부유식 연구실: 환경 DNA 분석을 위해 운영 중인 페리에서 해수 샘플을 수집하고 필터링하기 위한 표준 운영 절차

요약

여기에서는 운항 중인 페리 및 기타 상업용 선박에서 해수 샘플을 수집하고 여과하여 해양 eDNA를 검색하는 새로운 프로토콜을 제시합니다.

초록

환경 DNA 흔적에서 정보를 검색하는 유전 도구는 표적 및 분류학적으로 광범위한 생물 다양성 특성화 모두에 대해 잘 확립되어 있습니다. 그러나 해양 맥락에서는 심해나 근해 수역과 같이 접근하기 어려운 지역에서 eDNA 샘플을 수집하는 것이 여전히 한계가 될 수 있습니다. 넓은 넓은 바다를 횡단하는 정기 페리 또는 상업선의 사용은 환경 샘플 수집을 위한 귀중한 기회주의적 플랫폼을 구성할 수 있습니다. 어떤 기상 조건에서든 하루 중 언제든지 데이터를 수집할 수 있는 가능성부터 시간이 지남에 따라 반복성, 경로가 일정하고 비용 및 연료 배출량을 완전히 줄일 수 있다는 점까지 이점은 셀 수 없이 많습니다. 이전 연구에서는 이 접근 방식이 가능하고 성공적이라는 것을 보여주었습니다. 그러나 이러한 대형 해양 선박의 배에서 샘플을 채취하는 과정은 즉각적이지 않을 수 있습니다. 이 작업은 대형 선박에서 해수를 수집하고 여과하는 방법을 어떻게 준비, 배치 및 수행할 수 있는지 세부적으로 보여줍니다.

서론

지난 수십 년 동안 환경 DNA(eDNA) 분석, 즉 환경에 있는 유기체가 남긴 유전 물질을 검출하는 것은 민물 및 해양 동물 군집을 위한 유망한 모니터링 도구로 빠르게 성장했습니다. 이 분자 기술은 단일 샘플 내에서 여러 분류군을 동시에 식별할 수 있는 가능성을 제공하여 (메타바코드 접근법) 샘플링된 영역에 서식하거나 가로지르는 생물학적 군집을 검출할 수 있습니다 1,2,3,4,5.

현재 실제 과제는 샘플링 지점에 도달하는 것인데, 이는 대규모 지리적 규모에 걸쳐 샘플을 수집하는 것이 경제적 및/또는 물류적으로 불가능하여 원양 지역이 더 접근하기 쉬운^{해안 지역에 비해} 일반적으로 샘플링이 부족하기 때문입니다6. 페리 또는 기타 상업용 선박을 사용하면 일반적으로 시즌 동안 일정하고 넓은 지역을 커버하는 특정 운송 경로를 따르기 때문에 복제 가능성이 높은 샘플링 횡단면이 가능합니다 ^7,8. 또한 페리 노선을 샘플링 수단으로 사용하면 날씨와 해상 조건에 관계없이 하루 중 언제든지 모든 계절에 샘플을 수집할 수 있을 뿐만 아니라 다른 많은 이점이 있습니다(보충 그림 1). 예비 연구는 생물 다양성 지수 평가에 대한 타당성과 정확성을 모두 입증했습니다 ^9,10. 물 샘플은 엔진 상류의 해양 냉각수를 차단하는 파생 파이프를 통해 페리 엔진룸에서 수집할 수 있습니다. LIFE-CONCEPTU MARIS(메드에서 태류류 및 원양 바다 운송의 보존: 지속 가능성에서 회복을 위한 조치 관리)는 이 개념 증명이 대규모로 실행된 첫 번째 프로젝트입니다: 500개의 샘플 수집(2년 이상)을 목표로 하며, 한 곳이 아닌 여러 페리 회사와 여러 운송업체의 참여를 포함합니다. 중요한 문제를 강조하고 선상에서 발생할 수 있는 가장 다양한 상황에 더 잘 적응할 수 있도록 샘플링 전략을 개선할 수 있습니다. 해양 환경 DNA 샘플의 대규모 수집과 관련된 구성 요소에 대한 프로젝트의 특성을 아래에 설명합니다(프로젝트 설명은 https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707 방문).

