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방법 논문

자외선 B 방사선에 대한 마우스의 만성 노출 연구

2.4K 조회수

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DOI:

10.3791/67368

⸱

2025년 8월 19일

 ,  ,  , 
1Department of Human Genetics and Biochemistry, Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2The Ragon Institute of Mass General, MIT, and Harvard Main Street

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 생쥐에서 자외선 B 노출의 전신 및 국소 피부 영향에 대한 연구를 설명합니다.

초록

자외선 B(UVB) 방사선(280-320nm)은 1928년부터 발암 물질로 인식되어 태양 노출을 최소화했습니다. 그러나 역학 연구에 따르면 태양 노출은 기대 수명 증가, 심혈관 질환 및 결장암 및 자궁내막암과 같은 특정 암의 발병률 감소와 관련이 있습니다. UVB 노출은 또한 간 대사에 영향을 미치고 간세포 지방독성으로부터 보호하며 대사 건강에 영향을 미칩니다. 이러한 효과는 부분적으로 비타민 D 합성으로 인한 것이지만 일부는 비타민 D와 무관합니다. 또한 UVB를 이용한 광선 요법은 면역 조절 특성을 가지고 있으며 백반증 및 건선과 같은 피부 상태를 치료하는 동시에 전신 면역 체계에도 영향을 미치는 데 사용됩니다. UVB의 광범위한 생리적 효과를 고려할 때 이러한 효과의 대부분 뒤에 숨은 메커니즘을 이해하는 데는 격차가 있습니다. 우리는 매일 낮은 수준의 UVB 노출이 수컷 쥐의 먹이 찾기 행동을 향상시키지만 피부 지방 세포의 그렐린 분비 증가로 인해 암컷에서는 그렇지 않다는 것을 보여주었습니다. 여성의 경우 에스트로겐은 지방세포의 p53 활성을 억제하여 그렐린 상승을 차단하고 UVB 방사선에 대한 성별 의존적 반응을 나타냅니다. 또한 표피 각질세포에서 UVB에 의해 유도된 p53 활성화는 시상하부-뇌하수체-생식선 축을 활성화하여 성적 행동과 난소 생식력을 유도합니다. 이 논문은 C57BL/6J 마우스 모델을 사용하여 낮은 UVB 방사선의 국소 및 전신 효과를 연구하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 핵심 요소에는 UVB 선량의 정확한 보정, 주거 조건, 일관된 노출을 보장하기 위한 신중한 제모가 포함됩니다. 쥐는 건강 및 행동 변화를 모니터링하면서 몇 주에 걸쳐 단계별 UVB 노출 체제를 받습니다. 색소 침착 측정을 통한 방사선 효율 검증 방법도 자세히 설명되어 있습니다. UVB 용량 보정, 엄격한 동물 관리 및 방법론적 통제를 강조함으로써 이 프로토콜은 UVB 노출의 포괄적인 효과에 대한 연구를 촉진하여 치료적 이점과 위험에 대한 미묘한 이해에 기여할 것입니다.

서론

지구 표면에 도달하는 태양 복사의 주파수에는 자외선(UV), UVA 방사선(320-400nm) 및 UVB 방사선(280-320nm)이 포함됩니다. UVB는 돌연변이 유도제입니다. UV는 1928년에 발암 물질로 인식되었으며1, 1900년대 중반부터는 피부암을 예방하기 위한 예방 조치로 태양 노출을 줄이는 것이 권장되었습니다2. UVB는 분명히 피부암의 환경적 유발 요인이지만, 지난 10년 동안의 연구3와 우리 그룹의 최근 연구 4,5,6에 따르면 UVB는 생리 시스템에 광범위한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 20년 동안 추적된 여성 코호트를 대상으로 한 연구에 따르면 태양을 피하지 않은 여성의 기대 수명은7년을 피한 여성에 비해 2년 더 긴 것으로 나타났습니다. 추가 연구에서는 태양 노출이 심혈관 질환 및 전체 사망률 감소와 상관관계가 있음을 보여주었습니다 8,9,10. 햇빛과 결장암 및 자궁내막암 사이에도 역상관관계가 보고되었습니다8. UVB 노출은 또한 간 대사를 유도하고11, 간세포 지방독성 및 대사 질환으로부터 보호하며, 엔돌핀 및 성 관련 행동에 긍정적인 영향을 미칩니다 3,6. 이러한 증거는 태양 노출을 피하는 것이 인체 건강에 해로운 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 태양 노출의 유익한 효과는 주로 비타민 D 생성 유도에 기인하지만 햇빛의 건강상의 이점 중 적어도 일부는 비타민 D 수치와 무관합니다 4,6,12

