방법 논문

체스판과 같은 화상 상처 치유 모델 디지털 난방 장치를 기반으로 한 마우스의

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DOI:

10.3791/67375

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2024년 12월 27일

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1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

이 논문에서

요약

디지털 가열 장치를 사용하여 마우스의 화상 상처 치유 모델을 구축하기 위한 간소화된 프로토콜이 제시됩니다. 피부에 만들어진 체스판과 같은 실험 부위는 상처 치유 분석을 위한 추가 기능 분석을 용이하게 합니다.

초록

심각한 화상 부상은 가장 충격적이고 신체적으로 쇠약해지는 상태 중 하나이며 거의 모든 장기 시스템에 영향을 미치고 상당한 이환율과 사망률을 초래합니다. 화상의 복잡성과 여러 장기의 관여를 감안할 때, 화상 부상의 다양한 측면을 복제하기 위해 다양한 동물 모델이 만들어졌습니다. 불에 탄 표면을 만드는 데 사용되는 방법은 실험 동물 모델마다 다릅니다. 이 연구는 디지털 가열 장치를 사용하여 일관된 전체 두께 화상을 생성하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 사용자 친화적인 마우스 화상 모델을 설명합니다. 이 장치의 끝을 97°C에서 10초 동안 마우스의 등쪽에 적용하여 체스판과 같은 화상을 입히고 실험용 드레싱 처리로 상처 치유를 조사했습니다. Hematoxylin 및 Eosin(H&E) 염색 및 Masson's 염색을 포함한 조직학적 분석을 위해 피부 샘플을 수집했습니다. 상처 부위 분석과 염증성 침투, 재상피화, 육아 조직 형성에 대한 현미경 검사를 통해 상처 치유를 평가하였다. 생쥐 화상 부상 모델은 열 부상의 병태 생리학을 연구하고 치료 개입을 평가하는 데 기본적인 도구 역할을 할 수 있습니다.

서론

화상은 열 노출, 전기, 화학 물질 및 방사선 노출로 인해 발생하는 피부에 대한 심각한 부상 중 하나로 간주됩니다 1,2. 부상의 깊이에 따라 표피에서 피부의 전체 두께, 심지어 근육과 뼈에 이르기까지 4단계로 분류할 수 있습니다. 작은 화상은 흉터를 형성하고 감염 위험을 증가시킬 수 있습니다. 넓은 부위의 화상은 국소 손상을 일으킬 뿐만 아니라 심각하고 장기적인 염증과 면역 반응을 통해 신체의 심장, 신장 및 기타 장기 또는 시스템의 장애를 자극하여 심각한 전신 질환과 높은 이환율을 초래합니다3. 대부분의 화상 부상 생존자는 장기적인 신체 장애, 정서적 고통 및 삶의 질 저하를 동반합니다 4,5. 따라서 화상의 병리학적 과정과 화상받은 조직의 재생 메커니즘을 연구하는 것이 중요합니다.

면역 반응, 조직 재생 및 체계적인 항상성과 관련된 체외 연구는 화상 상처 치유의 병리학적 과정을 종합적으로 조사할 수 없었습니다. 따라서 지난 20년 동안 잠재적인 치료 개입을 모색하기 위해 화상 부상의 다양한 특징을 복제하기 위해 다양한 화상 상처 치유 동물 모델이 개발되었습니다 6,7. 화상 상처는 일반적으로 제모 후 돼지, 쥐, 생쥐, 토끼 및 기타 동물의 등쪽 표면에 생성됩니다. 연소 시간은 3초에서 30초 동안 지속되어 총 신체 표면적(TBSA)8%에서 5%에서 30%의 범위로 부분적인 두께에서 전체 두께의 열 손상을 형성할 수 있습니다. 사용되는 기술의 높은 가변성으로 인해 현재 화상 동물 연구에서 이러한 방법의 표준화된 모델은 없습니다. 가스 화염 9, 연소 에탄올 수조10, 예열 된 단일 금속판 / 막대11, 12, 끓는 물 또는 뜨거운 물13, 14를 포함하여 연소 된 표면을 생산하는 데 사용되는 방법은 실험 동물 모델에 따라 다릅니다. 그러나 화상 가해 기술과 생성된 화상 깊이는 종종 일관성이 없고 이전 연구에서 제대로 설명되지 않았으며, 이는 화상의 심각성과 화상 치료 방법을 결정하는 데 중요합니다.

