방법 논문

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

DOI:

10.3791/67367

⸱

2024년 9월 27일

 ,  , 
1Pediatrics and Rare Diseases Group, Sanford Research, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Mayo Clinic, 3Department of Pediatrics, Sanford School of Medicine, University of South Dakota

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 재조합 단백질 정제와 유비퀴틴 사슬 절단 분석을 결합하여 신경 발달 장애와 관련된 유전적 변이가 탈유비퀴틸화 효소 활성에 미치는 영향을 측정하는 방법을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경 발달 장애(NDD)는 신경계 기능의 손상과 관련이 있지만 분자 수준에서는 잘 이해되지 않는 경우가 많습니다. 단일 유전자에 의해 발생하는 이산 장애는 비정형 신경 발달을 주도하는 메커니즘을 조사하기 위한 모델을 제공합니다. 듀비퀴틸화 효소(deubiquitylating enzyme, DUB) 계열 단백질을 암호화하는 유전자 변이체는 여러 NDD와 연관되어 있지만, 이러한 유전자 변이체에 의해 유발되는 질환의 병원성 기전을 규명할 필요가 있습니다. DUB 활성에 대한 유전자 변이체의 영향은 기질 독립적 in vitro ubiquitin cleavage assay를 사용하여 실험적으로 결정할 수 있습니다. 이 분석은 촉매 활성을 직접 측정하기 위해 다운스트림 기판에 대한 지식이 필요하지 않습니다. 여기서, 효소 활성에 대한 유전자 변이체의 영향을 결정하기 위한 프로토콜은 X-연관 지적 장애 105(XLID105)에서 돌연변이된 DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X)를 사용하여 모델링됩니다. 이 실험 파이프라인은 DUB 유전자의 변이체에 의해 유발되는 신경 발달 장애의 기저에 있는 메커니즘을 명확히 하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신경발달장애(NDD)는 비정형 신경계 발달을 촉진하는 환경적 또는 유전적 결정 요인과 함께 다양한 병인으로 인해 발생한다1. 차세대 염기서열 분석 유전자 검사는 유비퀴틴 시스템 관련 유전자의 변이체가 증가하고 있음을 유전적 NDD와 연관시키고 있다2. 유비퀴틴 시스템은 단백질 기질의 라이신 잔기에 대한 작은 단백질 변형제 유비퀴틴의 결찰을 촉매하여 국소화, 안정성, 단백질-단백질 상호 작용 또는 활성을 포함한 세포 행동의 변화를 유도합니다3. 유비퀴틸화는 E1 활성화, E2 접합 및 E3 리가아제 효소4에 의해 매개되며, 단백질 기질에서 유비퀴틴의 절단 및 제거를 촉매하는 듀비퀴틸화 효소(DUBs)의 활성에 의해 가역적이다5. 유비퀴틴은 7개의 라이신 잔기(K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63) 또는 유비퀴틴의 M1 잔기에 형성된 단량체(모노유비퀴틸화) 또는 고분자 사슬(폴리유비퀴틸화)로 기판에 결합될 수 있습니다. 이러한 다양한 유비퀴틴 사슬 토폴로지와 그 조합은 신호 전달(signal transduction)6의 핵심이 되는 세포 코드를 생성한다.

USP27X, USP7, USP9X, USP48, STAMBP, OTUD4, OTUD6B 및 OTUD5와 같은 DUB는 NDD 2,7,8,9,10,11과 관련이 있습니다. 대부분의 NDD의 경우, 발병을 유발하는 분자 메커니즘은 실험적으로 정의되지 않은 상태로 남아 있습니다. 최근에 설명된 장애를 유발하는 DUB 중 일부는 잘 이해되지 않았으며 유전적 변이가 단백질 기능에 미치는 영향을 평가하는 데 사용할 수 있는 알려진 세포 판독이 부족합니다. In vitro, 유비퀴틴 사슬 절단 분석은 효소 활성에 대한 유전자 변이체의 영향을 측정할 수 있는 기질 독립적 DUB 활성 판독으로서 이러한 한계를 극복합니다12.

