방법 논문

일과성 국소 허혈과 결합된 급성 고혈당증에 의해 유도된 출혈성 변형의 마우스 모델

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DOI:

10.3791/67371

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2024년 11월 15일

 ,  ,  , 
1Hubei Key Laboratory of Cognitive and Affective Disorder, Institute of Biomedical Sciences, School of Medicine, Jianghan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

정오 공지

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요약

본 연구는 급성 고혈당증이 있는 C57BL/6 마우스에서 중대뇌동맥 폐색/재관류(MCAO/R)를 사용하여 재현성이 높은 출혈성 변형(HT)의 동물 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

출혈성 변형(HT)은 허혈성 뇌졸중(IS) 후 혈전용해 요법의 결과로 발생할 수 있는 심각한 합병증으로, 재조합 조직 플라스미노겐 활성제(rt-PA)의 임상 적용에 상당한 제한을 가합니다. 불행히도, 현재 임상 실습에서 HT에 사용할 수 있는 효과적인 중재는 없습니다. 따라서 HT의 발병기전을 규명하고 효과적인 중재 전략을 개발하기 위해 안정적이고 신뢰할 수 있는 실험동물 모델이 시급히 필요합니다. 이 연구는 일과성 국소 허혈(tMCAO)과 결합된 급성 고혈당증에 의해 유발되는 HT의 마우스 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시했습니다. 수컷 C57BL/6J 마우스에 고혈당을 유도하기 위해 30% 포도당을 주입한 후 재관류와 함께 60분 동안 tMCAO를 투여했습니다. 경색 용적, 혈액뇌장벽(BBB)의 무결성 및 두개내 출혈 정도는 MCAO 후 24시간에 평가되었습니다. 그 결과, 포도당 주사가 일시적인 고혈당증(14.3-20.3 mmol/L)을 유발하여 경색 부피와 HT 발생률을 모두 유의하게 증가시키는 것으로 나타났습니다. Hematoxylin-eosin(H&E) 염색은 고혈당 마우스의 경색 영역 내에서 상당한 출혈성 병변을 나타냈습니다. 또한, 고혈당 마우스는 Evans blue(EB) 및 FITC-Dextran의 더 심각한 누출에서 알 수 있듯이 악화된 BBB 파괴를 보였습니다. 결론적으로, 급성 고혈당증은 tMCAO의 마우스 모델에서 안정적이고 일관되게 거시적 HT를 초래했습니다. 이 재현 가능한 모델은 HT의 병리학적 메커니즘을 조사하고 해당 치료 개입을 개발하기 위한 귀중한 도구를 제공합니다.

서론

뇌경색은 장애의 주요 원인이며 전 세계 성인의 두 번째 주요 사망 원인입니다1. 급성기는 뇌경색의 진행에 중요한 역할을 하며, 질병 치료의 중추적인 시점 역할을 합니다. 반그림자 부위의 혈류를 조기에 적시에 회복하는 것은 추가적인 뇌세포 사멸을 예방하는 데 필수적이며, 혈전용해술과 중재적 요법이 급성 뇌경색(ACI) 치료의 핵심입니다. 그러나 허혈성 뇌졸중 환자의 15%-30%에서 발생하는 혈전용해술 및 중재적 치료 후 출혈성 변형(HT)은 상당한 합병증을 일으키기 때문에 그 적용이 어느 정도 제한된다 2,3. HT의 발생은 사망률과 장애의 위험을 현저히 증가시켜 ACI의 예후에 영향을 미칩니다. 따라서 HT의 병리학적 기전을 조사하고 효과적인 치료 표적을 식별하는 것은 임상적으로 매우 중요합니다.

현재 실색전증에 의한 중대뇌동맥 폐색(MCAO)은 설치류의 HT 모델로 자주 활용되고 있다4. 장기간의 폐쇄는 피질과 선조체를 포함하는 대규모 뇌경색을 유발할 수 있으며, 잠재적으로 2차 HT로 이어질 수 있습니다. Thread MCAO는 개두술이 필요하지 않고 재현성이 높으며 인간 뇌졸중과 유사한 국소 뇌 손상 및 HT를 생성합니다. 그러나 이 기계적 모델에는 높은 조기 사망률과 낮은 장기 생존율5 등 몇 가지 뚜렷한 단점이 있습니다. 자주 사용되는 또 다른 HT 모델은 혈전용해(thrombolysis) 모델로, 먼저 표적 혈관에서 혈전 형성을 유도한 다음 혈전용해제(예: rt-PA, 와파린)를 사용하여 혈전을 용해시켜 허혈성 뇌졸중에서 HT의 임상 과정을 모방합니다 6,7. 임상적 혈전용해 요법의 병리학적 과정을 상당 부분 복제하고 있음에도 불구하고, rt-PA 또는 와파린에 의해 유도된 HT 동물 모델은 구현하기가 복잡하고 높은 동물 폐사율뿐만 아니라 다양한 발생률 및 출혈 위치와 관련이 있습니다. 뇌경색 후 HT에 대한 기초 및 임상 중개 연구를 진행하기 위해서는 조작이 쉽고 안정성이 높은 재현 가능한 HT 동물 모델을 확립하는 것이 필수적입니다.

