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방법 논문

갓 얼어붙은 인간 뇌 절편에서 방출된 작은 세포외 소포에서 MicroRNA 화물의 힘 활용

1.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67379

⸱

2024년 11월 8일

 ,  ,  , 
1Translational Medicine Laboratory, Biomedical Research and Innovation Centre, University of Salford

이 논문에서

요약

여기에서는 신경 장애에 대한 microRNA(miRNA) 바이오마커의 공급원으로 작은 세포외 소포체를 얻기 위해 최소량의 신선 냉동 뇌 조직 절편과 크기 배제 크로마토그래피와 결합된 접근 가능한 고속 원심분리 방법을 사용하여 프로토콜을 구축합니다.

초록

작은 세포외 소포체(sEV)는 세포-세포 통신의 중요한 매개체로, 단백질, 지질, 핵산(microRNA, mRNA, DNA)과 같은 다양한 화물을 운반합니다. microRNA sEV 화물은 생물학적 장벽(예: 혈액-뇌 장벽)을 통과하고 다양한 체액을 통해 접근할 수 있는 sEV의 능력으로 인해 강력한 비침습적 질병 바이오마커로서 잠재적인 유용성을 가지고 있습니다. 체액의 sEV 바이오마커에 대한 수많은 연구에도 불구하고 조직 또는 세포 특이적 sEV 하위 집단을 식별하는 것은 특히 뇌에서 여전히 어려운 일입니다. 우리의 연구는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 최소량의 동결된 인간 뇌 절편에서 sEV를 분리하는 기존 방법을 조정하여 이 문제를 해결합니다.

윤리적 승인 후, 약 250μg의 신선 냉동 인간 뇌 조직(Manchester Brain Bank [UK]에서 획득)을 3개의 공여자 조직에서 절편화하고 콜라겐분해효소 유형 3/Hibernate-E 용액에서 중간 교반한 후 연속 원심분리 및 여과 단계로 배양했습니다. 그런 다음, SEC 공법을 이용하여 sEV를 분리하고, MISEV 가이드라인에 따라 특성화하였다. 이러한 sEV 내에서 RNA를 분리하기 전에 용액을 Proteinase-K 및 RNase-A로 처리하여 non-sEV 세포외 RNA를 제거했습니다. RNA의 양과 질은 qPCR 및 small RNA 염기서열분석 실험을 위해 추가로 확인 및 처리되었습니다.

sEV의 존재는 형광 나노입자 추적 분석(fNTA) 및 표면 마커에 대한 웨스턴 블롯(CD9, CD63, CD81)을 통해 확인되었습니다. 크기 분포 (50-200 nm)는 NTA와 전자 현미경으로 확인되었다. 용해된 sEV 내 총 RNA 농도는 3-9ng/μL 범위였으며 선택된 후보 microRNA에 대한 qPCR에 의한 성공적인 정량화에 사용되었습니다. MiSeq에 대한 Small RNA 염기서열분석은 샘플당 140만-500만 번의 판독으로 고품질 데이터(Q >32)를 제공했습니다.

이 방법은 최소한의 뇌 조직 부피에서 sEV를 효율적으로 분리하고 특성화하여 비침습적 바이오마커 연구를 촉진하고 공평한 질병 바이오마커 연구를 약속하여 신경퇴행성 질환 및 잠재적으로 다른 장애에 대한 통찰력을 제공합니다.

서론

세포외 소포체(EV)는 모든 다세포 유기체에서 세포 간 통신의 핵심 역할을 하는 것 중 하나입니다1. EV는 단백질, 지질 및 핵산과 같은 다양한 화물 하중을 수용 세포로 쉽게 전달할 수 있는 세포 유래 지질 이중막 입자입니다. EV는 30nm에서 최대 1μM에 이르는 광범위한 크기 범위를 가질 수 있습니다. 평균 직경 크기가 <200nm인 지질 결합 소포로 정의되는 소형 EV(sEV)는 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있는 능력이 있습니다. 따라서 그들은 신경퇴행성 질환 및 알츠하이머병(AD), 전두측두엽 치매(FTD), 파킨슨병(PD) 및 암과 같은 기타 상태의 프리온과 같은 확산 및 악화에 연루되어 있습니다 2,3. 또한 sEV는 혈액, 뇌척수액(CSF), 타액 및 소변과 같은 다양한 생체 유체에서 발견될 수 있으므로 바이오마커 및 비침습적 진단 분야에 걸쳐 유익한 용도로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 알츠하이머병 연구는 타우/Aβ 또는 Aβ42/Aβ404와 같은 생체 유체 병원성 단백질 비율의 사용을 지적할 수 있습니다.