이 연구는 시뮬레이션된 임상 시나리오에서 일관된 전층 화상을 생성하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 사용자 친화적인 마우스 화상 동물 모델을 개발하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜에서는 편리한 디지털 가열 장치를 사용하여 피부에 가해지는 온도를 조정하여 화상의 깊이를 제어했습니다. 이 장치의 끝을 다른 크기로 전환하여 다양한 범위의 TBSA로 열 화상을 유발할 수 있습니다. 이를 통해 마우스의 등에 체스판과 같은 화상 상처를 만들 수 있으며, 동일한 동물 내에서 여러 실험 및 대조 치료를 비교할 수 있습니다. 우리는 상처 봉합 과정을 관찰하고 기록했습니다. 상처 치유의 여러 단계에서 조직학적 평가(Hematoxylin 및 Eosin (H&E) 염색 및 Masson의 삼색 염색)을 위해 피부 샘플을 채취했습니다. 이 접근 방식은 실험에 사용되는 동물의 수를 줄여 동물 윤리와 더 잘 어울리는 동시에 경제적 비용을 절감합니다. 이 연구는 연구자들에게 화상 부상에 대한 새로운 치료법 개발을 촉진하고 화상 상처 치유의 병태 생리학적 메커니즘을 밝히는 데 필수적인 도구를 제공할 것입니다.

프로토콜

이 연구의 모든 동물 절차는 쓰촨대학교 서중국 구강학대학원 윤리위원회(WCHSIRB-D-2024-499)에서 검토 및 승인했습니다. 본 연구를 위해 8주 된 C57BL/6 마우스 24마리(암컷, 체중 25-30g)를 사용했습니다. 시약과 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 화상 부상 전 장비 및 마우스 준비

  1. 동물을 입양하여 도착 후 7일 동안 우리에 수용하여 환경에 적응할 수 있도록 합니다.
  2. 70% 에탄올(v/v)을 분무하고 닦아 작업 영역을 살균합니다. 멸균 수술용 흡수 패드로 수술대를 덮으십시오.
  3. 디지털 가열 장치의 온도를 97°C로 조정합니다. 가열 장치는 세 부분으로 구성됩니다(그림 1).
    알림: 온도 컨트롤러를 통해 50-450°C의 온도를 조정할 수 있습니다(그림 1A). 스탠드 베이스는 팁(그림 1B)을 배치하는 데 사용되며, 다양한 크기의 기기를 교체하기 위해 분해할 수 있습니다(그림 1C). 팁을 요오드 또는 알코올로 소독하십시오.
  4. 호흡이 느려질 때까지 유도 챔버에서 5% 산소에 100% 이소플루란을 넣은 마우스를 3분(유속: 4L/분) 동안 마취합니다. 발가락 꼬집음 테스트를 사용하여 마취 깊이를 평가합니다.
    참고: 이소플루란을 흡입하면 졸음이 유발되고 심혈관계에 해를 끼칠 수 있습니다. 보호 장비를 착용하고 환기가 잘 되는 곳의 흄 후드 내에서 취급하는 것이 필수적입니다.
  5. 마우스가 완전히 마취되면 엎드린 자세로 가열된 패드로 옮겨 보온을 유지하고 마취 후 회복 중 저체온증을 예방합니다. 이소플루란을 1로 줄입니다. 노즈 콘을 통한 유지 보수를 위한 5% 산소.
  6. 각막 건조를 방지하기 위해 면봉으로 마우스의 양쪽 눈에 윤활 젤을 바르십시오.

2. 전층 화상 부상 유발

참고: 연소 유도 및 분석의 일반적인 프로세스는 그림 2에 나와 있습니다.