고혈당증은 뇌허혈/재관류(I/R) 후 HT의 중요한 원인입니다8. 여러 후향적 연구에서 기계적 혈전제거술을 받은 환자의 임상 데이터를 분석한 결과, 입원 시 혈당 수치 상승이 자발적 HT 발병률 증가와 관련이 있음을 밝혔다3. 당뇨병성 뇌졸중 환자에서 고혈당증은 HT의 위험을 현저히 증가시키고 더 심각한 신경학적 결손을 초래한다 9,10. 연구자들은 MCAO를 통해 당뇨병 동물 모델에서 대뇌 I/R을 유도하여 HT 모델을 개발하였습니다. 그러나 당뇨병-MCAO 모델은 실험 기간이 길고 절차가 복잡하며 비용이 많이 듭니다11,12. HT의 신뢰할 수 있는 모델은 포도당의 복강내 주사를 통해 급성 고혈당을 유도하고 봉합사 기술에 의해 생성된 대뇌 I/R 모델과 통합함으로써 확립될 수 있습니다. 이 방법은 일정한 출혈 위치로 쉽게 수행할 수 있으며 뇌졸중 후 고혈당증의 임상적 특징을 효과적으로 모방합니다. 그러나 허혈 시간 및 포도당 농도와 같은 중요한 조건에는 상당한 차이가 있습니다. 또한, 모델의 안정성과 HT의 발생률은 서로 다른 문헌에서 일치하지 않습니다.

본 연구그룹은 HT 모델을 확립하기 위해 급성 고혈당증-MCAO 방법을 광범위하게 활용했습니다. 또한, 허혈 시간, 혈당 농도, HT 발생률 및 동물 폐사율 간의 관계를 조사하기 위해 포괄적인 일련의 실험을 수행했습니다. 이러한 실험은 궁극적으로 뇌경색 후 HT 모델을 만들기 위한 최적의 조건을 식별하는 데 도움이 되었습니다. 이 연구는 색전성 MCAO와 결합된 30% 포도당의 복강내 주사를 사용하여 급성 고혈당증 유발 HT 모델을 확립하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

실험 프로토콜은 Jianghan University의 Institutional Animal Care and Use Committee(JHDXLL2024-080)의 승인을 받았으며 중국 질병통제센터(Center for Disease Control of China)에서 발행한 실험 동물 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서는 체중이 21-26g인 성인 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용했습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물 그룹화 및 급성 고혈당 유발

  1. Jianghan University의 실험실 동물 센터에 있는 쥐를 12시간 명암 주기가 제어된 환경(20–22°C, 50%-55% 습도)에 음식과 물을 자유롭게 수용합니다.
  2. 마우스를 Sham + 식염수(n = 12), Sham + 포도당(n = 12), MCAO + 식염수(n = 12) 및 MCAO + 포도당(n = 20)의 네 그룹으로 무작위로 나눕니다.

2. 수술 전 준비

참고: 모든 실험용 마우스는 수술 전 12시간 동안 금식했습니다.

  1. 절개 부위에 전신 진통제(meloxicam, 5mg/kg 피하)와 국소 마취(부피바카인, 피하 2mg/kg)를 수술 전후에 투여합니다.
  2. 모든 수술 기구, 면봉 및 수술용 봉합사를 121°C 및 15psi의 조건에서 30분 동안 고압멸균하여 멸균합니다.
  3. 수술 플랫폼과 주변 작업 영역을 75% 에탄올로 닦고 온도를 37°C로 설정한 상태에서 가열 스위치를 켭니다.
  4. 마취 유도실에서 3% 이소플루란-20% 산소 가스 혼합물로 마우스를 마취합니다. 그런 다음 발가락 핀치 반사를 평가하여 마취 깊이를 테스트합니다.
  5. 엎드린 자세로 수술대에서 마우스를 움직이고 마우스의 코를 콧방울에 빠르게 삽입합니다. 노즈 콘으로 가는 가스 흐름을 열어 마취 유도 챔버로의 흐름을 차단합니다. 마취 유지를 위해 이소플루란의 비율을 2%로 조정하고 가스 혼합물의 흐름을 0.4mL/분으로 설정합니다.
  6. 수술 중 수분을 유지하기 위해 아이젤을 마우스의 눈에 바르십시오.
  7. 동물 가위를 사용하여 목 부분의 수염을 면도하십시오. 소독제 면봉을 사용하여 요오드와 70% 에탄올을 번갈아 가며 바르면 피부를 청소하고 소독합니다.
  8. 멸균 거즈를 목에 덮고 구멍을 잘라 수술 부위를 노출시킵니다.