피부는 신체에서 가장 큰 기관이며 환경 스트레스 요인에 대한 첫 번째 방어선입니다. 피부의 표피층과 진피층은 미분화, 자가 재생 각질세포와 멜라닌 세포로 구성된 기저 표피층에 의해 분리됩니다10. 말단 분화의 증가 단계에서 각질 세포는 상부 표피층에서 발견됩니다. 진피에는 섬유아세포와 혈관이 포함되며 피하조직은 주로 지방세포로 구성됩니다. 안드로겐 수용체 및 코르티코트로핀 방출 호르몬 수용체와 같은 호르몬의 여러 수용체가 피부에서 발현되기 때문에 피부는 피부-내분비 기관이며, 이는 호르몬이 측분비 및 자가분비 경로에 의해 피부의 과정에 영향을 미친다는 것을 시사합니다 13,14,15. 피부는 또한 호르몬의 생산자입니다. 그러나 몇 가지 예외를 제외하고는 피부에서 호르몬 생성과 혈액으로의 방출이 문서화되지 않았으며 발현의 유발 요인도 알려져 있지 않습니다(16의 검토).

UVB는 피부 질환에 치료 가능성이 있는 것으로 나타났습니다. 소랄렌-UVA 및 협대역 UVB 요법을 포함한 광선 요법은 전신 백반증의 주요 치료 방식입니다17. 광선 요법에 대한 반응은 치료 시작 후 6개월에 환자의 74%, 환자의 75%에서 발생했습니다18. 백반증에서 광선 요법의 작용 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 치료 작용에는 세포 주기 동역학에 대한 효과, 사이토카인 발현의 변화, 멜라닌 세포에 대한 효과 및 면역 조절의 조합이 포함됩니다. 수많은 연구에서 광선 요법이 피부 면역에 미치는 영향을 조사했습니다 19,20,21; 그러나 특히 백반증의 맥락에서 전신 효과는 잘 이해되지 않습니다. 광선 요법 치료 후 전염증성 사이토카인의 감소와 조절 T 세포의 증가가 나타난 건선과 달리 백반증에서는 UV 광선 요법으로 조절 T 세포의 수가 감소했습니다21.

UVB는 뇌14,15, 부신22, 난소 5,6, 고환6, 간11 및 림프절23에 영향을 미치지만 UVB가 전신 시스템을 조절하는 메커니즘은 대부분 알려져 있지 않습니다. 이 연구 프로토콜은 UVB 노출의 포괄적인 효과에 대한 연구를 용이하게 하는 UVB 노출의 전신 및 국소(피부) 효과를 연구하기 위한 마우스 모델을 설명합니다. UVB 마우스 모델은 피부 생리학, 피부과 및 피부암, 특히 흑색종에 폭넓은 관심을 받고 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 피부 관련 과학 연구 질문에 대한 UVB 마우스 모델을 개발하기 위한 간단하면서도 강력하고 효과적인 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 생리학적 조건에서 제모 및 UVB 노출과 관련된 피부 홍반 문제를 극복하는 방법을 설명하고 UVB가 피부에 미치는 국소 및 전신 효과를 연구하는 데 효과적입니다.