sEV의 알려진 화물 중 하나는 microRNA(miRNA)로, mRNA의 3'-UTR 영역에 결합하고 일반적으로 단백질 발현을 부정적으로 조절하는 약 22개의 뉴클레오티드 길이로 구성된 작은 비암호화 RNA 분자 그룹입니다. 많은 세포질 역할에 관여하는 miRNA는 또한 암 및 신경 퇴행성 질환을 포함한 다양한 질병의 발병기전과 관련이 있습니다. Cheng 등은 알츠하이머병 환자의 혈청 유래 sEV miRNA 발현 서명에 대한 고처리량 염기서열분석 분석을 수행했습니다5. 신경영상 기록 및 연령, 성별 및 APOE ε4 대립유전자 발현에 대한 알려진 위험 요인과 결합하면 87%의 민감도와 77%의 특이도로 AD를 예측하는 것으로 나타났습니다. 또한, 연구에서는 잠재적으로 초기 PD6을 진단할 수 있는 2개의 상향 조절된 CSF miRNA(miR-151a-3p, let-7f-5p)와 3개의 하향 조절된 miRNA(miR-27a-3p, miR-125a-5p 및 miR-423-5p)를 확인했습니다. 병리학적 질환의 경우 병리학적 상태가 질병의 특정 특징적인 증상보다 선행할 수 있는 반면, 신경퇴행에서는 병리학적 특징의 축적이 인지 기능 저하보다 훨씬 일찍 발생합니다.

MicroRNA는 다양한 기능과 고차원의 후성유전학적 조절로 인해 단백질보다 잠재적으로 더 효과적인 바이오마커입니다. 연구자들은 뇌 조직을 사용하여 질병 및 그 아형에 대한 특정 뇌 유래 sEV(BDsEV) miRNA 서명을 잠재적으로 식별할 수 있습니다. 예를 들어, 뉴런 및 신경교 마커가 있는 sEV는 서로 다른 miRNA 화물을 나타낼 수 있으며, 이를 통해 보다 정확한 질병 검출 방법을 얻을 수 있습니다. 또한, BDsEV는 신경병원성 단백질의 시냅스 횡단 확산에 큰 역할을 하는 것으로 제안됨7. 이전 보고서에서는 갓 동결된 뇌 조직에서 sEV를 얻기 위해 면역침전 및 밀도 구배(자당 구배) 초원심분리를 제안했습니다 8,9. 그러나 이러한 접근 방식에는 고품질 sEV 샘플을 얻기 위해 초원심분리기 및 다운스트림 정제 방법을 갖춘 특정 인프라가 필요합니다10. 보다 최근의 보고서에서는 접근 방식 11,12,13에 대한 몇 가지 수정 및 개선을 제안했습니다. 그러나 그럼에도 불구하고 인간 조직에서 sEV 유래 microRNA의 분리 및 연구는 여전히 널리 적용되지 않습니다. 이 프로토콜에 설명된 접근 방식은 이 기술에 대한 접근성을 향상시키기 위해 뇌 유래 sEV 연구를 위한 정제된 단계별 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 우리는 최소한의 뇌 조직을 사용하여 프로토콜을 수립했으며, 여기서 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 순수한 sEV를 분리하고 이러한 sEV의 microRNA 화물에서 고품질 차세대 염기서열분석 데이터를 보여주었습니다.

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프로토콜

이 작업은 Manchester Brain Bank(REC 참조 09/H0906/52)와 University of Salford의 윤리 위원회(응용 프로그램 ID: 3408)에 의해 윤리적으로 승인되었습니다.