시험관 내 유비퀴틴 절단 분석은 1980년대부터 사용되어 왔습니다. 방사성 표지 기질을 사용한 이러한 분석을 통해 Histone H2A13을 탈유비쿼터화하는 능력으로 확인된 이소펩티다아제와 다양한 화학 접합체에서 유비퀴틴을 가수분해하는 능력으로 식별된 유비퀴틴 카르복실 말단 가수분해효소(UCH)를 포함한 최초의 DUB를 발견할 수 있었습니다 14,15,16. 또한, 방사선 표지된 폴리유비퀴틸화된 전장 단백질 또는 펩티드를 사용하여 적혈구 및 골격근에서 이소펩티다아제 T와 여러 UCH 및 유비퀴틴 특이적 프로테아제(UBP)를 각각 17,18,19,20으로 식별했습니다. 정의된 길이 및 결합 유형의 유비퀴틴 사슬(K48 결합 테트라-유비퀴틴)을 사용하여 이소펩티다아제 T21의 DUB 활성을 측정했습니다. 그 이후로 이 분석은 돌연변이 분석에서 DUB 활성을 측정하는 황금 표준이 되었습니다22,23. 이 분석법의 정교화는 현재 전기영동을 통해 유비퀴틴 절단을 시각화할 수 있으며, Coomassie blue, SYPRO orange, ruby 및 silver stain 또는 형광 또는 면역블로팅 기반 검출과 같은 기존 gel stain을 시각화할 수 있습니다12,24. 최소 사슬 길이 및 결합 특이성 25,26,27,28과 같은 DUB 활성의 분자적 측면은 기능 분석에서 다양한 길이(예: di-, tri-, tetra-ubiquitin) 및 연결(K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63, 선형)의 유비퀴틴 사슬을 사용하여 명확히 할 수 있습니다. NDD 관련 변이체는 유비퀴틴 사슬 연결 유형 특이적인 DUB 활성 결함을 유발할 수 있다11.

정제된 재조합 DUB 단백질을 사용하는 디-유비퀴틴 절단 분석은 NDD 변이체가 DUB 활성에 미치는 영향을 직접 측정할 수 있습니다. NDD X-linked intellectual disability disorder 105 (XLID105)7,28에서 돌연변이된 USP27X는 여기에 제시된 과정을 모델링합니다. 이 접근법을 통해 기존 및 알려지지 않은 DUB 관련 NDD의 유전자 변이체에 의해 DUB 활성이 어떻게 중단되는지 확인할 수 있습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다음 프로토콜은 competent cell의 다양한 균주에서 발현되는 다양한 친화성 태그를 사용하여 재조합 단백질에 적용할 수 있습니다. 발현되는 단백질에 따라 배양 및 야간 발현 조건에서는 발현 유도, 발현 시간, 발현 온도 및 IPTG 농도에서 OD600 의 최적화가 필요할 수 있습니다. 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 재조합 GST-USP27X 발현 플라스미드를 이용한 유능한 Rosetta 2 E. coli 세포의 형질전환(Transformation of competent Rosetta 2 E. coli cell)과 GST-USP27X 발현 플라스미드

알림: 박테리아 배양의 무균 상태를 유지하려면 미디어 용기가 Bunsen 버너 화염 아래에서 열려 있는 단계를 수행하십시오. 최적의 산소 전달을 위해 궤도가 19 mm - 50 mm이고 속도가 200 rpm29인 벤치탑 온도 제어 쉐이커에서 세균 배양 쉐이킹을 수행하십시오.

  1. 사용 직전에 화학적으로 적합한 Rosetta 2 E. coli 세포 20μL를 얼음에서 해동하십시오. pGEX6P1-USP27X 발현 플라스미드 1-10ng(N-말단 글루타티온-S-전이효소(GST)30 태그 USP27X 인코딩 및 암피실린 내성 포함)을 넣고 얼음에서 5분 동안 배양합니다.
  2. 건식 욕조에서 42°C에서 30초 동안 열 충격. 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다.
  3. 80μL의 실온(RT) SOC 매체를 추가합니다. 37°C에서 200rpm 회전으로 19mm 궤도 벤치탑 온도 조절 쉐이커에서 60분 동안 배양합니다.
  4. 25 μg/L 클로람페니콜 및 50 μg/L 암피실린이 보충된 LB 한천 플레이트에 50 μL의 배양액을 플레이트에 담습니다. 37°C에서 뚜껑이 아래로 향하게 하여 온도 조절 인큐베이터에서 20시간 동안 배양합니다.

