방법 논문

아데노 관련 바이러스 혈청형 8(AAV8)로 전달되는 작은 헤어핀 RNA의 비장내 주입을 통한 간의 효율적인 유전자 녹다운

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⸱

DOI:

10.3791/67376

⸱

2024년 11월 1일

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 AAV8 전달 small hairpin RNA의 intrasplenic injection이 어떻게 문맥 주사와 동일한 유전자 knockdown 효율을 간에서 달성하는지 설명하며, 이는 수술 전후 및 수술 후 사망률과 합병증이 훨씬 낮은 더 간단한 절차를 나타냅니다.

초록

간은 필수적인 신진대사 기능을 수행하는 주요 기관입니다. 간에서 유전자 발현을 억제하는 효율적이고 안전한 방법을 개발하는 것은 간 병태생리학에서 유전자 기능을 결정하는 데 중요한 도구를 제공합니다. 본 연구에서는 관심 대상 유전자인 뉴클레오스테민(NS)에 대해 작은 헤어핀 RNA(shRNA)를 발현하도록 조작된 아데노 관련 바이러스 혈청형 8(AAV8)의 비장 내 주입 방법을 설명합니다. NS-targeted shRNA (AAV8-shNS1)를 발현하는 AAV8의 intrasplenic injection은 scrambled sequence shRNA (AAV8-shScr)를 발현하는 AAV8 주입과 비교하여 문맥 주사와 동일한 NS knockdown 효율을 달성했습니다. 또한, AAV8-shRNA 바이러스의 주입은 간 실질에서 최소한의 염증 반응을 유발했습니다. 가장 중요한 것은 이 비장내 주사 프로토콜이 기술적으로 까다롭지 않았고 주사 부위에서 최소한의 출혈을 유발했으며, 이는 문맥 주사를 수행할 때 수술 전후 및 수술 후 사망의 주요 원인입니다. 이 연구는 간에서 효율적인 유전자 녹다운을 달성하기 위한 개선되고 상대적으로 안전한 방법을 보고합니다.

서론

간은 영양소와 화학 물질을 대사하는 중요한 기관이지만 세포 독성 및 발암성 물질에 지속적으로 노출되어 있습니다. 성인 간은 부상 후 다시 자랄 수 있지만1세가 되면 재생 능력이 심각하게 저하됩니다. 현재까지 말기 만성 간 질환 또는 대규모 급성 간 손상을 입은 환자를 위한 유일한 치료 옵션은 간 이식이며, 이는 그 자체로 많은 어려움을 안겨줍니다2. 관심 유전자의 기능을 조사하여 간의 분자 병태생리학을 더 잘 이해하기 위해 RNAi 매개 녹다운(knockdown) 및 loxP 부위가 있는 상태에서 Cre 재조합효소에 의한 표적 삭제를 포함한 생체 내 적용을 위한 유전자 조작이 개발되었습니다3. cre-expression cassette 및 shRNA 구조체는 바이러스 비히클에 의해 전달될 수 있습니다.

Adeno-associated virus serotype 8 (AAV8)은 높은 효율과 낮은 염증 반응으로 선택적 조직 유형(예: 간, 골격근, 심장, 뇌 및 췌장)에 유전자를 전달하는 강력한 벡터입니다 4,5. 내부 신체 장기를 표적으로 삼기 위해 AAV8은 일반적으로 바이러스 입자가 전신 순환에 도달하기 전에 먼저 폐를 통과하는 꼬리 정맥 주사에 의해 도입됩니다. 대조적으로, 문맥 주사는 폐를 순환하기 전에 먼저 간에 도달할 수 있도록 하며, 이는 격리 및 희석의 잠재적인 원인입니다. 그러나 문맥 주사는 기술적으로 까다롭고 종종 수술로 인한 출혈과 높은 사망률로 인해 복잡합니다. 높은 수술 전후/수술 후 사망률 문제를 피하면서 간에서 효율적인 유전자 녹다운(KD)을 달성하기 위해 뉴클레오스테민(NS)(AAV8-shNS1)을 표적으로 하는 조작된 shRNA를 운반하는 AAV8의 비장 내 주사 방법을 테스트하고 KD 효율을 문맥 주입 AAV8-shNS1의 KD 효율과 비교했습니다.