3. 기준선 대뇌 혈류 측정

  1. 동물 가위를 사용하여 두피 부위의 수염을 면도하십시오. 소독용 면봉을 사용하여 요오드와 70% 에탄올을 번갈아 가며 바르면 두피를 청소하고 소독합니다.
  2. 전두부 부위의 피부를 1.0cm 길이의 정중선으로 절개하여 두개골 천문이 드러나게 합니다. 두개골을 생리식염수로 촉촉하게 유지한다.
  3. 레이저 도플러 유량 측정(LDF) 기기를 준비하고 LDF 프로브 팁을 왼쪽 두정골 두개골 표면에 수직으로 유지합니다(브레그마 뒤쪽 1mm, 측면 5mm). FLUX가 안정되고 기준 값을 기록하면 됩니다.
    참고: FLUX의 측정 단위는 관류 단위(PU)이며 측정 범위는 0-1000PU입니다. 레이저 도플러 유량 측정의 이상적인 기준선 CBF는 >600 PU입니다. 변동 범위가 5% 미만인 10초의 연속 주기는 유효한 FLUX 판독값으로 간주됩니다.
  4. 5.0 PGA 흡수성 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 분리하여 봉합합니다. 디클로페낙 나트륨 젤과 무피로신 연고를 상처에 바른다.

4. MCAO 수술 절차

참고: MCAO는 이전에 Chiang et al.13에서 설명한 대로 수정된 스레드 폐색 방법을 사용하여 수행됩니다.

  1. 마우스를 누운 자세로 부드럽게 뒤집고 수술 절차 15분 전에 마우스에게 복강내 30% 포도당(7.2mL/kg) 또는 생리식염수를 투여합니다.
    참고: Sham + glucose 및 MCAO + glucose 그룹의 마우스는 포도당의 복강 내 주사를 받았습니다. Sham + 식염수 및 MCAO + 식염수 그룹의 마우스는 일반 식염수의 복강 내 주사를 받았습니다.
  2. 동물 가위를 사용하여 목 부분의 수염을 면도하십시오. 소독제 면봉을 사용하여 요오드와 70% 에탄올을 번갈아 가며 바르면 피부를 청소하고 소독합니다. 멸균 거즈를 목에 덮고 구멍을 잘라 수술 부위를 노출시킵니다.
    참고: 경동맥을 최적으로 시각화할 수 있도록 절개 부위가 똑바로 유지되도록 합니다.
  3. 메스를 사용하여 목의 복부 부분을 1.5cm 정도 정중하게 절개합니다. 수술용 핀셋을 사용하여 피하 조직과 표재성 근막을 분리하십시오.
    참고: 경동맥을 최적으로 시각화할 수 있도록 절개 부위가 똑바로 유지되어야 합니다.
  4. 표재성 근막 아래에서, 턱밑샘과 세 개의 근육에 의해 형성된 역삼각형을 찾으십시오 : 기관 위의 정중선에 위치한 sternohyoid; 이위근(digastric muscle)의 뒤쪽 배는 반짝이는 흰색 힘줄 부분으로 알아볼 수 있습니다. 마지막으로 흉골유방근(sternomastoid muscle)입니다.
  5. 역삼각형 내에서 둔기 박리를 수행하여 좌측 총경동맥(CCA)을 식별하고 분리합니다.
  6. CCA에 인접한 미주신경과 혈관을 둘러싼 점막 조직을 안과 겸자를 사용하여 절개합니다. 5.0 폴리글리콜산(PGA) 흡수성 봉합사를 사용하여 CCA에 링거를 만들되 봉합사가 팽만되지 않은 상태로 유지합니다.
  7. CCA를 따라 위쪽으로 분리되면 CCA가 외부 경동맥(ECA)과 내부 경동맥(ICA)으로 분할되는 "Y" 분기점을 관찰할 수 있습니다.
  8. ECA와 ICA를 완전히 노출시키기 위해 분기점을 분리합니다. 분기점에서 원위부에 있는 ECA 주위에 5.0 PGA 흡수성 봉합사를 고리로 단단히 묶습니다.
    참고: ECA가 회전하는 동안 나사산이 빠지는 것을 방지하기 위해 영구 결찰 부위와 혈관 분기 사이에 충분한 거리를 유지하십시오.
  9. CCA에서 ICA로 가는 혈류를 차단하기 위해 두 개의 8mm x 2mm 광 마이크로 세라핀 동맥 클램프를 사용하여 CCA와 ICA를 임시로 클램핑합니다.
  10. ECA 원위부 및 CCA의 봉합사 타이를 늘려 ECA 세그먼트를 곧게 펴십시오.
  11. 마이크로 가위를 사용하여 ECA의 두 봉합 타이 사이를 작게 절개합니다.
  12. 실리콘 코팅된 모노필라멘트 봉합사(길이 30mm, 코팅 실리콘 3-4mm)를 ECA에 삽입합니다. 모노필라멘트 봉합사가 뒤로 물러나는 것을 방지하기 위해 분기점 근처의 ECA에 두 번째 5.0 PGA 흡수성 봉합사를 고리로 묶고 약간 묶습니다.
  13. ECA를 영구 결찰부 원위부로 완전히 절단하고 ICA에서 동맥 겸자 클램프를 제거합니다.
  14. CCA의 분기점으로 봉합사를 빼낸 다음 ECA 그루터기를 조심스럽게 집어넣고 회전시킵니다. 봉합사의 삽입 방향을 조정하고 CCA 분기점에서 약 9.0–10.0mm를 ICA로 천천히 삽입하여 MCA를 폐색합니다.
  15. ECA 주위의 두 번째 PGA 흡수성 봉합사를 조이고 CCA에서 동맥 클램프를 제거합니다.
  16. 5.0 PGA 흡수성 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 분리하여 봉합합니다. 디클로페낙 나트륨 젤과 무피로신 연고를 상처에 바른다.
  17. 마우스를 엎드린 위치로 부드럽게 돌리고 3.4단계를 반복합니다. MCA 폐색 후 혈류를 기록합니다.
    참고: MCAO 이후 기준선 값의 40% 미만의 혈류 감소를 보이는 마우스는 연구에서 제외되었습니다14.
  18. 온도를 37°C로 설정한 상태에서 회수 케이지의 가열 스위치를 켭니다. 폐색 후 기간(60분) 동안 마우스를 복구 케이지에 놓습니다.