2. 발현 플라스미드에서 재조합 단백질의 하룻밤 동안의 세균 발현

참고: 박테리아 배양의 무균 상태를 유지하려면 미디어 용기가 Bunsen 버너 화염 아래에서 열려 있는 단계를 수행하십시오. 최적의 산소 전달을 위해 궤도가 19 mm - 50 mm이고 속도가 200 rpm29인 벤치탑 온도 제어 쉐이커에서 세균 배양 쉐이킹을 수행하십시오. 분광광도계를 사용하여 배양 OD600 을 측정합니다.

  1. 1L의 배척 플라스크에 0.4% 글리세롤이 함유된 초순수 1L에 TB 분말 47.6g을 첨가하여 2L의 TB(Terrific Broth) 배지를 준비합니다. 매체를 30분 동안 오토클레이브하고 RT로 냉각합니다.
  2. 형질전환된 박테리아의 단일 군집을 선택하고 25μg/L 클로람페니콜 및 50μg/L 암피실린이 보충된 10mL의 멸균 LB 배지에 추가합니다. 37°C에서 200rpm 회전으로 19mm 궤도의 벤치탑 온도 제어 쉐이커에서 20시간 동안 배양합니다.
  3. 25 μg/L 클로람페니콜 및 50 μg/L 암피실린이 보충된 TB 배지 1L에 하룻밤 배양 10mL를 추가합니다(시작 배양과 발현 배양의 비율 1:100). 배양 OD600 이 0.5-0.6 사이가 될 때까지 19mm 궤도 벤치탑 온도 제어 Shaker에서 37°C에서 200rpm 회전으로 배양합니다.
  4. 배양액에 50μM의 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 16°C에서 200rpm 회전으로 20시간 동안 배양합니다.
  5. ≥3,000 x g 및 4°C에서 20분 동안 원심분리에 의한 발현 배양의 펠릿 세포. 펠릿을 -80 °C에서 최소 1시간 동안 보관하십시오.
    참고: 이 시점에서 실험을 일시중지했다가 나중에(가급적이면 같은 주에 다시 시작할 수 있음) 실험을 중단할 수 있습니다. 펠릿은 -80 °C에서 장기간 보관할 수 있습니다.

3. 중력-흐름 친화성 컬럼에 의한 단백질 정제

참고: 각 정제에 적합한 레진, 결합, 세척, 용리 및 보관 완충액은 정제되는 재조합 단백질에 따라 다릅니다. SDS-PAGE 버퍼의 세포 펠릿, 상층액, 플로우 스루, 세척 분획 및 용리 분획에서 샘플을 수집합니다. 샘플에 대해 SDS-PAGE 및 Coomassie 염색을 수행하여 정제 성공 여부를 평가합니다. 4 °C에서 정제를 수행하고 얼음 위에서 분획을 처리합니다. 단백질 태그의 절단은 적절한 프로테아제를 사용하여 컬럼 안팎에서 수행하여 관련 프로테아제 특이적 절단 부위를 표적으로 할 수 있습니다.