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프로토콜

설명된 모든 실험 절차는 텔아비브 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC 허가: 01-20-043)의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 실험을 위한 마우스의 습관화

  1. 실험자의 IACUC 프로토콜에 따라 상업 공급업체로부터 구매하거나 사내에서 사육하여 7주에서 8주 된 C57BL/6J 마우스를 얻습니다. 이 프로토콜은 C57BL/6J 배경에서 15주 된 마우스를 테스트하지만 프로토콜은 다른 마우스 계통 및 더 어린 연령(< 7주)에 대해 보정되어야 합니다.
    참고: 다양한 연령 그룹의 마우스를 사용하기 위한 프로토콜은 실험이 수행될 기관의 IACUC의 승인을 받아야 합니다. 동물의 건강 상태에 대한 세부 정보가 제공됩니다(보충 표 1).
  2. 실험 시작 전 최소 7일 동안 마우스를 습관화합니다. 습관화는 운송 및 물류 후 생쥐에게 매우 중요합니다.

2. 쥐 수용

  1. 표준 온도 22 ± 1°C 및 습도 32%-35%에서 12:00 시간(조명 시간: 07:00 - 19:00 시간, 어두운 시간: 19:00-07:00 시간)의 표준 어두움/빛 주기로 표준 침구와 물을 자유롭게 이용할 수 있는 표준 침구가 있는 가정용 케이지에 동물을 가두십시오.
    참고: 우리는 제한된 식이 접근에 대해 이 프로토콜을 테스트했으며 이러한 실험 조건에서도 잘 작동합니다.
  2. 케이지당 쥐의 수가 체중, 새끼 크기 및 실험 가설과 일치하는지 확인하십시오.

3. 면도 및 제모

  1. 면도하기 전에 5% 이소플루란과 1L/min 산소로 설정된 마취 기화기에 연결된 이소플루란 챔버에 마우스를 놓습니다.
    알림: 여성 실험자는 이소플루란을 사용하는 동안 노출이 심각한 건강에 위험을 초래할 수 있으므로 주의해야 하며 임산부는 어떤 형태로든 피해야 합니다.
  2. 쥐가 움직이지 않고 일관되게 호흡하는지 확인하십시오. 건조함을 방지하기 위해 안구 연고를 사용하십시오.
  3. 면도기(면도날 치수 LxWxH: 204 x 50 x 41mm)를 켜 고 마우스 피부와 평행하게 잡습니다. 면도기의 면도기를 앞으로 부드럽게 움직입니다. 기계를 마우스 피부에 밀어 넣지 마십시오. 몇 차례의 면도는 쥐의 등쪽에서 충분히 면도해야 합니다. 방사선 노출을 시작하기 전에 등쪽 영역의 50%-60%가 면도되도록 마우스를 등쪽으로 면도합니다(그림 1). 일반적으로 약 0.5cm의 털 재성장 패치가 있을 때마다 쥐를 다시 면도하십시오.
    알림: 동물의 피부를 다치게 하거나 찢어지지 않도록 면도기를 조심스럽게 사용하십시오. 실험자는 면도기를 가능한 한 피부와 평행하게 유지해야 합니다. 머리카락 면도의 빈도는 쥐에게 제공되는 변형과 실험적 치료 유형에 따라 다릅니다.
  4. 한 번에 하나의 케이지에서 쥐를 마취한 다음 면도합니다. 면도 후 면도를 사용하여 면도한 부위에 제모 크림(화장솜 어플리케이터를 덮을 정도)을 바릅니다. 제모 크림을 동물의 눈에 더 가깝게 노출시키지 않도록 주의하십시오. 그렇지 않으면 심각한 합병증과 가려움증이 발생할 수 있습니다.
  5. 1-2분 후, 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)에 담근 조직으로 해당 부위를 부드럽게 씻어 마우스 몸에서 제모 크림의 흔적을 제거하여 달라붙은 모발의 흔적을 제거합니다.
    참고: 제모 크림을 사용하는 시간(> 5분)을 연장하면 생쥐의 피부에 해를 끼칠 수 있으므로 피해야 합니다. PBS의 온도가 상온의 주변 온도이고 너무 춥지 않은지 확인하십시오.
  6. 연조직으로 면도한 부위를 말린 다음 케이지 침구가 있는 깨끗하고 건조한 회복 케이지에 쥐를 넣습니다. 쥐가 의식을 되찾을 때까지 면밀히 관찰하십시오.
    알림: 적외선 램프는 세척 단계 후 마우스의 체온이 급격히 떨어지지 않도록 할 수 있습니다.
  7. 생쥐를 ab libitum 음식과 물과 함께 집 우리에서 쉬게 하고 첫 번째 UVB 노출 전 최소 10일 동안 면도 절차에서 회복하십시오.
    참고: 면도 후 10일 이전에 쥐가 UVB에 노출되면 피부 홍반이 발생할 수 있습니다.