5. 모노필라멘트 제거 및 재관류

  1. 폐색 기간이 끝나기 직전에 앞서 설명한 대로 마우스를 다시 마취합니다.
  2. 마이크로클립 동맥 클램프를 사용하여 CCA를 고정합니다.
  3. 실리콘 코팅된 팁이 ICA를 통해 보일 때까지 ICA에서 모노필라멘트를 부분적으로 후퇴시킵니다.
  4. 실리콘 코팅된 팁 위의 ICA에 또 다른 마이크로클립 동맥 클램프를 놓습니다.
  5. 모노필라멘트를 완전히 빼내고 ECA 그루터기를 단단히 접합합니다.
  6. ICA 및 CCA에서 각각 마이크로클립 동맥 클램프를 제거합니다.
  7. 5.0 PGA 흡수성 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 한 겹씩 봉합합니다.
  8. 마우스를 회수 챔버에 넣고 완전히 깨어날 때까지 모든 마우스를 모니터링합니다. 최대 24시간 동안 12시간마다 통증 완화를 위해 meloxicam(5mg/kg, 피하)을 투여합니다.

6. 혈당 측정

참고: 혈당 수치는 (1) MCAO 수술 직전(기준선), (2) 모노필라멘트 삽입 직후(포도당 주입 후 15분), (3) 모노필라멘트 삽입 직후(포도당 주입 후 75분).

  1. 알코올성 면봉으로 쥐의 꼬리를 닦아 꼬리 정맥이 완전히 과혈증이 되도록 합니다.
  2. 수술 용 가위를 사용하여 꼬리 끝을 1-2mm 자릅니다.
  3. 꼬리 뿌리를 따라 꼬리 끝까지 부드럽게 짜서 절개 부위에서 혈액이 흘러나오도록 합니다.
  4. 시험지의 샘플 흡수 탱크를 혈액 방울의 가장자리에 놓습니다.
    알림: 혈액은 사이펀 효과로 인해 시험지로 빨려 들어갑니다.
  5. 혈당 측정기 판독값을 읽고 결과를 기록합니다.
    참고: 포도당 주사 15분 후 혈당 수치가 10mmol/L 이상으로 상승하지 않은 마우스는 제외합니다.
  6. 솜뭉치를 사용하여 잉여 혈액을 제거하고 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다.

7. 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색

  1. 펜토바르비탈(300mg/kg)을 과다 투여하여 복강내 주사하여 마우스를 안락사시킵니다.
  2. 마우스가 호흡을 멈추면 즉시 누운 자세로 움직이지 못하게 합니다.
  3. 가위로 흉부를 열고 횡격막을 잘라 심장을 노출시킵니다.
  4. 23G의 주사 바늘을 마우스의 좌심실에 삽입하고 가위로 귓바퀴 맹장을 절개합니다.
  5. 귓바퀴 맹장에서 배출되는 액체가 깨끗하고 투명하게 나타날 때까지 15mL의 생리식염수를 관류합니다.
  6. 쥐의 목을 베고 두피를 잘라 가위로 두개골을 완전히 드러냅니다. 가위 끝을 두개골의 관상 봉합사 약간 앞에 2mm 삽입하여 들어 올립니다.
  7. 핀셋을 사용하여 마우스의 뇌 조직을 그대로 제거합니다.
  8. 뇌 조직을 설치류의 뇌 매트릭스에 넣고 2mm 관상 조각으로 자릅니다.
  9. 슬라이스를 24웰 플레이트로 옮기고 37°C에서 15분 동안 2% TTC 용액으로 배양합니다.
  10. 스캔 소프트웨어를 시작하고 이미지 분석을 위해 매개변수 설정을 1200dpi 해상도와 JPG 형식으로 지정합니다.
  11. 구부러진 집게로 24웰 플레이트에서 조직 단면을 잘라내고 유리 스캐닝 플레이트에 단면을 배열합니다.
  12. 조직 단면을 스캔한 다음 측정 분석을 위해 이미지를 내보냅니다.
  13. 조직 부종을 교정하여 경색 부위를 측정합니다. ImageJ 소프트웨어15를 사용하여 반대쪽 영역에서 동측 측의 비경색 영역을 뺍니다. 경색 크기를 반대쪽 반구의 백분율로 평가합니다. 경색 면적 분석에 대한 자세한 내용은 Friedländer et al.16을 참조하십시오.

8. G로스 관찰

  1. 7.1–7.8단계를 반복합니다.
  2. 구부러진 집게로 뇌 매트릭스에서 조직 부분을 잘라내고 유리 스캐닝 플레이트에 절편을 정렬합니다.
  3. 7.10 및 7.12 단계에서 설명한 대로 뇌 관상 절편을 스캔합니다.