  1. 레토르트 스탠드에 빈 중력 흐름 컬럼을 고정하고 글루타티온 아가로스 수지로 채웁니다. 2-3mL의 수지를 사용하여 1L의 발현 배양에서 수집된 세포 펠릿을 정제합니다.
  2. 20% 에탄올의 수지 베드 부피 1개로 컬럼을 세척합니다. MS500 완충액 1회(Tris pH 7.5 20mM, NaCl 500mM, TCEP 0.5mM)로 컬럼을 3회 세척합니다. 셀 펠릿을 준비하는 동안 건조를 방지하기 위해 수지가 완충액으로 덮여 있도록 컬럼을 중지합니다.
  3. 세포 펠릿을 4°C에서 해동합니다. 해동된 펠릿에 MS500 완충액 30mL(Tris pH 7.5 20mM, NaCl 500mM, TCEP 0.5mM, 라이소자임 60mg, 프로테아제 억제제 정제 1정)를 추가합니다. 4 °C에서 30분 동안 부드럽게 회전하여 용해합니다.
  4. 피펫 팁에서 분주할 때 용해물이 자유롭게 흐를 때까지 50mL 원심분리기 튜브 또는 금속 비커에서 용해된 세포를 얼음 위에 초음파 처리합니다. 4°C 및 ≥20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 제거합니다.
    알림: 초음파 발생기 설정을 경험적으로 결정하십시오. 총 120 초의 시간이 점성 용해물을 자유롭게 흐르고 투명한 액체로 줄이기에 충분하도록 초음파 발생기를 설정하십시오.
  5. 상층액을 디캔팅하여 비커에 넣고 투명화된 용해물을 컬럼에 로드합니다. 중력 흐름에 의해 컬럼을 통해 용해물을 흐르게 하면서 흐름을 수집합니다. 수집된 플로우 스루(flow through)가 있는 컬럼을 로드하고 컬럼을 통과합니다.
  6. MS500 세척 완충액(Tris pH 7.5 20mM, NaCl 500mM, TCEP 0.5mM)을 최소 2회 레진 베드 용량으로 컬럼을 5회 세척합니다. 세척 흐름을 5mL 분량으로 수집합니다. 각 분획 1μL를 Bradford 시약 100μL에 첨가하여 단백질의 존재 여부를 육안으로 확인합니다. 마지막 세척에서 결합되지 않은 단백질이 더 이상 존재하지 않을 때까지 세척하고 필요한 경우 추가 세척 단계를 추가합니다.
  7. MS500 용출 완충액(10mM의 글루타치온 및 10mM의 NaOH가 보충된 MS500 완충액)을 컬럼을 통해 5mL 용출 분획을 수집하여 단백질을 회수합니다. 100μL의 Bradford 시약에 1μL의 용리액을 추가하여 단백질의 존재 여부를 확인합니다. Bradford 시약이 더 이상 단백질이 존재한다는 것을 나타내지 않는 경우 분획 수집을 중지하십시오.
  8. 침전과 원심분리에 의한 완충액 교환을 수행합니다. 용리액에 4M의 황산암모늄 2부피를 넣고 흐려질 때까지 부드럽게 뒤집은 다음 4°C 및 ≥20,000 x g 에서 30분 동안 원심분리한 다음 다시 5분 동안 원심분리하여 단백질을 침전시킵니다. 각 원심분리 후 단백질 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거하십시오.
  9. 25% 글리세롤이 보충된 MS500에 단백질을 재용해시켜 보관합니다. 단백질 펠릿 또는 단백질을 -80°C의 보관 완충액에 보관합니다.

4. 시험관 내 유비퀴틴 사슬 절단 분석

참고: 이전 보고서 31에 기술된 DUB 특이성을 기반으로 유비퀴틴 사슬 길이 및 연결 유형을 선택하십시오31 또는 경험적으로 결정된 것입니다. 필요한 경우, 이 프로토콜은 정의된 길이 및 연결 유형의 상업적으로 이용 가능한 유비퀴틴 사슬 패널에서 관심 있는 야생형 DUB의 활성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 375-750 ng의 디-유비퀴틴 사슬 양과 1-2 μM의 DUB 농도를 분석의 시작점으로 사용할 수 있습니다27.

  1. 10x DUB 활성화 완충액 (Tris-HCl pH 7.5 500mM, NaCl 500mM 및 TCEP 100mM)을 준비합니다.
  2. 각 DUB에 대한 각 시점에 대해 1x DUB 활성화 완충액(DUB 믹스)에 총 10μL의 정제된 GST-USP27X를 준비합니다. 마스터 믹스를 준비하고 시점으로 나눕니다.
  3. RT에서 10분 동안 DUB 믹스를 배양합니다.
  4. 유비퀴틴 사슬을 추가하기 전에 시간 0에 7μL의 SDS-PAGE 로딩 버퍼를 추가하여 탈유비퀴틸화 반응이 시작되는 것을 방지합니다.
  5. 각 DUB의 각 시점에 10μL 1x DUB 활성화 완충액에 희석된 375ng의 K-63 디-유비퀴틴 사슬을 추가합니다. 총 부피는 반응당 20μL입니다.
  6. 30 °C에서 튜브를 배양하고 7 μL의 SDS-PAGE 로딩 버퍼로 각 시점을 중지합니다.
  7. 유비퀴틴 및 USP27X에 대해 4%-12% 그래디언트 겔 및 면역블롯 7,32로 SDS-PAGE를 수행하여 선택한 시점에 걸쳐 모노-유비퀴틴 존재의 변화를 분석합니다.