4. UVB 노출 설정

  1. 긴팔 셔츠, 바지, 실험실 가운, 닫힌 신발, 이중 장갑, 안면 보호대를 착용하십시오. 실험자의 UVB 노출을 방지하기 위해 10mm 플렉시 유리 덮개를 아래로 내린 생물학적 후드 내부에 조사를 수행합니다.
  2. 그림 2와 같이 UVB 램프를 켜지 않고 투명한 플렉시 유리 챔버에 놓습니다.
  3. UVB 램프를 켜고 강도가 일정해질 때까지 작동하도록 합니다. UVB 측정 헤드가 장착된 UVX 복사계를 사용하여 모니터링되는 대로 UVX 복사계를 켜서 배치합니다. UVX 복사계를 20mW/cm2로 켜고 복사계의 설정을 읽으십시오. UVB 램프를 예열하고 최소 2분 동안 안정화하십시오. 램프를 사용할 준비가 되면 UVX 복사계를 꺼냅니다.
  4. 조사를 위해 가정용 케이지 이외의 깨끗한 케이지를 사용하고 UV 램프 아래 생물학적 후드에 놓습니다. 각각의 UV 또는 모의 노출에 대해 UV 램프를 켜거나 끄고 치료하기 전에 마우스를 조사 케이지로 옮깁니다. 충분한 공간을 제공하기 위해 한 번에 2마리의 쥐만 치료하십시오.
    참고: 챔버의 바닥 면적은 500cm2이고 내부 높이는 14cm로 조사 중에 마우스가 서로 올라가지 않고 자유롭게 움직일 수 있도록 했습니다. 노출 챔버를 사용하는 이유는 노출 중에 마우스가 서로 겹치는 것을 방지하고 모든 마우스가 동일한 양의 UVB 노출을 받도록 하기 위해서입니다. 챔버에 두 마리 이상의 쥐를 도입하면 쥐가 서로 올라가는 시나리오가 발생하여 각 마우스에 제공되는 UVB 선량에 불일치가 발생합니다.
  5. 계산기를 사용하여 마우스를 원하는 UVB 강도에 노출시키는 데 필요한 시간을 계산합니다. 예를 들어, UVX 복사계가 디스플레이 화면에 2 mW/cm2 를 표시하고 마우스에게 줄 원하는 노출이 50 mJ/cm2 인 경우, UV 램프가 켜져 있는 동안 UV 조사 챔버에서 마우스를 25초 동안 노출시킵니다.
    알림: 시작하기 전에 4.1단계에서 언급한 대로 적절한 보호 장비를 착용하십시오. 치료 기간 동안 노출 시간은 20-120초 사이였습니다. 그러나 지속 시간은 UVB 램프의 방사선 강도에 따라 달라질 수 있으므로 각 치료에 대해 계산해야 합니다. 이 프로토콜에서는 일반적으로 체중 감소, 심한 피부 화상, 출혈, 홍반, 무관심 또는 호흡 곤란을 포함한 통증 신호의 징후가 보이지 않기 때문에 마우스는 연구에서 제거되지 않을 것으로 예상됩니다.
  6. 수컷과 암컷 마우스를 별도로 노출시키고 행동 연구를 위한 냄새의 교차 오염을 방지하기 위해 각 성별 사이에 소독제로 챔버를 청소합니다. 추가 처리로 처리된 마우스의 다른 그룹 또는 유전적으로 형질전환 또는 대조군 동물이 노출된 경우, 두 그룹 간에 다른 알려지지 않은 요인의 교차 오염을 방지하기 위해 각 그룹의 노출 사이에 챔버를 청소합니다.