9. 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색

  1. 7.1–7.4단계를 반복합니다. 생리식염수 15mL를 천천히 관류한 다음 약 15mL의 파라포름알데히드(PFA)를 관류합니다.
  2. 7.6–7.7단계를 반복합니다. 실온에서 24시간 동안 4% PFA로 뇌 조직을 고정합니다.
  3. 고정된 뇌 조직을 자동 조직 탈수기에 넣어 탈수, 유리화, 왁스 침지를 합니다.
  4. 조직을 파라핀 왁스에 삽입하고 마이크로톰으로 뇌 조직을 5μm 두께의 관상 절편으로 자릅니다.
  5. 슬라이스를 자일렌에 세 번 담궈 왁스를 제거하며, 각 침지는 8분 동안 지속됩니다. 그런 다음 농도가 감소하는 에탄올 용액(100%, 95%, 90%, 80%, 70%)에 슬라이스를 점차적으로 담근 다음 증류수를 각 단계에서 5분 동안 지속합니다.
  6. 헤마톡실린 용액으로 슬라이스를 3분 동안 염색합니다. 그런 다음 5% 염산 알코올에 5초 동안 담가 구별합니다.
  7. 슬라이스를 에오신 용액으로 1분 동안 배양한 다음 그래디언트 에탄올 용액(90%, 95%, 100%)과 자일렌으로 탈수 및 히알린화합니다.
  8. 중성 수지로 섹션을 장착합니다.
  9. 형광 현미경을 사용하여 명시야 아래에서 H&E 염색된 뇌 절편의 이미지를 캡처합니다.

10. 에반스 블루(EB) 레카게의 결정

참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 Wang et al.17을 참조하십시오.

  1. MCAO 23시간 후 꼬리 정맥을 통해 2%(w/v) Evans Blue(EB) 용액(2mL/kg)을 주입합니다.
  2. EB 주사 1시간 후 7.1-7.7단계를 반복하고 전체 뇌의 사진을 캡처합니다.
  3. 뇌를 설치류 뇌 매트릭스에 넣고 관상동맥으로 2mm 조각으로 자릅니다. 7.10–7.12단계에서 설명한 대로 뇌 관상 절편을 스캔하여 EB 누출을 관찰합니다.
  4. 조각을 오른쪽과 왼쪽 부분으로 나누고 각각을 원심분리기 튜브에 넣습니다.
  5. 뇌 조직 100mg과 트리클로로아세트산 0.4mL의 비율로 모든 뇌 조직 조각을 50% 트리클로로아세트산으로 균질화합니다.
  6. 4°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 10,000 x g (4°C)에서 30분 동안 균질액을 원심분리합니다.
  7. 상등액을 다른 원심분리기 튜브로 옮기고 에탄올로 4배 희석합니다.
  8. 분광 광도계를 사용하여 620nm에서 상등액 액체의 흡광도를 측정합니다.
  9. 에탄올 내 EB의 표준 곡선(예: 31.25, 62.5, 125 및 250 ug/mL)을 사용하여 흡광도 값을 EB 농도로 변환합니다.
    참고: 결과는 뇌 조직 1g당 EB 마이크로그램으로 표시됩니다.

11. FITC-덱스트렌 누출 측정

  1. FITC-덱스트란(10 KDa, 6 mg/mL, 0.01M PBS로 희석, 4 mL/kg)을 MCAO 후 24시간 동안 꼬리 정맥에 주입하여 10분 동안 혈액을 순환합니다.
  2. 7.1-7.7단계를 반복하여 관류를 수행하고 손상되지 않은 뇌 조직을 제거합니다.
  3. 어둠 속에서 실온에서 24시간 동안 4% PFA로 뇌 조직을 고정합니다.
  4. 탈수를 위해 고정된 뇌 조직을 10%, 20% 및 30%(0.01M PBS로 희석)의 구배 농도로 자당 용액으로 옮깁니다.
  5. 최적 절단 온도 화합물(OCT)을 사용하여 뇌 조직을 삽입하고 30μm 두께의 뇌 조직 절편으로 자릅니다. 접종 루프를 사용하여 단면을 현미경 슬라이드로 옮기고 슬라이드 표면에 부착되는지 확인합니다.
  6. 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 함유한 장착 매체를 사용하여 뇌 조직 절편을 장착합니다.
  7. 레이저 컨포칼 현미경 및 제어 소프트웨어를 시작합니다.
  8. 물체 스테이지에 현미경 슬라이드를 고정하고 200x 접안렌즈 아래의 경색 영역을 찾습니다.
  9. 해상도를 1024 x 1024로 설정하고 게인 값과 노출 시간을 조정하여 가능한 가장 선명한 이미지를 얻습니다.
  10. 488nm의 여기 파장에서 뇌경색의 FITC-Dextran 염색 영역의 이미지를 획득합니다.