정기 페리를 사용하여 샘플링 캠페인을 수행하기로 한 결정은 실제 샘플링 전에 취해야 하는 몇 가지 조치를 의미하며, 이는 이 작업에서 직접 다루는 측면입니다. 여기에서는 모든 상업용 선박에서 선상 샘플링에 앞서 수행해야 하는 조치에 대해 간략하게 언급합니다.

이는 간과해서는 안 될 측면이며 수집 캠페인의 성공 여부를 결정하는 측면입니다. 해운 회사는 연구 기관이 아닌 상업적 기관이므로 선상에서 수행하려는 과학 연구의 목적과 목적을 잘 알지 못하며 그럴 필요도 없습니다. 이는 다학제적일 수 있는 제안된 과학 프로젝트의 목표가 해운 회사 자체의 최고 경영진에 의해 전달되고 동기를 부여되어야 하는 중요하고 섬세한 초기 단계를 의미합니다. CONCEPTU MARIS 프로젝트의 특정 사례에서 이는 해운 회사가 이미 시각적 모니터링 프로젝트(예: 고정 라인 횡단면[FLT]⁷)에 참여한 수십 년간의 관계에 의해 가능했으며, 이는 이 작업에서 다루는 샘플링 접근 방식에 필수적인 엔진룸에 대한 접근을 위한 승인을 얻을 수 있는 데 필요한 상호 존중 관계를 결정했습니다.

CONCEPTU MARIS 프로젝트에서 채택된 샘플링 체제의 종류는 두 가지입니다: 샘플은 고정 샘플링 스테이션(FSS, 아래 참조)과 "희귀한" 고래류를 목격할 때 모두 채취됩니다. 이들은 FTL 횡단면¹¹에서 가장 적게 볼 수 있는 종, 즉 일반 돌고래(Delphinus delphis), 퀴비에 부리고래(Ziphius cavirostris), 파일럿 고래(Globicephala melas), 리소 돌고래(Grampus griseus), 향유고래(Physeter macrocephalus) 및 지느러미 고래(Balaenoptera physalus)를 나타냅니다). 추가 물 샘플은 육안 인구 조사 팀(FLT 팀)이 보고한 희귀종의 목격이 FSS 중 하나 전후에 30분 이상 발생하는 경우에만 수집됩니다. 목격과 함께 수행되는 샘플링은 필연적으로 모두 주간일 것입니다.

크루즈 동안 지리적 위치가 변하지 않는 고정 샘플링 스테이션(FSS)은 사전에 식별되고 전체 작업 팀과 합의됩니다. FSS의 지리적 위치는 1) 이전 관찰/문헌 데이터를 기반으로 생물학적 관심 장소의 존재에 따라 선택됩니다. 2) 수심 지도에서 서식지 변화를 나타내는 지점(예: 대륙붕 가장자리)에 우선 순위가 부여됩니다. 3) 지정된 항로의 균일한 범위, 따라서 전체 경로를 포괄하고 야간 샘플 수집도 예측하기 위해 거의 동일한 거리의 샘플링 장소(약 35-45해리 간격)를 선택합니다.

인접한 샘플이 하루 중 다른 시간에 채취되고 두 개의 연속 샘플 사이에 샘플 처리를 완료하기에 충분한 시간이 있는지 확인하려면 인접한 FSS에서 샘플을 채취하는 것이 좋습니다. 즉, FSS가 샘플링된 시간순에 따라 번호가 매겨지면 맵에 연속적인 순서로 표시되지 않습니다. 예를 들어 6개의 FSS를 선택한 경우 3개는 출국 여정에서 샘플링되고 3개는 돌아오는 여정에서 샘플링됩니다. "지도의 경로를 따라 순서는 PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB이며, 이탤릭체의 3개 샘플링 스테이션(FSS4, FSS5 및 FSS6)은 돌아오는 여정에서 조사됩니다( 그림 1 참조).