  1. 전기 면도기로 목에서 꼬리까지 길이 약 5cm, 너비 4cm의 부위에 걸쳐 마우스의 피부를 면도합니다. 면도 시 피부가 다치지 않도록 부드럽게 작업하십시오(그림 3C).
  2. 면봉 애플리케이터를 사용하여 면도한 피부 부위에 제모 크림을 3분 동안 바릅니다(그림 3D).
    알림: 감지하기 어려울 수 있는 화상을 방지하기 위해 마우스의 다른 부분에 제모 크림을 바르지 마십시오. 크림은 5분 이상 사용하면 피부 발진을 일으켰습니다. 최적의 효능을 위한 정확한 지속 기간은 제품마다 다르며 작업자가 결정해야 합니다.
  3. 젖은 거즈를 사용하여 크림을 닦아내면 크림과 머리카락이 감지되지 않을 때까지 합니다. 클로르헥시딘 스크럽으로 수술 부위를 소독한 후 70% 에탄올(v/v)을 각각 3회 투여합니다. 멸균 거즈로 해당 부위를 청소하고 말리십시오.
  4. 멸균된 잉크에 담근 직경 9mm(그림 3A)의 멸균된 1mL 피펫 팁을 사용하여 원하는 상처 부위를 정확하게 찾아냅니다. 쥐의 등쪽 피부는 고르지 않은 지형이 특징입니다. 생쥐의 척수와 상처 부위를 구분하는 것은 반복성을 보장하기 위해 필수적입니다.
  5. 이전에 다듬은 멸균 드레이프로 피부를 덮고 수술 부위는 자유롭게 둡니다(그림 3). 내열 장갑을 끼고 디지털 난방 장치의 온도를 확인하십시오. 연소 유도 전후에 장치의 팁을 70% 에탄올(v/v)로 소독하십시오.
  6. 가열 장치의 끝을 위치한 상처 부위의 중심(97°C에서 10초)에 적용하여 직경 4mm의 둥근 상처 6개를 만듭니다(그림 3B). 인접한 화상 사이의 간격은 0.5-1cm입니다. 실험 설계에 따라 화상 횟수를 결정합니다.
    알림: 화상은 주로 열전도에 의해 발생합니다. 따라서 막대에 압력을 가하는 것, 즉 연소 유도하는 동안 중력에 의해 피부에 접촉을 유지할 필요가 없습니다. 실험 설계를 위해 6번의 연소가 있었습니다. 이것은 우리가 사용한 장치와 마우스 등쪽의 면적에 따라 만들 수 있는 최대 화상 상처 수입니다. 이를 기반으로 동일한 실험 그룹의 여러 반복을 달성할 수 있습니다.

3. 화상 후 관리 및 측정

  1. 통증 관리를 위해 잠재적인 통증을 줄이기 위해 화상 상처에 5분 동안 얼음을 대십시오(그림 3G).
  2. 이소플루란을 끄고 화상 부상 후 콧방울을 제거합니다. 마우스가 정상적으로 움직일 때까지(예: 웅크리거나 떨지 않음) 마우스를 가열 패드로 옮깁니다.
  3. 각 마우스를 복구 케이지에 넣어 서로 긁히지 않도록 합니다. 각 펠릿에 식수 5-10방울을 추가하여 일부 식품 펠릿을 부드럽게 하고 케이지 바닥에 놓아 더 쉽게 먹일 수 있습니다.
    참고: 70% 에탄올(vol/vol)을 분무하고 닦아 케이지를 살균합니다. 침구는 쥐를 따뜻하게 유지하고 소변을 흡수하기 위해 정기적으로 교체해야 합니다.
  4. 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 총 3일 동안 하루 2회 꼬리 위치에 피하 투여하고 주사 사이에 최소 8시간을 확보합니다.
  5. 화상 유도 후 24시간 후에 식염수를 적신 멸균 거즈로 모든 상처를 청소하십시오. 거즈로 피부를 닦아내고 주사기를 사용하여 소량의 항균 젤(TKH 하이드로겔)을 바르면 화상 상처를 덮을 수 있습니다12,14. 그 후 3일, 7일, 10일에 이 절차를 반복합니다.
  6. 통기성이 있고 투명한 드레싱을 사용하여 상처를 덮습니다. 드레싱의 크기는 상처 주위를 약 1cm 정도 덮어야 하며 제모하지 않고 해당 부위를 덮지 않아야 합니다.
    참고: 적어도 2일에 한 번 상처 드레싱을 교체하십시오. 드레싱을 교체하지 않고 장기간 사용하면 고름이 형성되는 상처 감염으로 이어져 상처 치유가 지연될 수 있습니다.
  7. 추적 기간 동안 2-3일마다 체중을 측정하십시오. 일반적으로 초기 체중의 15%-20%를 감량한 마우스는 희생하고 실험에서 제거해야 합니다.