figure-protocol-1
그림 1: 연구 설계의 개략도. (A) 재조합 단백질 발현 플라스미드를 이용한 유능한 E. coli 세포의 형질전환. (B) 재조합 deubiquitylase 단백질의 하룻밤 동안의 세균 발현. (C) 중력 흐름 친화성 컬럼을 사용한 재조합 deubiquitylase의 단백질 정제. (D) 듀비퀴틸화 활성을 평가하기 위한 시험관 내 유비퀴틴 사슬 절단 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

USP27X 촉매 활성에 대한 XLID105 관련 변이체의 영향을 확인하기 위해 GST 태그가 부착된 야생형 USP27X 및 XLID105 관련 변이체 F313V, Y381H 및 S404N USP27X 단백질을 박테리아에서 정제했습니다. 이러한 변형체는 USP27X의 USP 촉매 도메인 내에 있습니다(그림 2A). USP27X가 이전에 K63 유비퀴틴 사슬31을 절단하는 것으로 보고되었기 때문에 야생형 USP27X 및 XLID105 관련 변이체 F313V, Y381H 및 S404N USP27X 단백질을 K63 결합 디-유비퀴틴 사슬로 1시간 동안 배양했습니다. 이 샘플은 SDS-PAGE32를 통해 분리하고, 유비퀴틴 및 USP27X 단백질은 면역블로팅을 통해 분석했습니다. 야생형 USP27X는 디-유비퀴틴 절단을 유도하여 모노-유비퀴틴을 생성합니다(그림 2B 및 보충 그림 1). XLID105 관련 F313V, Y381H 및 S404N USP27X 변이체 단백질은 이러한 사슬을 절단하지 않았습니다. F313V, Y381H 및 S404N 변형은 USP27X 촉매 활성을 방해하기 때문에 USP27X 기능 중단이XLID105 7의 기본 메커니즘인 것으로 보입니다. 추가적인 정량화 및 보완 실험이 이전에 보고된 바있다 7.

figure-results-1
그림 2: XLID105 변이체가 USP27X 탈유비퀴틸화 활성에 미치는 영향. (A) 인간 USP27X 단백질 구조의 다이어그램, USP 도메인(보라색)에서 평가된 XLID105 변이체의 잔기 수와 위치를 보여줍니다. (B) GST 태그가 부착된 야생형 USP27X 및 XLID105 변이체(F313V, Y381H 및 S404N)를 표시된 시간 동안 K63 디-유비퀴틴 사슬로 배양했습니다. 면역블롯 분석은 항-GST(USP27X) 및 유비퀴틴 항체를 사용하여 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 그림 2B의 잘리지 않은 블롯. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문은 재조합 USP27X DUB의 발현 및 정제를 위한 프로토콜과 야생형 USP27X 및 NDD 관련 변이체 단백질의 탈유비퀴틸화 활성을 비교하기 위한 시험관 내 유비퀴틴 사슬 절단 분석을 제시합니다. 이 분석은 XLID105 관련 변이체가 USP27X 촉매 활성을 방해한다는 것을 확인했습니다7. 이러한 기계론적 통찰은 XLID105 USP27X 기능 장애 장애로 정의하는 데 도움이 되었습니다.

이 프로토콜은 분자 메커니즘이 잘 이해되지 않은 유전 질환과 관련된 다른 DUB에 적용할 수 있습니다. 특정 관심 DUB에 대한 발현 및 정제 프로토콜의 최적화는 매우 중요합니다. 관심있는 주어진 DUB에 대해 특정 프로토콜이 설명되지 않은 경우 여기에 설명된 방법이 시작점 역할을 할 수 있습니다. 단백질 발현 및 정제 프로토콜을 최적화할 때 중요한 단계에는 (1) 발현 시스템(예: 박테리아 균주, 곤충 세포 또는 포유류 세포), (2) 발현 벡터, (3) 사용할 태그 및 친화성 수지, (4) 성장 조건, (5) 배양량, (6) 추가 정제의 필요성(예: 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토그래피를 통해 ). 이 방법의 이러한 측면과 다른 측면에 대한 구체적인 권장 사항이 논의되었다33.