각 단일 FSS에는 고유한 식별 번호가 있습니다(즉, 서로 다른 경로에서 식별된 FSS는 동일한 식별 번호를 공유하지 않음). FSS가 처음 샘플링될 때 번호 매기기가 할당되고 연속 번호 매기기가 뒤따릅니다. 따라서 프로젝트가 끝날 때 번호가 낮은 FSS는 몇 년 동안 테스트되었거나 가장 오래된 데이터를 사용할 수 있는 FSS가 될 것입니다.

각 샘플은 각 샘플링 스테이션에서 수집된 약 13L의 해수로 구성됩니다. 바닷물은 샘플 처리(아래 참조)까지 페리의 파생 파이프에서 "Bag-in-the-Box"(BiB) 용기, 즉 멸균 호일 적층 비닐 봉지로 직접 디캔팅됩니다. BiBSS(Bag-in-Box Sampling System)의 특성과 장점은 Valsecchi et al. (2021)⁹ 에 의해 자세히 설명되어 있으며 편의를 위해 여기 그림 2 에도 보고되어 있습니다.

프로토콜

1. 실험실에서 준비하기

1. 기어 체크리스트
   1. 샘플 수집 및 샘플 여과를 위해 기내에 반입할 품목에 대한 체크리스트를 참조하십시오. 보충 파일 1에 나와 있습니다. 각 항목과 그 사용법은 아래 섹션에서 설명합니다.
   2. 보충 파일 1의 사본을 인쇄하여 샘플링 캠페인을 위해 출발하기 전에 작성하십시오.
2. Bag-in-Box 샘플링 시스템 준비
   1. 탑승하기 전에 가능하면 연기 후드 아래의 실험실에서 백인박스를 준비하십시오. 세 개의 구멍(백에 있는 구멍, 백을 닫는 캡의 일부, 수도꼭지의 배출구)을 밀봉 필름으로 밀봉합니다(그림 3, 재료 표).
   2. 캡을 분리하고 내부에 밀봉한 상태에서 백을 단단히 굴리고 접착 테이프로 닫아 운송 중에 다시 열리지 않도록 합니다(그림 3).
   3. (i) 백에 들어가는 공기로 인한 오염을 방지하고 (ii) 접힌 백이 부피가 커지는 것을 방지하기 위해(공기가 포함된 경우) 앞서 언급한 밀봉 조작 중에 백에 공기가 들어가지 않도록 하여 이 작업을 수행합니다.

2. 기내 준비

1. 승무원과의 조정
   1. 승선하자마자 선택한 샘플링 지점을 선장 및 승무원과 공유하여 페리가 "고정 샘플링 스테이션"(FSS)으로 선택한 각 지점에 가장 가까운 시간이 표시되도록 합니다.
   2. 각 FSS의 샘플링 시간과 해당 경로에 대한 페리의 현재(또는 가능한 경우 평균) 순항 속도를 기록해 두면 샘플링된 바다 구간의 확장(km)을 추정할 수 있습니다.
   3. 페리는 정확히 같은 지점을 통과하지 않으므로 실제 샘플링 후 각 해수 샘플 수집의 좌표를 수정하십시오.
      참고: 정확한 샘플링 간격은 실제로 샘플링된 해역을 충실하게 식별하는 데 가장 중요한 데이터입니다. 따라서 실제 샘플링 좌표를 보고하는 대략적인 지점의 지도를 인쇄하는 것이 유용합니다(예: 보충 파일 2).
   4. 회사에서 기관실에 대한 접근을 허용하면 기관실로 안내해 달라고 요청하십시오.
   5. 기관실에 들어가기 전에 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오. 이곳의 환경은 척박하고(귀청이 터질 듯한 소음과 고온) 잠재적으로 교활한 지점(가파른 계단, 바닥의 큰 틈)으로 가득 차 있습니다. 기관실 출입 허가를 받은 후에는 안전화, 헬멧, 청력 보호 헤드폰 등 필수 안전 장비를 모두 장착하십시오.
   6. 필터링 표면이 운송 회사에서 제공하는 경우(일반적으로 자체 접이식 테이블을 사용하는 것이 좋습니다) 10% 표백제 용액을 사용하여 샘플 사이에 이 영역을 소독할 수 있는지 확인하십시오.
2. 엔진룸에 정착
   1. 선박에는 다양한 해수 유입구가 있으므로 파이프에서 발견될 수 있는 물질 및 유기체로 물 샘플의 오염을 최소화하기 위해 선박 파이프를 통해 흡입되는 물이 최소한의 경로를 허용하는 기관실 관리자와 확인하십시오.
   2. 들어오는 바닷물을 수집하는 데 가장 적합한 지점/입구가 확인되면 샘플 수집에 사용되는 파이프를 "지역" 물로 지속적으로 헹구기 위해 전체 크루즈 기간 동안 샘플 수집 수도꼭지를 약간 열어 둘 수 있는지 직원에게 문의하십시오. 수도꼭지에서 끊임없이 흐르는 바닷물은 빌지에 폐기하십시오.