4. 상처 채취

  1. 0, 3, 7, 10, 14일이 되면 멸균 1mL 피펫 팁 끝으로 상처를 표시하고 디지털 카메라로 기록합니다.
  2. 마취 및 자궁 경부 탈구를 과다 투여하여 생쥐를 안락사시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
    알림: 경추 탈구 중에는 등쪽 상처를 손상시킬 수 있는 과도한 당김을 피하기 위해 주의하십시오.
  3. 가위로 상처 부위와 밑에 있는 근육 조직(1cm x 1cm)을 포함한 주변 피부를 분리하십시오. 각 그룹에 대해 최소 3개의 샘플을 준비합니다.
  4. 피부 표본을 4% 파라포름알데히드(PFA)에 24시간 동안 고정하고 4°C에서 보관합니다. 정착 부피는 조직 부피15,16의 30배여야 합니다.
    참고: PFA는 위험합니다. 환기가 잘 되는 곳에서 작업하고 적절한 보호 장비를 사용하십시오.

5. 상처 치유 평가

  1. PBS로 상처 조직을 두 번 씻고 여과지로 펴서 적절한 크기로 다듬어야 합니다(그림 2H). 피하 조직층 내에 약간의 점액 함량이 존재하기 때문에 움직임이나 조직 말림 없이 여과지 표면에 부착됩니다.
    1. 파라핀 탈수를 위한 조직 카세트에 여과지와 샘플을 넣어 비교적 매끄러운 조직 샘플을 얻은 다음 조직15,16을 삽입합니다. 시료는 4°C에서 보관하십시오.
      알림: 이러한 주름은 고정 후 영구적이 되므로 가능한 한 조직을 늘리고 접히지 않도록 하십시오.
  2. 파라핀이 함유된 샘플을 5μm 두께의 절편으로 절단하고 H&E 및 Masson의 트리크롬을 통해 슬라이드를 염색하여 과립 조직, 혈관 신생 형성 및 콜라겐 침착의 정도를 평가하여 상처 치유의 여러 단계와 진행을 평가하기 위한 증거를 제공합니다17,18.
  3. 40x 대물렌즈가 있는 현미경을 사용하여 모든 샘플의 이미지를 캡처합니다.
  4. 호환 가능한 소프트웨어를 사용하여 표피, 진피, 피하 조직 및 근육 상태를 포함한 얼룩진 피부 부분을 분석합니다.

결과

이 프로토콜에서는 디지털 가열 장치에 의해 97°C에서 10초의 화상 지속 시간으로 체스판과 같은 화상 상처가 생성되었습니다(그림 1). 장치의 팁은 우수한 열전도와 빠른 가열 능력으로 알려진 순동으로 만들어졌습니다. 실험자가 잡은 그립은 내열성과 불연성을 제공하는 폴리카보네이트 소재로 만들어졌습니다. 예열된 단일 금속판/바 또는 끓는 물 또는 뜨거운 물 방법과 비교하여 이 장치는 우수한 안전 성능을 보여주고 마우스의 마취 시간을 줄여 결과적으로 전체 실험 시간을 단축합니다.