결과

이 연구의 실험 절차는 그림 1에 나와 있습니다. 간단히 말해서, 마우스는 60분 동안 스레드 폐색으로 유도된 MCAO를 받은 후 재관류를 수행했습니다. 포도당(생리식염수 30%, 체중 7.2mL/kg)은 MCAO 15분 전에 복강내 투여하였다. 혈당 수치는 기준선(포도당 주사 전), MCAO 직후 및 재관류 시점에 측정되었습니다. 24시간 재관류 후 마우스를 안락사시키고 뇌 조직을 채취하여 경색 부피, 혈뇌장벽 누출 및 조직병리학을 분석했습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 4개 그룹 모두 유사한 기준선 혈당 수치를 보였습니다. 그러나 포도당 주사를 맞은 쥐는 식염수 그룹에 비해 혈당 수치가 현저히 높아진 것으로 나타났습니다.

그림 3A에서 볼 수 있듯이, Sham + 식염수 또는 Sham + 포도당 그룹의 뇌 절편에서는 눈에 보이는 경색이 관찰되지 않았으며, 두 MCAO 그룹의 뇌 절편에서 TTC 염색에 의해 뚜렷한 뇌경색이 명확하게 나타났습니다. 또한, 포도당을 주입한 마우스는 다른 MCAO 그룹에서 일반 식염수를 주입한 마우스에 비해 더 큰 경색 부피를 나타냈습니다. 통계 분석에 따르면 경색량은 MCAO + 식염수 그룹 및 MCAO + 포도당 그룹에서 각각 20.8% ± 0.8% 및 45.1% ± 1.6%였습니다(그림 3B).

거시적 관찰 결과, 좌뇌 반구에서 MCAO + 식염수 그룹 또는 샴 + 식염수/포도당 그룹의 출혈은 발견되지 않았습니다. 대조적으로, MCAO + 포도당 그룹의 허혈성 뇌 반구에서 여러 반점 출혈이 관찰되었습니다(그림 4A). 연속적인 관상동맥 뇌 절편의 스캐닝 이미지는 MCAO + 포도당 그룹의 출혈이 피질과 선조체의 경색 영역 내에 분포되어 있음을 보여주었습니다(그림 4A). 또한 H&E 염색을 사용한 조직학적 분석은 MCAO+포도당 그룹에서 피질과 선조체의 경색 영역으로 상당한 혈구 침투를 입증했습니다(그림 4B). 반대로, MCAO+식염수 그룹 또는 Sham + 식염수/포도당 그룹에서 혈구 침투가 관찰되지 않았습니다.

그림 5A에서 볼 수 있듯이, Sham + glucose group의 뇌 절편에서 EB의 누출은 관찰되지 않았습니다. 그러나 두 MCAO 그룹 모두 EB 누출로 인해 뚜렷한 파란색 염색을 보였습니다. 또한, 식염수를 주입한 마우스와 비교했을 때, 포도당을 주입한 마우스는 MCAO 후 24시간에 EB 투과성이 증가한 것으로 나타났습니다. 샴 + 식염수 그룹과 비교했을 때, MCAO + 식염수 그룹은 EB 함량이 유의하게 증가했으며(4.2 μg/g ± 1.8 μg/g 대 28 μg/g ± 0.7 μg/g, p < 0.01), 이는 MCAO + 포도당 그룹(28 μg/g ± 0.7 μg/g 대 65.5 μg/g ± 6.0 μg/g)에서 더욱 증가했다. p < 0.01) (그림 5B). 그림 5C에서 볼 수 있듯이, FITC-덱스트란의 누출은 MCAO + 식염수 그룹에 비해 MCAO + 포도당 그룹의 허혈성 대뇌 피질 및 선조체에서 더 강렬했습니다.

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그림 1: 실험 절차의 개략도. MCAO 수술 전에 마우스에게 30%의 포도당 또는 식염수를 복강내 주사하고 시술 중 혈당을 모니터링했습니다. 재관류 후 24시간 후, 병리학적 및 조직학적 분석을 위해 마우스를 안락사시켰습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 30% 포도당 주입 후 다양한 시점에서의 혈당 수치 변화. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. N = 10-20. p < 0.001은 Sham + 식염수 그룹과 비교했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 고혈당증은 재관류 후 24시간 후에 허혈성 뇌 손상을 악화시켰습니다. (A) TTC로 염색된 관상 동맥 절편의 대표적인 이미지로, 정상 뇌 조직은 분홍빛이 도는 빨간색으로, 허혈성 경색 부위는 회백색으로 나타납니다. 스케일 바 = 5mm. (B) 경색 부피의 통계적 분석. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. N = 3. p < 0.001은 Sham + 식염수 그룹에 비해 0.001, ##p < 0.01은 MCAO + 식염수 그룹에 비해 높습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 고혈당증은 재관류 후 24시간에 HT의 위험을 증가시켰습니다. (A) 총 관찰 및 관상 절편의 대표 이미지. 별표는 눈에 보이는 출혈성 병소를 나타냅니다. 스케일 바 = 5mm. (B) 대표적인 H&E 염색 반뇌 이미지(위) 및 확대 이미지(아래). 스케일 바 = 반뇌 이미지의 경우 200μm; 확대된 이미지의 경우 스케일 바 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 재관류 후 24시간에 고혈당증으로 악화된 BBB 중단. (A) Evans 청색 누출의 대표 이미지. 눈금자 = 5mm. (B) 허혈성 반구에서 Evans blue 누출에 대한 통계적 분석. 데이터는 평균 ± SD, N = 3, **p < 0.01, ***p < 0.001은 샴+식염수 그룹과 비교, ##p < 0.01은 MCAO + 식염수 그룹과 비교하여 0.01로 표시됩니다. (C) FITC-덱스트란 염색 허혈성 대뇌 피질 및 선조체의 대표 이미지. 스케일 바 = 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