3. 물 샘플 수집(기관실)

참고: 그림 4 는 해수 샘플 수집 단계를 보여줍니다.

1. 물 수집 준비
   1. 필요한 모든 장비(첫 번째 부분 보충 파일 1 체크리스트)를 엔진룸으로 가져오십시오. 계획된 샘플링 시간 최소 15분 전에 엔진룸에 도착하여 10% 표백제 용액을 사용하여 BiB를 취급하는 영역을 멸균하십시오.
   2. 전체 크루즈 동안 전용 수도꼭지를 열어 두지 않은 경우 해수 샘플 수집을 위해 수도꼭지를 열고 실제 인출 전에 최소 5분 동안(물은 빌지에 폐기됨) 물을 흐르게 합니다(그림 4A).
   3. 필터링 스테이션을 준비합니다.
      알림: 여과 효율을 크게 향상시킬 수 있는 필터링 스테이션을 설정하는 데에는 몇 가지 조치가 있습니다(4.3단계 참조): 1) 대용량 진공 플라스크(2L, 4L 또는 5L 플라스크, 인출할 부피에 따라 다름). 이것은 1L와 다음 플라스크 사이의 플라스크를 비우는 데 필요한 시간을 절약하는 것 외에도 여과 실린더의 취급을 최소화하여 오염을 최소화합니다. 2) 여러 개의 필터 플라스크를 직렬로 배열하여 사용할 수 있으며, 이는 여러 샘플(백)을 동시에 여과할 수 있는 조치입니다. 이 조치는 도킹 포트에 도달하기 전에 백을 처리하는 데 필요한 시간이 없을 위험이 있는 엄격한 샘플링 체제에서 권장됩니다.
   4. 영구 마커를 사용하여 BiB에 다음과 같이 적어 BiB를 준비하고 라벨을 붙입니다. 1) BiB 양면에 있는 샘플의 고유한 영숫자 식별 코드(특히 BiB가 선상에서 즉시 처리되지 않고 육지에서 여과되는 경우 중요) 2) 날짜; 3) BiB 채우기 시작의 정확한 시간.
2. 물 수집
   1. BiB 개구부에서 밀봉 필름을 제거하고 완전히 가득 찰 때까지(약 13L) 채우기 시작합니다(그림 4B).
   2. 백이 거의 가득 차면 뚜껑에서 밀봉 필름을 제거하되 탭 입구에서는 제거하지 마십시오: 여과될 때까지 탭 안전 고정(빨간색 플라스틱 탭) 주위에 밀봉 필름을 유지합니다(그림 4C). 뚜껑으로 BiB를 밀봉하고 완전히 닫힐 때까지 단단히 누릅니다.
   3. 샘플 수집이 완료된 정확한 시간을 기록해 두면 샘플 수집의 총 기간(분)을 계산할 수 있습니다.
3. 물 수집 후
   1. BiB에 유성 마커를 사용하여 샘플 수집이 완료된 정확한 시간을 작성하고 샘플 수집/여과 양식(보충 파일 2)에 모든 데이터를 보고합니다.
   2. 채워진 BiB를 보관실 또는 여과 구역(엔진룸 자체 또는 객실의 전용 공간)으로 옮깁니다.
   3. 샘플 수집/여과 양식(보충 파일 2)의 모든 데이터를 전송합니다.
      참고: 보충 파일 2 는 모든 부품에서 선상에서 완료할 샘플 수집/여과 시트를 보여줍니다.
      1. 샘플 수집과 관련된 부분(녹색)의 경우 엔진룸에서 해수 샘플링의 시작 및 종료 시간을 입력합니다.
      2. 두 번째로 승무원 또는 GPS 기록과 협의한 후 샘플링 및 순항 속도의 시작과 끝에 대한 지리적 좌표를 입력합니다. 이를 통해 이후에 샘플링된 바다 세그먼트의 길이를 계산할 수 있습니다.
         알림: 필터링과 관련된 부분(파란색)과 관련하여 여과가 선상에서 발생하는지 또는 나중에 육지에서 발생하는지 여부가 표시됩니다. 3개의 필터 각각에 대해 필터링 시간이 표시됩니다.