NS는 신경 줄기 세포에서 먼저 발견되고 나중에 다른 여러 유형의 줄기 세포 및 암에서 발견되는 줄기 / 전구 세포가 풍부한 단백질입니다6, 7. NS의 생물학적 중요성은 생식세포 NS-knockout(NSKO) 마우스의 초기 배아 치사 표현형에 의해 생체 내 3,8 및 NSKD 유도 체외 재생 섭동에 의해 나타납니다 9,10. 성체 동물의 경우, 고환 및 재생이 진행되는 여러 조직에서 높은 수준의 NS 발현이 발견되는데, 여기에는 사지 절단 후 근육 세포와 사지 절단 후 근육 세포11 뿐만 아니라 심장 손상12 후 마우스 심근세포, 간 손상(예: CCl4) 또는 외과적 절제술 후 간세포(예: 부분 간 절제술)13,14. 또한, NS는 유선, 간 및 구강 종양의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다 15,16,17. 기계론적으로, NS는 복제 게놈을 DNA 손상으로부터 보호함으로써 자기 재생을 촉진하는 것으로 나타났습니다18,19. 그러나 생식계열 NSKO의 초기 배아 치사 표현형으로 인해 성체 장기에서 NSKD의 생물학적 활성을 추가로 결정하기 위해 조직 발달이 완료된 후 NSKD를 일시적으로 도입하는 실험적 방법이 필요합니다.

이 글에서는 NS를 사례로 사용하여 효율적이고 시술로 인한 사망률이 낮은 in vivo 간 유전자 KD 방법의 확립 및 테스트를 설명합니다.

프로토콜

이 연구에서 완료된 모든 동물 실험은 휴스턴에 있는 텍사스 A&M 대학 보건 과학 센터(승인 번호: 2021-0264-IBT)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에서 검토 및 승인되었으며 모든 관련 규제 및 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 암컷 C57BL/6J 마우스(생후 4-5개월, 체중 23-30g)를 사용했습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. AAV8- shRNA 설계 및 생산

참고: 절차적 세부 사항은 Sands et al.4 를 참조하십시오.

  1. 관심 유전자의 코딩 영역 내에서 21-뉴클레오티드 긴 염기서열을 표적으로 하는 감지 및 안티 센스 shRNA 올리고뉴클레오티드를 설계합니다. 이 경우, 마우스 NS(shNS1)와 음성 대조군으로 21개의 뉴클레오티드(shScr)의 스크램블 서열을 사용했습니다(그림 1A, 하단 패널).
  2. 헤어핀 구조에는 TTCAAGAGA의 줄기-루프 서열, 5' 뭉툭한 말단, 3' XhoI-호환 응집력 있는 말단, 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3'(shNS1)의 유전자 특이적 표적 감지 서열 또는 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3'(shScr)의 스크램블 서열을 포함합니다.
  3. 각 쌍의 올리고뉴클레오티드를 인산화하고 어닐링합니다.
  4. HpaI 및 XhoI를 사용하여 AAV 유전자 전달 벡터인 AV5-siRNA-GFP(그림 1A, 상단 패널)를 분해하고 벡터 단편을 dephosphorylate하고 gel purify합니다.
  5. 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 겔 정제 벡터에 접합합니다.
  6. 접합된 DNA 산물을 subcloning 효율로 적격 DH5α 박테리아로 변환합니다.
  7. 암피실린 내성에 의한 단일 클론을 선택하고 플라스미드 미니프렙을 위해 100mL 박테리아 배양을 성장시킵니다. 염기서열분석을 통해 올바른 클로닝을 확인하고 시판되는 내독소가 없는 키트를 사용하여 플라스미드를 준비합니다(제조업체의 지침에 따름).
  8. iMFectin transfection 시약을 사용하여 AV5 전달 벡터, Rep/Cap 혈청형 8 및 AdF6 helper plasmid를 293T 세포에 transfection하여 AAV8 바이러스를 패킹합니다. 총 40 × 15cm 접시를 transfection하고 transfection 후 3일에 수확/소화했습니다.
  9. 세포 용해에 의해 세포 관련 AAV8을 회수하고 40% PEG로 배지 분비 AAV8을 침전시킵니다. 분해 후 세포 용해물과 배지에 AAV8 바이러스를 결합하고, 불연속 요오딕산올 구배를 정제하고, 분자량 차단 원심분리 장치(1,00,000MW)에 농축합니다.
  10. 프라이머를 사용한 절대 종점 qPCR로 AAV8 역가 정량화: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGTGGCCC-3') 및 WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. AAV8의 비장내 주사 (그림 1B, 1C) 