연소 유도 및 분석의 일반적인 프로세스는 그림 2에 나와 있습니다. 각 동물은 그림 2E와 같이 등쪽에 6개의 화상 상처를 가지고 있었습니다. 이 동물들의 상처 크기를 평가하고, 연소 후 1일, 3일, 7일, 10일, 14일에 각각 H&E 및 Masson 트리크롬 염색을 포함한 조직학적 분석을 위해 피부 샘플을 채취했습니다.

각 화상 상처는 동일한 면적을 가진 원형 모양이었고 화상 유도 후 깊이가 균일했습니다. 화상 부상의 가장자리 색이 밀랍 같은 흰색에서 빨간색으로 바뀌었고, 부상에 대한 즉각적인 염증 반응으로 인해 충혈대가 동반되었습니다. 또한, 화상 상처의 크기는 화상 후 72시간 동안 약간 증가했다(그림 4A).

H&E와 Masson의 삼색으로 염색된 상처 부위를 현미경으로 분석한 결과(그림 4B) 표피층이 완전히 파괴되고 진피 전체 두께가 손상되어 피하 지방과 근육 모두에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 조직학적 검사에서 상처 치유 과정은 3일째에 염증 단계에 있었으며, 혈관 확장과 염증 세포의 상당한 침투를 특징으로 했습니다. 샘플의 현미경 이미지에서 볼 수 있듯이 3일째에 비해 7일째에 화상 후 상처 부위의 현저한 감소가 관찰되었습니다. 육아 조직과 심혈관이 형성되고 콜라겐 섬유가 14일째에 조밀하게 쌓이는데, 이는 상처 치유가 리모델링 단계에 접어든다는 것을 의미합니다. 상처는 치유 과정 전반에 걸쳐 뚜렷한 감염 없이 회복되었습니다.

또한 상처 치유 데이터를 정량화하고 상처 추적을 분석하여 상처 치유 능력을 평가했습니다(그림 5). TKH 펩타이드 하이드로겔12,14로 치료한 상처에서 상처 회복이 강화되는 것이 관찰되었으며, 7일, 10일 및 14일에 상처 부위가 현저히 작아진 것으로 입증되었습니다.

인접한 상처 사이의 간격(그림 6)은 가로 또는 세로 방향으로 화상을 입지 않은 피부와 비교하여 차이가 없음을 확인했습니다. 표피, 진피, 피하 조직이 손상되지 않았고 림프구 침투나 혈관 확장이 없었습니다. 두 상처의 치유 과정은 서로 간섭하지 않습니다. 그러므로, 생체 내에서 효과를 평가하기 위해 모델에 기초하여 상처 치료에 다양한 약물 또는 드레싱을 적용할 수 있습니다.