4. 해수 샘플 여과

1. 여과 준비
   참고: 이 시점부터 여과 프로세스는 연구 프로젝트의 특정 목표에 따라 다양한 프로토콜에 따라 관리될 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하면 일반적으로 사용되는 다른 상용 키트 또는 프로토콜에 내재된 부피 제약을 피하면서 선상에서 직접 많은 양의 해수(10리터 이상)를 효율적으로 여과할 수 있습니다. 가능하면 기내에서 물 샘플을 여과하십시오: 여과는 엔진룸 자체 또는 기내(바람직하게는 엔진룸 근처에 위치)에서 이루어질 수 있습니다. eDNA 분해를 제한하고 편의를 위해 수집 직후 해수 샘플을 여과하여 처리할 많은 양의 해수로 하선을 피하는 것이 항상 바람직합니다. 가능하지 않은 경우 샘플을 Bag-in-Box 용기에 보관하고 나중에 여과하기 위해 운송할 수 있습니다.
   1. 기내 여과 전용 공간(엔진룸 또는 전용 객실)에서 보충 파일 1의 검사 목록의 두 번째 부분에 나열된 모든 것을 준비하고 그림 5와 같이 필터링 시스템을 조립합니다.
   2. 그림 6 및 그림 7과 같이 여과 실린더( 재료 표)를 준비합니다. 각 스테이션에 새 실린더, 새 일회용 핀셋 한 쌍 또는 멸균된 핀셋 한 쌍을 사용하십시오.
      참고: 단일 실린더를 여러 번 사용하여 동일한 위치에서 샘플을 필터링할 수 있습니다. 그러나 10% 표백제로 멸균한 후 담물을 헹군 후 실험실에서 자연 건조시킨 다음 다음 캠페인까지 보관하기 위해 단독으로 포장해야 합니다.
   3. 여과를 시작하기 전에 샘플 수집/여과 데이터 로그(보충 파일 2)를 작성하십시오. 이는 처리된 리터 수를 추적하고 필터링 시간(샘플의 미립자 양을 나타냄)을 측정하는 데 필요합니다. 진공 펌프가 활성화되자마자 타이머를 시작하여 필터링 시간을 측정합니다.
2. 기내 여과
   1. 오염 위험을 최소화하려면(특히 여러 백이 동시에 처리되는 경우, 아래 참조) 수도꼭지와 여과 실린더 사이에 절연 슬리브(비닐 봉지)를 배치하여 여과할 물의 흐름을 주변 환경으로부터 격리하십시오( 그림 7 참조).
      참고: 환경 DNA 분석에 사용되는 기술의 민감도로 인해 접근 방식이 환경 오염(작업자 또는 샘플 간 교차 오염)에 특히 취약하기 때문에 이는 중요한 예방 조치입니다.
   2. 진공 펌프를 작동시키고 각 필터에 대해 최대 4L의 물을 여과합니다. 공기가 시스템에 들어가는 것을 방지하고 여과 과정 속도를 늦추기 위해 여과 중에 실린더를 항상 가득 채우십시오.
      참고: 멤브레인의 다공성 선택에 관해서는 연구 목적, 대상 분류학적 그룹 및 처리하려는 물의 양에 따라 다릅니다. 이 문제는 이전 작업 ^9,12에서 다루었습니다.  다공성이 다른 필터를 비교했습니다. 척추동물 연구와 필터당 4리터의 물을 처리하는 선택을 위해 다공성이 0.45μm인 멤브레인이 최상의 솔루션으로 입증되어 기공 포화로 인해 필터가 어수선해지지 않고 많은 양의 물을 처리할 수 있었습니다.