현재 프로토콜은 허혈성 뇌졸중 후 출혈성 변형에 대한 신뢰할 수 있는 동물 모델을 만들기 위해 고안되었으며, 이는 고혈당 조건에서 혈관 재생의 유해한 영향을 복제할 수 있습니다. 허혈성 뇌졸중의 다양한 위험 요인 중 뇌졸중 발병 후 24시간 이내의 혈당 수치는 뇌 손상의 악화 및 사망률 증가와 양의 상관관계가 있다 3,18. 또한 수많은 임상 연구에서 뇌졸중 후 고혈당증이 HT와 신경학적 결과 저하의 가장 중요한 위험 요인 중 하나임이 입증되었다19. 본 프로토콜에서는 20마리의 마우스 중 19마리를 급성 고혈당증 하에서 HT로 성공적으로 유도하여 약 95%의 성공적인 모델링 비율을 달성했습니다. 불행히도, 4마리의 마우스가 MCAO 수술 후 24시간 이내에 중증 뇌혈종으로 사망했기 때문에 추가 분석에서 제외되었습니다.

고혈당증에 의한 HT 동물 모델은 최근 전임상 연구에서 활용되고 있습니다. Won 등은 tPA 뇌졸중 치료의 랫트 모델에서 고혈당증이 HT를 촉진한다는 것을 입증했다20. 그러나 Won의 HT 모델의 병원성 요인은 tPA 자체가 HT의 위험을 증가시킬 수 있기 때문에 더 복잡했습니다. 이와는 대조적으로, 현재 프로토콜은 MCAO와 결합된 급성 고혈당증을 활용하여 마우스에서 HT의 상당한 성공률을 달성했습니다. 특히, 고혈당증으로 유발된 HT 모델들 사이에는 포도당 농도, 허혈 기간, 모델 신뢰도 및 HT 21,22,23,24의 발생과 관련하여 변동성이 존재합니다. 일부 연구에서는 50% 포도당 주사를 사용하여 뇌졸중 환자에서 관찰된 일반적인 범위를 능가하는 혈당 수치(20-28mmol/L)를 유의하게 높였습니다. 이 실험에서 HT의 비율은 70%에서 73.3% 사이이며, 한 실험 모델에서 사망률은 37.5%로 기록되었습니다. 이와는 대조적으로, 현재의 실험 절차는 14.3 mmol/L에서 20.3 mmol/L 사이로 유지되는 급성 고혈당을 유도하기 위해 30% 포도당 주사를 사용하는 것과 관련이 있으며, 이는 환자에서 발견되는 혈당 값의 범위와 더 잘 일치합니다. 또한, 이러한 절차는 수술 전 기준 혈당 수치를 약 약 5mmol/L로 조절하기 위해 수술 전에 실험용 마우스의 금식 기간을 필요로 했습니다. 그렇게 하지 않으면 약 10mmol/L의 기준선 혈중 농도가 상승할 수 있으며, 이로 인해 혈당 수치가 과도하게 높아지고 궁극적으로 생쥐의 사망률이 높아질 수 있습니다.

최근 연구에서 MacDougall 등은 고혈당증이 특히 제1형 당뇨병 모델25에서 경색의 크기를 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 현재의 연구 결과는 포도당을 투여한 그룹이 식염수 상태의 그룹에 비해 허혈 60분 후 더 큰 경색 크기를 나타냈음을 나타냅니다. 이 결과는 반그늘 부위의 경색 진행에 대한 고포도당의 해로운 영향을 입증한 이전 실험과 일치합니다18. 이 프로토콜에서 수술 전 30% 포도당 주사는 MCAO 후 24시간 후에 뇌 반점 출혈을 초래했습니다. 거시적 그라데이션 결과와 일치하게, H&E 염색을 사용한 조직학적 분석은 급성 고혈당증 마우스에서 허혈성 선조체와 피질로 상당한 혈구 침투를 밝혀냈습니다. 당연히 ELISA를 통한 헤모글로빈 측정 또는 자기 공명 영상(MRI)과 같이 HT를 평가하는 데 사용할 수 있는 다른 방법이 있습니다. HT의 기저에 있는 병태생리학적 기전은 여전히 파악하기 어렵지만, BBB 파괴는 뇌허혈 다음으로 주요 원인으로 간주된다26. 따라서 BBB 중단은 HT의 심각성을 간접적으로 반영할 수 있습니다. 이 프로토콜은 BBB 투과성을 테스트하기 위해 EB 염색을 사용했습니다. EB 염색 뇌 절편은 BBB 투과성의 변화를 시각적으로 보여주고 뇌 조직에 침투한 EB 염료 함량을 정량적으로 측정할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 플루오레세인-나트륨(Fluorescein-sodium) 및 FITC-덱스트란(FITC-Dextran)과 같은 다른 추적자는 신경 질환의 동물 모델에서 BBB 투과성을 평가하기 위해 광범위하게 활용되었습니다27,28. 그래서 FITC-Dextran의 누출 정도를 관찰하여 혈관 내피 손상의 위치와 정도를 보다 자세히 설명하기 위해 Dextran 염색 실험도 수행했습니다.