in vitro 유비퀴틴 사슬 절단 분석은 야생형 또는 돌연변이 DUB의 탈유비퀴틸화 활성을 측정하는 간단한 방법입니다. 유비퀴틴 절단의 시간 종속 분석은 K, m 및 Vmax와 같은 파라미터를 결정할 수 있도록 함으로써 DUB 효소 역학에 대한 유전적 변이의 영향에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이를 통해 촉매 작용을 손상시키는 DUB 활성 부위의 결함(Vmax 감소)과 기판 인식을 손상시키는 결함(KM 증가)을 구별할 수 있습니다. 이 분석의 다양성은 관심 있는 DUB에 대한 고유한 기계론적 정보를 제공하는 데 사용할 수 있는 다양한 유비퀴틴 사슬에서 비롯됩니다. 다양한 길이와 연결 토폴로지의 유비퀴틴 사슬이 상업적으로 이용 가능하여 비전문가도 이 분석에 액세스할 수 있습니다. 특정 DUB는 효소 역학, 결합 인식 및 절단에 대한 고유한 특성을 가지고 있습니다. 이 분석을 위한 중요한 단계에는 (1) DUB의 작업 농도 정의, (2) 최적 반응 시간 결정, (3) 유비퀴틴 사슬 연결 유형 및 길이 선택, (4) 검출 방법 선택이 포함됩니다.

유비퀴틴 사슬 절단 분석은 DUB 활성 7,11에 대한 NDD 변이체의 영향을 측정하여 DUB 활성을 방해하고 비정형 발달을 촉진하는 변이체를 식별하는 데 도움이 됩니다. 이 분석은 유전적 변이가 암 및 신경 퇴행을 포함하여 병리학을 유발하는 다양한 상황에서 사용할 수 있습니다. 기질 독립적 분석법으로, 특정 유비퀴틸화된 단백질 기질에 대한 사전 식별이 필요하지 않습니다. 그러나 이 분석은 유비퀴틴 사슬 절단 활성의 변화를 측정하는 것으로 제한되며 단백질-단백질 상호 작용, 세포 내 국소화 및 번역 후 변형과 같은 DUB 기능에 대한 변이체의 영향을 평가할 수 없습니다. 관심 DUB가 작동하는 광범위한 신호 전달 경로를 식별하려면 이러한 변이체가 개별 NDD를 유도하는 방법을 해결하기 위한 특정 분석을 개발해야 합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 샌포드 리서치(Sanford Research)의 스타트업 펀드로 FB에 자금을 지원했으며, NIH 그랜트 R01CA233700 MJS에 자금을 지원했습니다. 작품은 펠리페 G. 세라노(Felipe G. Serrano, www.illustrative-science.com)가 담당했습니다. GST-USP27X 플라스미드에 대해 Greg Findlay 박사(던디대학교)에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Amersham Protran 0.45 NC 200 mm × 200 mm 25/PKCytiva10600041
황산 암모늄Fisher ScientificAC205872500
AmpicillinFisher ScientificBP1760 25
Anti- Ubiquitin (Mouse monoclonal)BiolegendCat# 646302, RRID:AB_1659269(WB: 1:1000)
Anti-GST (Sheep polyclonal)MRC-PPU 시약 및 서비스Cat# S902A Third bleed(WB: 1:1000) https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
Baffled Culture Flasks 2 LFisher Scientific10-042-5N
Bradford 시약Millipore SigmaB6916-500ML
ChloramphenicolGold BiotechnologyC-105-25
Complete, Protease 억제제 정제Millipore Sigma
Econo-Column 1.5 × 5 cmBio-Rad7371507
Eppendorf ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020
ExcelMicrosofthttps://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