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그림 1: 화상 유도를 위한 디지털 가열 장치. 화상 부상을 유발하는 데 사용되는 디지털 가열 장치. (a) 온도 컨트롤러는 50-450 °C 범위의 온도 설정을 허용합니다. (b) 스탠드 베이스는 연소 팁을 고정하는 데 사용됩니다. (c) 장치의 팁을 다른 크기로 전환할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 체스판과 같은 상처 모델의 개략도. 기사에 설명된 체스판과 같은 상처 모델을 재현하기 위한 단계별 개요입니다. (A) 생후 8주 된 쥐를 상처 치유 실험의 모델로 사용합니다. (B) 지정된 상처 부위에서 모발을 제거합니다. (C) 6개의 상처 부위는 1mL 피펫 팁을 사용하여 표시합니다. (D) 디지털 가열 장치를 사용하여 표시된 각 부위 (E)의 중앙에 6개의 화상 상처를 만듭니다. (F) 화상 유도 후 등쪽의 클로즈업 이미지. (G) 피부 샘플(약 1cm × 1cm)을 3일, 7일, 10일, 14일에 수확합니다. (H) 피부 샘플은 여과지를 사용하여 평평하게 하고 매립 카세트로 옮깁니다. (I) 파라핀 탈수를 수행하고 (J) 샘플을 5μm 두께로 절단합니다. (K) 절편은 hematoxylin 및 eosin(H&E) 및 Masson의 삼색을 사용하여 염색합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 전체 두께의 화상 부상 유도 과정. (A) 1mL 피펫 팁의 직경과 (B) 디지털 가열 장치의 팁은 각각 9mm 및 4mm입니다. (C) 전기 면도기로 마우스의 등쪽 부분을 면도합니다. (D) 제모 크림을 3분 동안 도포합니다. (E) 면도한 부위를 세척하고 건조시키며, 상처 부위를 멸균된 1mL 피펫 팁으로 표시합니다. (F) 디지털 가열 장치를 97°C에서 10초 동안 가하여 6개의 화상 상처를 만듭니다. (G) 통증 관리를 위해 화상 상처에 얼음을 찔러 놓습니다. (H) 쥐의 등 전체가 6개의 전체 두께의 화상 상처를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 화상 상처의 대표적인 이미지 및 조직학적 분석. (A) 3일, 7일, 10일, 14일째의 화상 상처 이미지로, 치유의 진행을 보여줍니다. (B) H&E와 Masson의 트리크롬으로 염색된 조직학적 이미지는 상처 치유와 피부 재생을 보여줍니다. 스케일 바 = 200μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 시간 경과에 따른 상처 크기 변화. (A) 대조군 및 TKH 하이드로겔 처리 동물의 시간 경과에 따른 상처 크기 변화, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석. (B) 해당 상처 추적 데이터가 제공됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 인접한 화상 상처 및 조직학적 분석. (A) 1일차에 인접한 화상 상처의 대표 이미지. (B) 3일째에 조직학적 분석을 위해 채취한 인접 상처 샘플(빨간색 원). (C) 여과지는 파라핀 탈수 전에 조직 샘플을 평평하게 하는 데 사용됩니다. (D) H&E와 Masson의 인접 상처에 대한 트리크롬 분석. 스케일 바: 1mm 및 200μm(확대). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

화상 연구의 경우, 체외 모델은 일반적으로 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)과 같은 화상과 관련된 박테리아에 대한 국소 항균제 또는 항생제의 억제 효과와 다양한 생체 재료(예: 엘라스틴, 실크, 하이드로겔 드레싱14,20)의 영향에 초점을 맞춥니다) 화상 후 염증 세포(예: 호중구, 대식세포) 또는 줄기세포(예: 중간엽 줄기세포)에 적용됩니다. 이러한 실험은 일반적으로 인위적으로 통제된 환경에서 수행되며, 체외에서 배양된 세포는 생체 내와 다른 성장 특성과 행동을 보일 수 있으며, 이는 세포 간 상호 작용 및 세포 외 기질의 영향과 같은 화상 상처 치유의 생리학적 과정을 완전히 복제하지 못할 수 있습니다. 이러한 이유로 화상의 동물 모델은 화상 후 병리학적 메커니즘을 규명하고 새로운 치료 접근법을 평가하는 데 필수적입니다. 생쥐와 인간의 상처 치유 과정은 염증, 증식, 재상피화, 리모델링의 4가지 겹치지만 뚜렷한 단계를 거친다21,22. 생쥐를 실험 대상으로 사용하면 수많은 생쥐 특이적 시약의 가용성과 회수 과정에 관련된 분자 신호 전달 경로를 조사하기 위한 형질전환 모델을 만들 수 있는 가능성을 포함하여 몇 가지 생물학적 이점이 있습니다. 이로 인해 생쥐는 화상 및 상처 치유에 대한 연구에 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델 중 하나입니다.