   3. 플라스크 내부의 여과수 수위가 4L 수위 표시에 도달하면 진공 펌프를 끄고 타이머를 중지하여 데이터 로그에 여과 시간 값을 보고합니다.
      참고: 12/13L의 각 BiB에서 각각 4L(A, B 및 C로 명명됨)의 3개의 기술 복제를 얻습니다.
   4. 이 시점에서 핀셋(필요한 경우 필터 가장자리를 들어 올리는 데 도움이 되는 멸균 이쑤시개)을 사용하여 그림 8과 같이 실린더에서 첫 번째 필터(필터 A)를 회수하여 필터가 손상되지 않도록 합니다.
   5. 필터를 반으로 접고(생물학적 물질을 유지한 면이 자체적으로 접힌 상태에서) 알루미늄 호일로 감싸고 즉시 샘플 번호와 필터 복제 ID(예: 15A)를 포장에 적습니다. 하선할 때까지 기내 냉동실에 보관하십시오.
   6. 여과 실린더 내부에 새 필터(필터 B)를 장착하여 또 다른 4L 샘플을 처리합니다(그림 9). 플라스크를 비우고 4L가 완전히 여과될 때까지 두 번째 반복실험을 필터링하는 것으로 다시 시작합니다. 설명된 대로 필터 B를 복구하고 필터 C에 대해 동일한 단계를 반복합니다.
3. 모범 사례
   1. 여과 시간을 단축하려면 단일 필터를 통해 처리된 모든 여과수를 수용할 수 있는 대형 진공 플라스크를 사용하십시오(따라서 이 경우 최소 4L 용량).
   2. 여과 장치를 병렬로 배열하여 여러 백을 동시에 여과하여 여과 시간을 상당히 줄입니다(즉, 단일 펌프에 의해 제공되는 여러 진공 플라스크).
      참고: CONCEPTU MARIS 캠페인에서는 두 가지 전략이 모두 채택되었습니다(그림 10). 경로를 따라 수집된 샘플 수가 많을 수 있으므로 필터링 효율성을 극대화하는 것이 매우 중요합니다. 따라서 선상에서 백을 처리할 시간이 충분하지 않을 경우 백을 내릴 위험이 있는 샘플이 축적되는 것을 방지하기 위해 짧은 시간에 백을 처리해야 합니다.
   3. 위양성(오염)의 발생률을 모니터링하기 위해 여과 절차에 크루즈당 적어도 한 번은 "빈 백"을 포함하여 밀봉된 병에서 채취한 식수로 채워진 백을 샘플과 병행하여 필터링합니다. 이 대조군 샘플은 반복이 필요하지 않으며 이를 나머지 샘플로 취급하고 NGS 실행에 포함합니다.
4. 필터의 보관 및 운송
   1. 여과 후 추가 실험실 처리가 될 때까지 모든 필터를 -4°C에서 -20°C 사이에 보관하십시오.
   2. 그림 11과 같이 하선 직전에 선상 냉동고에서 샘플을 수집하고 이동 가능한 냉각기를 사용하여 저온에서 운송할 수 있도록 준비합니다.
      알림: 샘플이 선상에서 여과되지 않은 경우 해수 백은 캡을 윗면에 고정하고 운송을 용이하게 하기 위해 플라스틱 상자 내부의 쇼핑백 내부에 쌍으로 지지된 상태로 수직으로 보관하면 더 안전하게 운송됩니다(그림 12).