  1. C57BL6/J 마우스를 2% 이소플루란과 산소로 채워진 마취실에 넣습니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 의식을 잃은 후 마우스를 오른쪽 측면 누운 자세로 무균 수술 부위로 옮깁니다. 노즈 콘을 통해 산소가 전달되는 2% 이소플루란으로 마취를 유지합니다.
  2. 절개 부위를 2% 클로르헥시딘과 80% 에탄올로 살균합니다. 6.3인치 의료용 가위를 사용하여 왼쪽 상복부를 15mm 절개한 다음 복막을 10mm 절개합니다.
  3. 집게를 사용하여 비장을 부드럽게 노출시키고 장기 아래에 젖은 거즈를 놓고 비장을 제자리에 고정합니다.
  4. 팁을 표면 아래 3mm 깊이에 놓고 30G 바늘을 사용하여 30초 동안 AAV8 바이러스(50μL)를 부드럽게 혼합하고 비장에 주입합니다(그림 1B). 주사 부위를 면봉으로 덮고 1분 동안 압박합니다.
  5. 복막을 4-0 흡수성 크롬 장 봉합사로 봉합합니다.
  6. 4-0 실크 봉합사로 복벽과 피부를 닫습니다.
  7. 전기 열 패드 위의 깨끗한 케이지에 마우스를 놓고 회복될 때까지 모니터링합니다.

3. AAV8의 문맥 주사

  1. 산소와 혼합된 이소플루란 흡입(2%)으로 C57BL6/J 마우스를 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
  2. 피부의 정중선 절개(~1인치)를 통해 복막으로 개복술 4,13을 수행합니다.
  3. 멸균 식염수에 적신 멸균 거즈 패드를 마우스의 왼쪽에 놓고 멸균 면봉을 사용하여 대장과 소장을 부드럽게 당겨 빼냅니다. 젖은 거즈 위에 장을 놓고 피부에 닿지 않거나 건조하지 않도록 패드로 덮습니다.
  4. 50μL 부피의 32G 멸균 바늘로 문맥의 AAV 바이러스를 주입합니다. 바늘을 3도 미만의 각도로 포트 정맥에 5-5mm 삽입합니다. 역류를 피하기 위해 5초 동안 혈액이 바늘을 통해 흐르도록 합니다.
  5. 멸균 면봉 끝을 주사 부위 위에 놓고 정맥이 완전히 닫히고 출혈이 없을 때까지(약 5분) 출혈을 방지할 때까지 부드러운 압력으로 놓습니다.
  6. 내부 장기를 복강에 부드럽게 다시 넣습니다.
  7. 4-0 실크 봉합사로 복벽과 피부를 닫습니다.

4. qRT-PCR 분석

  1. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 RNA 분리 시약을 사용하여 50-100mg의 간 조직 4,13에서 RNA를 추출합니다(재료 표 참조).
  2. 총 RNA에서 1ststrand cDNA를 무작위 헥사머 및 M-MLV 역전사효소20,21로 합성합니다.
  3. 이전에 발표된 보고서22,23에 따라 단색 real-time PCR 검출 시스템과 슈퍼믹스 SYBR 녹색 시약을 사용하여 표적 유전자와 참조 유전자 사이의 ΔC(t) 값을 측정합니다.
  4. 4개의 생물학적 복제와 3개의 기술 반복(n = 12)에서 ΔΔC(t) 값을 측정합니다. 모든 반응에대해 Tm을 60°C로 설정합니다. 두 개의 참조 유전자 Rps3 및 Rplp0를 사용하여 결과를 확인합니다.
  5. 다음과 같이 프라이머 서열을 설계한다: Ns, 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3' 및 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3'; Rps3, 5'-atg, gcg, gtg, cag, att, tcc, aa-3' 및 5'-cat, tct, gtg, tcc, tgg, tgg, c-3'; Rplp0, 5'-ctg, aag, tgc, tcg, aca, tca, ca-3' 및 5'-agt, ctc, cac, aga, caa, tgc, ca-3'.