본 연구는 전층 화상 부상의 체스판과 같은 상처 모델을 확립하고 이 모델을 사용하여 하이드로겔 드레싱의 효능을 평가했습니다. 결과는 이 모델이 실험용 드레싱의 임상 성능을 효과적으로 모니터링할 수 있음을 나타냅니다. 각 동물 안에는 6개의 화상 상처가 척추를 따라 대칭으로 분포되어 있었다. 화상 상처는 비슷한 위치에 만들 수 있지만 다른 쥐에 만들 수 있습니다. 등쪽의 피부 면적이 제한되어 있고 상처 수가 많기 때문에 조직학적 분석은 상처가 서로 상호 작용하지 않는 것으로 나타났으며, 동일한 마우스 등쪽의 다른 위치에서 각 실험 드레싱에 대한 독립적인 평가를 보장하고 상처 치유 과정과 관련된 편향을 최소화했습니다. 또한 이 모델은 각 마우스가 자체 제어 역할을 하도록 하여 동일한 마우스의 등쪽에서 실험 및 대조 처리를 비교할 수 있으므로 동물 수와 실험 비용을 크게 줄일 수 있다는 이점도 있습니다. 마우스의 전반적인 건강에 대한 다양한 약물의 다양한 영향으로 인해, 서로 다른 상처의 치료 및 후속 비교를 위해 동일한 마우스의 피부에 여러 약물을 적용하는 경우, 단일 약물의 적용 또는 다른 약물의 결합 적용이 마우스의 전반적인 건강에 영향을 미치는지 관찰 및 검증이 필요할 수 있습니다. 또한, 치유 과정에서 마우스의 긁힘으로 인한 약물의 교차 오염 또는 상처 감염을 방지하기 위해 피부 표면에 다른 약물의 안정성 또는 접착력에 주의를 기울여야 합니다.

피부 검체 채취는 후속 조직학적 분석에 매우 중요합니다. 조직 가장자리는 어떠한 처리도 없이 고정액에서 수축하고 접힐 것입니다16. 파라핀 탈수 및 절편 후에는 슬라이드에서 구부러지거나 부분적으로 겹쳐져 현미경 아래에서 보기 흉한 이미지가 나타나고 상처 길이 또는 두께의 통계 분석과 같은 추가 조직학적 분석에 잠재적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 여과지를 사용하여 조직을 평평하게 하면 슬라이드에서 더 매끄러운 부분을 얻을 수 있어 조직학적 이미지를 깔끔하게 만들고 추가 통계 분석을 용이하게 합니다. 또한 탈수 전에 종이 클립을 사용하여 샘플을 고정하여 조직의 부드러움을 보장하는 데 도움이 되었습니다. 그러나 종이 클립을 적용하면 고정된 조직에 압력이 가해져 조직이 압착되고 변형될 수 있습니다. 따라서 이 방법을 사용할 때 관찰에 영향을 주지 않도록 화상 상처 부분을 클램핑할 수 없습니다.

통증, 가려움증, 세균 감염 등 수많은 요인이 치유 과정에 영향을 미칠 수 있다23. 화상 통증의 효과적인 관리는 화상 부상 환자의 회복 및 재통합에 매우 중요합니다. 통증 조절이 제대로 이루어지지 않으면 치유 과정이 지연되어 신체적, 정신적 어려움을 겪게 될 뿐만 아니라 입원 기간이 길어질 수 있다24. 일반적으로 통증은 생쥐의 섭식 행동에 영향을 미칩니다. 따라서 화상 후 각 상처를 즉시 얼음으로 치료하고 통증 관리를 위해 3일 동안 하루 2회 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 피하 주사했습니다. 또한 먹이를 쉽게 먹일 수 있도록 음식 알갱이를 부드러워 케이지 바닥에 놓았습니다. 공동 주거 환경에서 생쥐는 서로의 상처를 긁고 핥을 수 있으며, 이로 인해 상처 치유가 지연되거나 감염을 일으킬 수 있습니다. 따라서 예방 조치로 생쥐의 개별 사육이 필요합니다. 화상 유도 후 등쪽을 덮기 위해 통기성 드레싱을 사용하면 생쥐가 상처를 긁는 것을 방지하고 감염 위험을 줄일 수 있다25. 그러나 드레싱을 현명하게 선택하고 쥐가 정상적으로 움직일 수 있도록 적절한 크기로 자르는 것이 중요합니다. 드레싱이 떨어지면 즉시 교체해야 하며 적어도 이틀에 한 번 교체하는 것이 좋습니다. 드레싱을 장기간 사용하면 상처 삼출물이 제대로 흡수되지 않을 수 있습니다.