결과

설명된 대로 프로토콜을 실행하면 3개의 복제본에 대해 FSS 수를 곱한 수와 동일한 수의 필터가 운영자에 의해 수집됩니다. 각 필터는 양면 중 하나에 생물학적 흔적(환경 DNA)을 유지합니다. eDNA 추출 이후의 분석 단계는 연구 질문, 표적 및 목표에 따라 크게 달라집니다. 예를 들어, Valsecchi et ^al.9의 파일럿 연구에서 설명된 eDNA 수집 프로토콜은 복제 가능하고 체계적인 해양 거대 동물군 조사의 설계를 허용했습니다. 메타바코드 접근 방식을 사용하고 분석할 두 가지 척추동물 특이적 마커를 선택하여 여러 척추동물 종(경골 물고기, 엘라스모브랜치, 고래류)을 검출할 수 있었습니다. 이러한 결과를 통해 우리는 종의 상대적 풍부도(그림 13)와 공간적 분포를 추론할 수 있었고, 따라서 샘플링된 경로와 영양 구조를 따라 척추동물 군집 구성을 재구성할 수 있었습니다⁹. 이 접근 방...

토론

프로토콜 단계가 간단하고 간단하기 때문에 상업용 페리에서 작업할 때 고려해야 할 몇 가지 관련 고려 사항이 있습니다. 냉각수 유도 파이프는 일반적으로 엔진룸 영역에 위치하며 접근이 제한되거나 사전 승인이 필요할 수 있습니다. 따라서 적절한 개인 보호 장비와 함께 이러한 승인을 받는 것이 중요합니다(그림 4). 또한 물 수집 및 여과는 오염을 방지하기 위해 가능한 가장 멸균 조건에서 이루어져야 합니다. 콜드체인을 유지하는 샘플 보존 및 이송은 여과 전에 확인해야 하는 또 다른 중요한 단계입니다. BiB에 포함된 물을 수집 직후 여과하는 것이 항상 바람직하며, 이는 샘플 운송을 용이하게 한다는 점을 고려합니다. 그러나 가능하지 않은 경우 샘플은 품질에 영향을 주지 않고 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다⁹. 샘플을 효과적으로 보관하려면 BiB를 새로운 장소에 보관하고 운송 중에...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
직경 4.7cm 필터 멤브레인	Biosigma S.p.A.	https://www.biosigma.com/	0.45 & mu의 필터 멤브레인; M 다공성, 개별 포장 
4/5 L 진공 플라스크	Duran	https://www.duran-bottle-system.com/	5 L 마개가 있는 유리 플라스크
흡수성 종이 패드	Advantec MFS, Inc.	https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1	여과지 흡수 패드, 크기 47mm.
백인박스(BiB)	GMV Agricenter S.r.l.	https://www.gmvagricenter.it/	도꼭지가 있는 10리터 백인 박스
실린더	Sartorius AG	https://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors#	Biostart 100 모니터 실린더, 0.45 μ M 멤브레인 포함 
씰링 필름	Merck	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium= cpc& utm_campaign=모두+product_ dsa_WW_%28bing+ebizpfs%29& utm_id=626946489& utm_content= 1166583023365595& msclkid= d2b55b82440b1aef56fc3ca803c 6486f& utm_term=%2Fproduct%2F	4인치 x 125피트 실험실 밀봉 필름 롤
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