결과

intrasplenic vs. AAV8-shRNA의 문맥 주입
AAV8 바이러스 스톡을 밀리리터(gc/mL)당 2E+12 게놈 복제(gc)의 작업 농도로 희석했습니다. 개별 마우스에 1E+11 gc의 AAV8-shNS1 또는 AAV8-shScr(50 μL)을 비장 내 또는 문맥 주사를 통해 주입했습니다. 주사 2주 후, RNA 분리, 1st strand cDNA 합성 및 qPCR 분석을 위해 간 조직을 채취했습니다. 그 결과, 비장내 주입 방법은 Rsp3 및 Rplp0를 내부 기준으로 사용하여 문맥 주입 방법(16.3% ± 3.6%)과 통계적으로 동일한 NSKD 효율(20.8% ± 4.4%)을 달성한 것으로 나타났습니다(그림 2). 특히 비장내 주사 시술은 15분 이내에 완료되어 시술로 인한 사망이 거의 없는 반면, 문맥 주사 방법은 일반적으로 많은 연습으로 25-30분이 소요되며 더 높은 사망률(~25%-30% 사망률)과 관련이 있었습니다.

조직 염증 반응
AAV8-shScr(그림 3A) 또는 AAV8-shNS1(그림 3B)의 문맥 주사 또는 비장내 주사를 받은 마우스에서 간 조직을 수집하여 대조군 마우스(그림 3C)의 조직과 비교했습니다. 염증 반응은 H&E 염색으로 검사했습니다4. 그 결과, AAV8-shScr과 AAV8-shNS1 모두 비장내 주사(Spl) 또는 문맥 주사(PV) 방법으로 주입된 PBS에 비해 간 실질에서 주목할 만한 염증 반응을 유발하지 않는 것으로 나타났습니다(그림 3A-C).

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그림 1: AAV8-shRNA 설계 및 비장내 주입 절차의 그림. (A) (위) in vivo knockdown 실험을 위해 아데노 관련 바이러스 혈청형 8(AAV8)을 만들도록 설계된 AV5-siRNA-GFP 플라스미드의 다이어그램. AV5-siRNA-GFP는 CMV promoter-driven shRNA sequence와 EGFP를 포함하고 있습니다. (아래) 마우스 NS(shNS1) 또는 스크램블된 21-뉴클레오티드 염기서열(Scr)에서 21-뉴클레오티드 염기서열을 표적화하도록 설계된 소형 헤어핀 RNAi 구조체입니다. (B) 비장내 AAV8 주입 절차의 개략적인 워크플로우 다이어그램. (C) 수술 절차의 단계적 견해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 비장내 주사와 문맥 주사를 통한 간에서 AAV8-shRNA 매개 뉴클레오스테민(NS)의 녹다운(knockdown)의 효율성. AAV8-shScr 또는 AAV8-shNS1(1E+11 gc)의 비장내(Spl) 또는 문맥(PV) 주사를 받은 후 2주에 마우스에서 채취한 간 샘플에서 NS 발현에 대한 qRT-PCR 분석. 그래프는 두 개의 내부 대조군 Rps3(A) 및 Rplp0(B)에 대한 결과를 보여줍니다. 막대는 4개의 생물학적 복제물의 평균 ± SEM을 보여주며, 각 복제에는 3개의 PCR 기술 반복이 있습니다. *P < 0.01; **p < 0.001; 피 < 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: PBS, AAV8-shScr 또는 AAV8-shNS1의 비장내 주사 또는 문맥 주사 후 간 조직의 조직학. AAV8-shScr (A) 또는 AAV8-shNS1 (B)의 비장 내 주사 (Spl) 또는 문맥 주사 (PV) 후 2 주째에 간 조직의 H & E 염색, 대조군 비 AAV8 주입 샘플 (C)과 비교. 눈금 막대 : 100 μm. 오른쪽 패널에는 왼쪽 패널에 있는 삽입의 확대 보기가 표시됩니다. 눈금 막대 : 50μm. 두 개의 다른 동물에서 6-9개의 섹션을 각 그룹에서 검사했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

야생형 배경에서 shRNA 발현 구조체 24,25 또는 플록스된 배경26에서 Cre 재조합효소 발현 구조체의 바이러스 전달에 의한 유전자 KD는 유도 가능하고 시간 제어가 가능한 방식으로 생체 내에서 유전자 기능을 조사하는 강력한 방법입니다. in vivo 유전자 KO/KD 연구를 위한 이상적인 전달 방법은 관심 기관에서 높은 KO/KD 효율을 달성해야 하며, 또한 수술 전후/수술 후 사망률을 최소화하면서 절차 자체가 기술적으로 쉬워야 합니다.

