of five wild Vigna varieties (Fabaceae). Comp Cytogenet. 14 (2), 243-264 (2020).
  9. Stebbins, G. L. Chromosomal evolution in higher plants. , Addison-Wesley. London. (1971).
  10. Paszko, B. A critical review and a new proposal of karyotype asymmetry indices. Plant Syst Evol. 258 (1-2), 39-48 (2006).
  11. Peruzzi, L., Eroglu, H. Karyotype asymmetry: Again, how to measure and what to measure. Comp Cytogenet. 7 (1), 1-9 (2013).
  12. Dehery, S. K., Tavakkoli, A., Jafari, M. Karyotype and chromosome pairing analysis in some Iranian upland cotton (Gossypium hirsutum). Nucleus. 64 (2), 167-179 (2021).
  13. Schweizer, D. Reverse fluorescent chromosome banding with chromomycin and DAPI. Chromosoma. 58 (4), 307-324 (1976).
  14. Moscone, E. A., Debat, H. J., Salguero, N. Quantitative karyotyping and dual color FISH mapping of 5S and 18S-25S rDNA probes in the cultivated Phaseolus varieties (Leguminosae). Genome. 42 (6), 1224-1233 (1999).
  15. Hasterok, R., Sliwinska, E., Kwasniewski, M. Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. Theor Appl Genet. 103 (4), 486-490 (2001).
  16. Koo, D. H., Han, Y., Lee, H. Molecular cytogenetic mapping of GXTL and C. melo using highly repetitive DNA sequences. Chromosome Res. 18 (3), 325-336 (2010).
  17. De Moraes, A. P., Ferreira, J. P., Marques, R. Karyotype diversity and the origin of grapefruit. Chromosome Res. 15 (1), 115-121 (2007).
  18. Weiss-Schneeweiss, H., Kiefer, C., Schneider, H. Karyotype diversification and evolution in diploid and polyploid South American Hypochaeris (Asteraceae) inferred from rDNA localization and genetic fingerprint data. Ann Bot. 101 (7), 909-918 (2008).
  19. Siljak-Yakovlev, S., Peruzzi, L. Cytogenetic characterization of endemics: Past and future. Plant Biosyst. 146 (3), 694-702 (2012).
  20. Miaohua, Q., Wang, Y., Zheng, Y. Reciprocal natural hybridization between Lycoris aurea and Lycoris radiata (Amaryllidaceae) identified by morphological, karyotypic, and chloroplast genomic data. BMC Plant Biol. 24 (1), 14-27 (2024).
  21. Shi, S., Wang, Y., Yu, J. Phylogenetic relationships and possible hybrid origin of Lycoris varieties (Amaryllidaceae) revealed by its sequences. Biochem Genet. 44, 198-208 (2006).
  22. Yumai, J., Wang, Y., Zheng, H. Characterization, validation, and cross-species transferability of EST-SSR markers developed from Lycoris aurea and their application in genetic evaluation of Lycoris species. BMC Plant Biol. 20 (1), 522-528 (2020).
  23. Koo, D. H., Shin, D., Lee, J. Karyotype analysis of a Korean cucumber cultivar (Cucumis sativus L. cv. Winter Long) using C-banding and bicolor fluorescence in situ hybridization. Molecules Cells. 13 (3), 413-418 (2002).
  24. Waminal, N. E., Kim, H. H. Dual-color FISH karyotype and rDNA distribution analyses on four Cucurbitaceae species. Hortic Environ Biotechnol. 53 (1), 49-56 (2012).
  25. Xie, W. J., Yang, X., Wang, F. Localization of 45S and 5S rDNA sequences on chromosomes of 20 varieties of Cucurbitaceous plants. J South China Agric Univ. 40 (6), 74-81 (2019).
  26. Han, Y., Zhang, H., Zhu, C. Centromere repositioning in cucurbit varieties: Implication of the genomic impact from centromere activation and inactivation. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (35), 14938-14941 (2009).
  27. Li, K. P., Yao, S., Li, Y. Cytogenetic relationships among Citrullus varieties in comparison with some genera of the tribe Benincaseae (Lycoris aurea (L' Hér.) Herb) as inferred from rDNA distribution patterns. BMC Evol Biol. 16, 85(2016).
  28. Ren, Y., Huang, H., Zhang, Z. An integrated genetic and cytogenetic map of the cucumber genome. PLoS One. 4 (6), e5795(2009).
  29. Han, Y., Wang, H., Liu, B. An integrated molecular cytogenetic map of Cucumis sativus L. chromosome. BMC Genet. 12, 18(2011).
  30. Han, Y., Zhang, H., Yu, C. Chromosome-specific painting in Cucumis varieties using bulked oligonucleotides. Genetics. 200 (3), 771-779 (2015).
  31. Liu, M. S., Zhang, S., Liu, Q. Chromosomal variations of Lycoris varieties revealed by FISH with rDNAs and centromeric histone H3 variant associated DNAs. PLoS One. 16 (9), e0258028(2021).
  32. Hayashi, A., Murota, K., Murata, J. Genetic variations in Lycoris radiate var. radiate in Japan. Genes Genet Syst. 80, 199-221 (2005).
  33. Nima, R. Fluorescence in situ hybridization: Methods and application in cancer diagnosis. Cancer Immunol. 2, 711-728 (2020).
  34. Liu, K., Yang, X., Wang, J. Cytogeography and chromosomal variation of the endemic East Asian herb Lycoris radiate. Ecol Evol. 9, 6849-6859 (2019).
  35. Song, Y. C., Zhang, L., Yan, B. Comparisons of G-banding patterns in six species of the Poaceae. Hereditas. 121, 31-38 (1994).
  36. She, C. W., Zhou, M., Zhang, L. CPD staining: An effective technique for detection of NORs and other GC-rich chromosomal regions in plants. Biotechnic Histochem. 81 (1), 13-21 (2006).
  37. Han, Y. H., Kim, J., Yoon, M. Distribution of the tandem repeat sequences and karyotyping in cucumber (Cucumis sativus L.) by fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 122 (1), 90-98 (2008).
  38. Chao-Wen, S., Chen, Z., Wang, S. Comparative karyotype analysis of eight Cucurbitaceae crops using fluorochrome banding and 45S rDNA-FISH. Comp Cytogenet. 17, 31-58 (2023).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

45S rDNA5S rDNA
동영상 곧 제공

관련 논문