현재 프로토콜에는 간과할 수 없는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, MCAO 수술은 시술자의 높은 수준의 숙련도를 요구합니다. 색전사를 MCA로 적시에 전달하고 폐색의 정확한 배치와 깊이를 보장하는 것이 중요합니다. 이러한 요구 사항을 충족하려면 실험 작업자를 위한 광범위한 교육이 필요합니다. 둘째, HT가 뇌 손상을 악화시킬 가능성이 있기 때문에 실험 동물의 생존율을 향상시키기 위해서는 수술 후 관리가 필수적입니다. 마지막으로, 임상적 뇌졸중 환자는 당뇨병, 고혈압, 심방세동 및29세와 같은 HT에 대한 여러 위험 요인을 가지고 있는 경우가 많다는 점을 인정하는 것이 중요합니다. 따라서 현재의 동물 모델은 이러한 위험 요인과 관련된 복잡한 메커니즘을 완전히 복제할 수 없습니다.

결론적으로, 이 프로토콜은 뇌허혈-재관류 마우스 모델에서 급성 고혈당에 의해 유발되는 HT를 효과적으로 복제했습니다. 이 모델은 우수한 반복성, 높은 안정성 및 높은 동물 생존율을 보여주므로 HT의 전임상 연구에서 널리 사용하기에 적합합니다.

공개 사항

저자는 공개할 상충되는 이해 관계가 없습니다.

감사의 글

그림 1은 BioRender 소프트웨어(https://www.biorender.com/)로 제작되었습니다. 이 연구는 후베이성 자연과학재단의 안내 프로젝트(No. 2022CFC057)의 보조금으로 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)Sigma-Aldrich108380TTC 염색용 염료
24웰 배양 플레이트Corning IncorporatedCLS3527TTC 염색용 용기
30% 포도당 주사 KelunPharmaceuticalH42021188급성 고혈당증 유도
4% 파라포름알데히드Wuhan Servicebio Technology
Co., Ltd. 		G1101조직 고정
5.0 폴리글리콜산 흡수성 봉합사Jinhuan Medical Co., LtdKCR531수술용 장비
96웰 배양 플레이트Corning IncorporatedCLS3596EB 함량 측정
취기Midmark Corporation동물용 VMR취
Beyotime Biotech을 사용한 퇴색 방지 마운팅 매체P0131조직 절편용 마운트
자동화-조직-탈수 
기계		라이카 바이오시스템TP1020탈수 조직
공초점 현미경라이카 바이오시스템STELLARIS 5이미지 획득
디클로페낙 나트륨 젤MaYinglong 제약H10950214동물용
오신 염색 용액Servicebio TechnologyG1001H& 용 염료 E 염색
Evans BlueAladdinE104208EB 염색
아이 젤광저우 제약H44023098수술용 재료
Fitc-dextranSigma-Aldrich60842-46-8BBB 투과성 평가
형광 현미경OlympusBX51이미지 획득
동 마이크로톰Leica BiosystemsCM1900냉동 절편에 사용
혈당계YuWell580혈당 측정
헤마트톡실린 염색 용액ServicebioG1004H& E 염색
요오드Lircon20020059수술용 재료
IsofluraneRwd 생명 과학R510-22-10동물용 마취
레이저 도플러 혈류계Moor InstrumentsmoorVMS혈류 모니터링
MCAO 봉합사Rwd 생명 과학907-00023-01수술용 재료
MeloxicamBoehringer-Ingelheim동물용J20160020
키트Rwd 생명 과학SP0003-M수술용 장비
톰Thermo Fisher ScientificHM325조직 절편 생산
마이크로톰 블레이드라이카 바이오시스템즈819조직 절편 생산
무피로신 연고글락소스미스클라인H10930064동물용 감염 방지
중성 발삼Absin Bioscienceabs9177H& 씰 E 염색
파라핀 포매 센터Thermo Fisher ScientificEC 350파라핀 블록 생산 펜
토바르비탈 나트륨Sigma-AldrichP3761동물용 안락사
산염 완충 식염수Beyotime BiotechC0221A조직 절편용 헹굼
EPSONV330조직 스캐
면도기심천 Codos 전기 제품 Co., Ltd.CP-9200수술 장비
광 광도계Thermo Fisher Scientific1510-02362측정 EB 함량 Shanghai
Macklin Biochemical57-50-1조직 탈수
Tek OCT 화합물사쿠라4583조직 포매 배지
트리클로로아세트산Sigma-AldrichT6399EB 함량 측정
마 마DAPI 즈 즈 에용 진통 냉 상통제 마이크로 인 스캐너 닝 분 자당 용액 조직-

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: A Mouse Model of Hemorrhagic Transformation Induced by Acute Hyperglycemia Combined with Transient Focal Ischemia
Posted by JoVE Editors on 1/06/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67371

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