간과 같은 내부 장기의 경우, 바이러스 입자는 꼬리 정맥27 또는 문맥28,29 을 통해 주입하거나 비장에 직접 주입(비장 내 주사)으로 유입될 수 있습니다 30 , 31 . 문맥 주사와 비장내 주사는 바이러스 입자를 문맥 순환계로 유입시키며, 이 바이러스 입자는 하대정맥으로 들어가기 전에 간으로 배출되고 그 후에는 폐 순환으로 들어갑니다. 대조적으로, 꼬리 정맥 주입을 통해 유입된 바이러스 입자는 문맥 순환을 우회하여 전신 순환에 도달하기 전에 폐 순환으로 들어갑니다. 간과 같이 문맥 순환을 받는 장기의 경우, 문맥 및 비장내 주사는 폐에 의해 격리되거나 전신 순환에서 희석될 위험 없이 바이러스 입자를 해당 장기에 직접 전달할 수 있는 이점을 제공합니다. 뇌와 같이 문맥 순환을 받지 않는 장기의 경우, 꼬리 정맥 주사는 폐 순환에 도달하기 전에 간에 바이러스 입자가 침투하지 않고 그 후 전신 순환에 도달하는 데 더 유익할 수 있습니다.

본 연구에서는 AAV8-shNS1을 동물 1마리당 1E+11 gc의 용량으로 주입하였는데, 이는 1E+10 gc에 비해 KD 효율이 더 좋았으나 인트라포털 주입 을 통해 5E+11 gc와 동일한 KD 효과를 달성하였다(데이터는 표시되지 않음). 1E+11 gc 투여량에서 문맥 주사법과 비장내 주사법을 비교한 결과, 간에서의 NSKD 효율에 있어 통계적 차이는 발견되지 않았으며, 70%-80%의 KD 효율을 달성했습니다. 간에서 문맥 주입된 AAV8의 유전자 KD 효과는 구조 의존적 방식으로 최대 6주 동안 지속될 수 있습니다23. 특히 수술로 인한 출혈 및 망막/복막 유착과 같은 시술 관련 합병증과 기술적 어려움이 문맥 주사법에 비해 비장내 주사법이 현저히 적고 낮습니다. 그 결과, 문맥 주사는 한 번 시행하는 반면, 비장내 주사는 반복적으로 시행할 수 있다32. 마지막으로, 문맥 주사 또는 AAV8-shScr 또는 AAV8-NS1의 비장내 주사를 받은 간의 실질에서 염증 반응은 거의 또는 전혀 없었습니다. 그러나 마지막 발견은 AAV의 극도로 높은 역가가 여전히 실험 결과를 혼란스럽게 하는 염증 반응을 유발할 수 있는 가능성을 배제하지 않습니다. 따라서 최적의 AAV 투여량은 KD 효율과 AAV8 유도 반응 간에 경험적으로 결정되고 균형을 이루어야 하며 다른 표적 유전자 및/또는 염기서열에 따라 다를 수 있습니다. 결론적으로, 이러한 결과는 AAV8-shRNA의 intrasplenic injection이 간에서 in vivo gene KD를 달성하기 위한 매우 효율적이고 상대적으로 안전하며 간단한 방법임을 보여줍니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 텍사스 암 예방 연구소(CPRIT)의 RP200081(Individual Investigator Research Award)에서 RYT에 수여하는 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Amicon 필터 원심분리 장치MilliporeSigmaUFC9100빠른 한외여과
AV5-siRNA-GFP Addgene #124972플라스미드
유능한 DH5&알파; 박테리아 Invitrogen#18265-017클로닝을 위한 화학적으로 유능한 균주 
HpaI New England BiolabsR0105제한 효소
iMFectin 형질감염 시약 GenDepotI7100-101
M-MLV 역전사 효소 PromegaM1708RNA 의존성 DNA 중합효소 
MyiQ 단색 실시간 PCR 검출 시스템 Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
오메가 내독소 프리 키트 BioteckD6915-03플라스미드 DNA 미디 준비 
무작위 육량체 Invitrogen48190-011
슈퍼믹스 SYBR 녹색 시약 Bio-Rad1708882실시간 PCR 응용 분야
T4 DNA 리가제PromegaM1801
TRIzol 시약 Technologies15596-018고품질 총 RNA
XhoINew England BiolabsR0146제한 효소
Life 분리

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