5. UVB 노출

  1. UVB 램프를 켜 고 4.1단계부터 설정합니다. 4.5로 설정합니다.
  2. 원하는 시간 동안 홈 케이지에서 노출 챔버로 마우스를 옮깁니다. 15W, 302nm UVB 전구가 장착된 XX-15 스탠드를 사용하여 8주 동안 원하는 실험일(여기서는 주 5일) 동안 마우스를 하루에 한 번 UVB에 노출시킵니다.
    참고: 노출 기간은 주관적이며 과학적 질문에 따라 다릅니다. 동물은 피부 홍반이 발생해서는 안 됩니다. 홍반이 발생한 경우 즉시 노출을 중단하고 수의사에게 보고하십시오. 주말을 제외하고 주당 5일의 노출을 사용했습니다. UVB 선량의 빈도는 이 프로토콜과 유사한 조건에서 줄일 수 있지만 추가 노출에는 실험자의 보정이 필요합니다.
  3. C57BL/6J 마우스 계통에서 아홍수 용량인 50mJ/cm2의 UVB 선량에 마우스를 노출시킵니다.
    참고: 50mJ/cm2 의 UVB 선량은 아홍중 선량이며 실험 마우스에서 8주 동안 이 선량을 사용했습니다. 다른 실험에서는 DNA 손상을 연구하기 위해 200mJ/cm2 의 단일 UVB 노출을 사용했습니다4.
  4. 모의 조사된(UVB 노출되지 않은) 면도한 마우스를 UVB 램프를 켜지 않고 동일한 시간 동안 방사선 챔버에 넣고 UVB 노출 대조군으로 사용합니다.
    참고: 마우스는 신공포증이 있기 때문에 마우스를 대상으로 한 실험에는 항상 실험군과 동일한 유사 치료를 받는 대조군이 있어야 합니다.

6. UVB 노출 분석

참고: 마우스는 AVMA 지침에 따라 CO2 질식을 사용하여 안락사시켰습니다.

  1. 방사선 효율을 검증하기 위해 이전에 설명한 바와 같이 피부 분광 광도계 또는 유사한 장비를 사용하거나 면역염색 피부 생검 후 Fontana Masson 염색을 통해 귀 및 꼬리 색소 침착(그림 2)을 측정합니다4.
  2. 진피 분광 광도계를 사용한 검증: 깨끗하고 일반 흰색 종이를 사용하여 기준선을 설정하도록 진피 분광 광도계를 보정합니다. 보정이 완료되면 측정 센서를 마우스의 귀나 꼬리에 놓고 멜라닌 강도 판독값을 기록해 둡니다. 모의 UVB 방사 및 UVB 방사 마우스의 멜라닌 수치는 그림 3에 나와 있습니다.
  3. 면역형광을 통한 검증: 마우스 피부 생검(2cm x 2cm)을 4% 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀 블록에 포매합니다. 10μm 두께의 조직 절편을 항-CPD 항체(1:100의 농도로 사용)24 로 4°C에서 밤새 염색한 후 형광 표지 2차 항체(염소 항토끼 Alexa-594 접합 2차 항체를 1:1000의 농도로)24 실온에서 1시간 동안 염색합니다. DAPI로 조직을 대조염색하고 형광 현미경을 사용하여 이미지를 얻습니다.
  4. Fontana Masson 염색을 통한 검증: 마우스 피부 생검을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 파라핀 블록에 포획합니다. 질산은 및 염화금 용액으로 Fontana Masson 염색 프로토콜4 를 사용하여 멜라닌에 대해 10μm의 조직 조각을 염색합니다. Nuclear Fast Red Solution으로 조직 생검을 대조염색하고 조직 마운트를 사용하여 장착한 다음 현미경에서 명시야 이미지를 캡처합니다.