Glycerol GeneseeScientific18-205
IllustratorAdobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
Image StudioLI-COR, Bioscienceshttps://www.licor.com/bio/image-studio/
InkscapeInkscapehttps://inkscape.org/
Invitrogen 4-12% NuPAGE 1mm 12웰 겔Thermo Fisher ScientificNP0322BOX
IPTG(이소프로필-b-D-티오갈락토피라노사이드)Genesee Scientific20-109
IRDye 800CW 당나귀 항염소 IgG 2차 항체LI-COR BiosciencesCat# 926-32214(WB: 1:10000)
IRDye 800CW 당나귀 안티 마우스 IgG 2차 항체LI-COR BiosciencesCat# 926-32212(WB: 1:10000)
Isotemp 디지털 건조 수조Fisher Scientific88860022
K63 Di-UbiquitinSouth Bay Bio LLCSBB-UP0072
LB 한천Genesee Scientific11-119
라이소자임골드 생명공학L-040-100
MaxQ 4000 벤치탑 오비탈 쉐이커Thermo Fisher ScientificSHKE4000-7
MES-SDS 러닝 버퍼Boston Bioproducts IncBP-177
미니 튜브 로테이터Fisher Scientific88-861-051
NuPage LDS 샘플 버퍼 4xThermo Fisher ScientificNP0007
오디세이  Fc ImagerLI-COR Biosciences43214
PageRuler Plus LadderThermo Fisher Scientific26620
pGEX6P1 human USP27XMRC-PPU 시약 및 서비스DU21193https://mrcppureagents.dundee.ac.uk/
pGEX6P1 human USP27X F313VAddgene225715Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X S404NAddgene225717Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
pGEX6P1 human USP27X Y381HAddgene225716Koch et at 2024 (PMID: 38182161)
Pierce Glutathione AgaroseThermo Fisher Scientific16100
PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride)Gold BiotechnologyP-470-10
Polysorbate 20 (Tween 20)Fisher ScientificAC233360010
Rosetta 2 Competent CellsMillipore Sigma71402-M
SimplyBlue SafeStainThermo Fisher ScientificLC6060
SmartSpec 3000Bio-Rad170-2501
SOC 매체Thermo Fisher Scientific15544034
염화나트륨Genesee Scientific18-216
Sonifier 250Branson100-132-135
Sorvall RC 6 Plus 원심분리기Thermo Fisher Scientific46910
TCEP(Tris-(carboxyethyl) phosphine hydrochloride)GoldBiotechnologyTCEP10
Terrific Broth PowderGenesee Scientific18-225
Tris BaseGenesee Scientific18-146
XCell SureLock 미니 셀 및 XCell II 블롯 모듈 써모 피셔 사이언티픽EI0002
5056489001, , , , , , LB 육수 Genesee Scientific 11-118