마우스 모델에는 고유한 장점이 있지만 여전히 인간의 상처 치유 과정을 완전히 시뮬레이션할 수는 없습니다. 인간은 주로 재상피화(re-epithelialization)와 과립화(granulation)를 통해 치유합니다. 이와는 대조적으로, 쥐의 피부는 인간의 경우 목의 판형질에만 존재하는 얇은 골격근층인 독특한 panniculus carnosus를 특징으로 하기 때문에7 상처 치유는 주로 상처 수축을 통해 이루어집니다. 또한, 생쥐 피부는 전구 세포가 풍부하게 함유되어 있어 빠른 피부 치유와 각질화를 촉진할 수 있습니다26,27. 이러한 요인들이 총체적으로 치유 시간을 크게 단축시키는 데 기여합니다. 동물 모델에서는 상처 수축이 치유 과정에 미치는 영향을 완화하고 육아 조직 및 재상피화로 치유하는 인간과 유사한 생리적 상처 치유를 모방하기 위해 상처 수축 방지 링이 사용되었습니다 12,17,28.

생쥐 화상 부상 모델의 성공적인 확립은 열 손상의 병태생리학을 연구하고 잠재적인 치료 개입을 평가하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 화상을 입은 피부 조직에서 관찰된 조직학적 변화는 열 손상의 특징과 일치하며, 화상의 임상적 징후를 재현하는 데 있어 모델의 신뢰성과 타당성을 강조합니다.

전반적으로 마우스 화상 부상 모델은 화상으로 인한 조직 손상, 염증 및 상처 치유 과정의 기저에 있는 분자 메커니즘을 조사하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다. 이 모델을 활용한 향후 연구는 화상 환자의 결과를 개선하고 화상 관련 이환율 및 사망률의 부담을 줄이는 것을 목표로 하는 새로운 치료 접근법의 개발에 기여할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 쓰촨성 과학 기술 프로그램(23ZYZYTS0120), 중국 서부 구강학 병원 쓰촨 대학 보조금(RD-03-202011) 및 쓰촨 과학 기술 프로그램(2022NSFSC0614)의 지원을 받았습니다. 피규어는 BioRender로 제작되었습니다. com입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL 피펫 팁KIRGEN, USAKG1333화상 상처 부위를 찾는 데 사용
3 M Tegaderm 필름3M, USA1624WCN 6 cm x 7 cm화상 유도 후 상처 커버
용 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)Biosharp, 중국BL539A피부 샘플을 고정하는 데 사용
부프레노르핀Sigma-Aldrich, 미국PHR8955-50MG마우스의 통증 관리
C57BL / 6 마우스Chengdu Dashuo 실험 동물 회사, 중국없음화상 모델
설립 제모 크림Veet, 중국—쥐의 등쪽 제모를 위해
디지털 난방 장치Shenzhen Kapper Technology Company, ChinaNo.936D생쥐의 화상 유도
전기 면도기AUX, 중국AUX-A5생쥐의 등쪽 제모
여과지—&엠대시;피부 샘플의 풀림에 사용
GraphPad 소프트웨어—GraphPad 프리즘 9.5.0화상 부위 분석용
내열 장갑—&엠대시;디지털 가열 장치 팁을 잡는 데 사용됩니다.
Hematoxylin 및 Eosin Stain 키트Solarbio, 중국G1120슬라이드의 조직 학적 분석
ImageJ 소프트웨어—ImageJ 1.54f화상 상처 부위 분석용
IsofluraneRWD, 중국R510-22-10생쥐의 마취용
Masson's Trichrome Stain KitSolarbio, 중국G1340슬라이드의 조직학적 분석용
현미경Olympus, 일본 VS200 ASWH&를 스캔하는 데 사용됩니다. E와 Masson는 활주
조직 카세트CITOTEST LABWARE 제조 Co., 주식 회사, 조직파라핀 탈수함과 파라핀 끼워넣기를 위한31050102W
용 중국 를 얼룩이 졌습니다

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