7. 동물 관리

  1. 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 동물 실험을 수행합니다.
  2. 매주 쥐의 체중을 측정하여 기본 건강 상태를 평가합니다. 실험에서 측정한 사이에 체중이 15% 감소> 있는 동물을 제거합니다. UVB 노출로 인한 심한 피부 화상, 출혈, 홍반, 무관심 또는 호흡 곤란을 포함한 통증 신호를 보이는 동물을 제거하고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 따라 희생합니다.

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결과

이 방법 논문은 UVB 노출 마우스 모델을 생성하는 자세한 단계별 절차를 언급합니다. 도 1은 UVB 노출 전의 대표적인 C57BL/6J 마우스의 등쪽 면도를 명확하게 나타내며, 등쪽 면적의 50%-60%가 면도되었음을 나타낸다. 면도 프로토콜은 피부과 연구에 가장 중요한 피부 홍반의 징후를 보이지 않습니다. 그림 2는 플렉시 유리 챔버에 배치된 분리된 UVB 노출 챔버에서 UVB 램프를 사용하여 마우스에 대한 UVB 노출 설정을 보여줍니다. 이 설정은 우리가 사내에서 개발한 것으로, 저렴하고 효율적이며 실험자 친화적이며 유지 보수가 적습니다. 그림 3은 4주 동안 UVB 노출 후 피부 색소 침착의 점진적인 증가를 통한 UVB 노출 효과의 대표적인 결과를 보여줍니다. 마우스의 피부 색소 침착은 진피 분광 광도계를 사용하여 측정되었습니다. 이러한 대표적인 결과는 개념 증명...

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토론

UVB는 오랫동안 피부암의 환경적 위험 요소로 인식되어 왔습니다. 그러나 최근 연구에서는 UVB 효과의 더 넓은 스펙트럼을 조명했습니다3. UVB의 전신 효과에 대한 더 깊은 이해를 제공하는 연구가 필요합니다. 임상 환경과 비교하여 기초 연구에 사용되는 다양한 복용량은 UVB 효과에 대한 이해를 복잡하게 만들고 이러한 격차를 해소하는 연구의 중요성을 강조합니다.

여기에 설명된 C57BL/6J 마우스의 UVB 노출 프로토콜에는 신뢰성과 재현성을 보장하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 등쪽 피부 표면 전체에 균일한 UVB 노출을 보장하려면 정밀한 면도와 제모가 필수적이며, UVB 복용량을 점진적으로 늘리면 급성 피부 손상을 예방하고 현실적인 노출 시나리오를 모방하는 데 도움이 됩니다. 색소 침착 측정 및 피부 생검을 통한 방사선 효율의 검증은 프로토콜의 또 다른 강점입니다. 이...

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공개 사항

저자에게는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

C.L.은 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그래머(보조금 계약 번호 726225), 복합 인간 질병 센터의 I-CORE 유전자 조절(번호 41/11) 및 이스라엘 과학 재단(ISF; 보조금 129/13)에 따라 유럽 연구 위원회의 보조금 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소독제 아미티 인터내셔널해당 없음
노출 챔버자체 제작해당 없음
제모 크림비트해당 없음
면도기하이니거707-303 120V 미국
이소플루란 피라말 중환자 치료해당 없음
이소플루란 시스템켄트 사이언티픽수의사Flo-1210S
PBS시그마 알드리치TMS-012 시리즈
플렉시 유리 챔버자체 제작해당 없음
UVB 램프자외선 제품XX 시리즈 - 15W
UVX 복사계자외선 제품97-0015-02

참고문헌

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