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morris-Rosendahl, D. J., Crocq, M. -A. Neurodevelopmental disorders: the history and future of a diagnostic concept. Dialogues Clin Neurosci. 22 (1), 65-72 (2020).
  2. Ebstein, F., Küry, S., Papendorf, J. J., Krüger, E. Neurodevelopmental disorders (NDD) caused by genomic alterations of the ubiquitin-proteasome system (UPS): the possible contribution of immune dysregulation to disease pathogenesis. Front Mol Neurosci. 14, 733012(2021).
  3. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annu Rev Biochem. 67 (10), 425-479 (1998).
  4. Pickart, C. M. Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem. 70 (1), 503-533 (2001).
  5. Komander, D., Clague, M. J., Urbé, S. Breaking the chains: structure and function of the deubiquitinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 550-563 (2009).
  6. Yau, R., Rape, M. The increasing complexity of the ubiquitin code. Nat Cell Biol. 18 (6), 579-586 (2016).
  7. Koch, I., et al. USP27X variants underlying X-linked intellectual disability disrupt protein function via distinct mechanisms. Life Sci Alliance. 7 (3), e202302258(2024).
  8. Hao, Y. -H., et al. USP7 acts as a molecular rheostat to promote WASH-dependent endosomal protein recycling and is mutated in a human neurodevelopmental disorder. Mol Cell. 59 (6), 956-969 (2015).
  9. Fountain, M. D., et al. Pathogenic variants in USP7 cause a neurodevelopmental disorder with speech delays, altered behavior, and neurologic anomalies. Genet Med. 21 (8), 1797-1807 (2019).
  10. Santiago-Sim, T., et al. Biallelic variants in OTUD6B cause an intellectual disability syndrome associated with seizures and dysmorphic features. Am J Hum Genet. 100 (4), 676-688 (2017).
  11. Beck, D. B., et al. Linkage-specific deubiquitylation by OTUD5 defines an embryonic pathway intolerant to genomic variation. Sci Adv. 7 (4), eabe2116(2021).
  12. Cho, J., Park, J., Kim, E. E., Song, E. J. Assay systems for profiling deubiquitinating activity. Int J Mol Sci. 21 (16), 1-16 (2020).
  13. Matsui, S., Sandberg, A. A., Negoro, S., Seon, B. K., Goldstein, G. Isopeptidase: A novel eukaryotic enzyme that cleaves isopeptide bonds. Proc Natl Acad Sci USA. 79 (5), 1535-1539 (1982).
  14. Rose, I. A., Warms, J. V. B. An enzyme with ubiquitin carboxy-terminal esterase activity from reticulocytes. Biochemistry. 22 (18), 4234-4237 (1983).
  15. Wilkinson, K. D., Cox, M. J., Mayer, A. N., Frey, T. Synthesis and characterization of ubiquitin ethyl ester, a new substrate for ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase. Biochemistry. 25 (21), 6644-6649 (1986).
  16. Pickart, C. M., Rose, I. A. Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase acts on ubiquitin carboxyl-terminal amides. J Biol Chem. 260 (13), 7903-7910 (1985).
  17. Hadari, T., Warms, J. V. B., Rose, I. A., Hershko, A. A ubiquitin C-terminal isopeptidase that acts on polyubiquitin chains: Role in protein degradation. J Biol Chem. 267 (2), 719-727 (1992).
  18. Woo, S. K., et al. Multiple ubiquitin C-terminal hydrolases from chick skeletal muscle. J Biol Chem. 270 (32), 18766-18773 (1995).
  19. Woo, S. K., et al. Purification and characterization of a new ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-1) with isopeptidase activity from chick skeletal muscle. J Biochem. 121 (4), 684-689 (1997).
  20. Baek, S. H., et al. Molecular cloning of a novel ubiquitin-specific protease, UBP41, with isopeptidase activity in chick skeletal muscle. J Biol Chem. 272 (41), 25560-25565 (1997).
  21. Wilkinson, K. D., et al. Metabolism of the polyubiquitin degradation signal: Structure, mechanism, and role of isopeptidase T. Biochemistry. 34 (44), 14535-14546 (1995).
  22. Hu, M., et al. Crystal structure of a UBP-family deubiquitinating enzyme in isolation and in complex with ubiquitin aldehyde. Cell. 111 (7), 1041-1054 (2002).
  23. Hu, M., et al. Structure and mechanisms of the proteasome-associated deubiquitinating enzyme USP14. EMBO J. 24 (21), 3747-3756 (2005).
  24. Gorka, M., Magnussen, H. M., Kulathu, Y. Chemical biology tools to study deubiquitinases and UBL proteases. Semin Cell Dev Biol. 132, 86-96 (2022).
  25. Faesen, A. C., et al. The differential modulation of USP activity by internal regulatory domains, interactors, and eight ubiquitin chain types. Chem Biol. 18 (12), 1550-1561 (2011).
  26. Mevissen, T. E. T., et al. OTU deubiquitinases reveal mechanisms of linkage specificity and enable ubiquitin chain restriction analysis. Cell. 154 (1), 169-184 (2013).
  27. Kwasna, D., et al. Discovery and characterization of ZUFSP/ZUP1, a distinct deubiquitinase class important for genome stability. Mol Cell. 70 (1), 150-164.e6 (2018).
  28. Hu, H., et al. X-exome sequencing of 405 unresolved families identifies seven novel intellectual disability genes. Mol Psychiatry. 21 (1), 133-148 (2016).
  29. Hartmann, I. Shaker Orbit - Revolving in Space Around the Samples? Eppendorf Lab Academy. Eppendorf Lab Academy. , at https://www.eppendorf.com/us-en/lab-academy/lab-solutions/others/shaker-orbit-revolving-in-space-around-the-samples (2020).
  30. Smith, D. B., Johnson, K. S. Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene. 67 (1), 31-40 (1988).
  31. Ritorto, M. S., et al. Screening of DUB activity and specificity by MALDI-TOF mass spectrometry. Nat Commun. 5, 4763(2014).
  32. Bustos, F., Bustos, F. Immunoblotting using precast gels. , protocols.io (2024).
  33. Wingfield, P. T. Overview of the purification of recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 80, 6.1.1-6.1.35 (2015).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

USP27XSDS PAGEK63

관련 논문