1. 동결된 뇌 조직 절편에 콜라겐분해효소를 이용한 세포내 기질의 분해

  1. 멸균된 메스를 사용하여 250mg의 냉동 뇌 조직(약 0.4mm 두께의 조각)을 냉각판에 얇게 자르고 75U/mL 콜라겐분해효소 III형/동면산-E 용액 2mL를 추가합니다.
  2. 각 샘플을 37°C의 수조에서 20분 동안 배양합니다. 5분 지점에서 각 샘플을 두 번 뒤집어 혼합합니다. 10분 시점에서 10mL 일회용 플라스틱 스트라이프를 사용하여 각 샘플을 세 번 부드럽게 피펫팅합니다.
  3. 각 샘플을 얼음 위에 놓고 1x 프로테아제 억제제 칵테일과 1x 인산가수분해효소 억제제를 첨가합니다. 이것은 효소 반응을 멈추고 콜라겐 분해 효소 III형을 사용한 분해의 종말점입니다.
  4. 각 뇌 조직 샘플을 300x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 각 상층액과 추가 원심분리기를 2000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 수집합니다.
  5. 각 상층액을 다시 모으고 0.22μm 필터를 통해 여과합니다. 각 여과액을 10,000 x g 에서 4°C에서 48분 동안 여과합니다.
  6. 상층액을 수집하고 각 샘플에 2:1의 비율로 침전 버퍼를 추가합니다. 4 °C에서 밤새 배양하십시오.
  7. 각 시료를 10,000 x g 에서 4°C에서 96분 동안 원심분리하고 펠릿을 100μL의 세포외 소포체(EV)가 없는 PBS에 재현탁합니다.

2. 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 준비

  1. 사용하기 전에 사전 준비된 SEC 컬럼을 실온(RT)에서 15분 동안 평형을 이룹니다.
    알림: 나사 캡보다 먼저 하단 캡을 제거해야 합니다.
  2. 평형 조정 후 컬럼 상단에서 방부제 버퍼를 제거하고 250μL의 EV-free PBS를 사용하여 컬럼을 두 번 세척합니다. 각 PBS 세척은 중력을 통해 컬럼으로 들어가도록 남아 있습니다.

3. 크기 배제 크로마토그래피를 사용한 작은 세포외 소포의 분리

  1. 재현탁된 펠릿을 SEC 컬럼 상단에 추가하고 50 x g 에서 30초 동안 컬럼을 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  2. 180μL의 EV-free PBS를 SEC 컬럼 상단에 추가하고 50 x g 에서 컬럼을 1분 동안 원심분리하여 뇌에서 유래한 sEV가 컬럼에서 용리되도록 합니다.
    참고: 위에서 자세히 설명한 프로토콜 부분은 그림 1에 요약되어 있습니다.

4. 웨스턴 블로팅(western blotting)에 의한 작은 세포외 소포 마커 확인

  1. 웨스턴 블롯 분석 전에 sEV를 용해하려면(모든 멤브레인 및 세포질 화물이 분석되었는지 확인하기 위해), 분리된 sEV 샘플을 용해 및 추출 완충액(1x 프로테아제 억제제 및 1x 인산가수분해효소 억제제)에서 1:1로 희석합니다.
  2. 샘플을 4°C에서 30분 동안 교반합니다.
  3. 14,000 x g 에서 15분 동안 원심분리기 시료
  4. 단백질 상층액을 수집하고 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.
  5. 시료를 4x Laemmli 완충액과 혼합하고 사전 염색된 단백질 래더에 대해 각 웰에 20μg의 단백질을 로드합니다.
  6. 분해되면 단백질을 0.45μm 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮깁니다. 이식 후 5% BSA에서 2시간 동안 멤브레인을 차단합니다.
  7. 1차 항체로 멤브레인을 밤새 배양합니다(표 1).
  8. 세척 완충액(PBS의 경우 1% Tween20)으로 멤브레인을 세 번 세척하고 항마우스 2차 항체를 사용하여 염색합니다. 그 후, 세척 버퍼(PBS의 경우 1% Tween20)로 3회 세척합니다.
  9. 블롯을 이미징하기 전에 원고에서 위의 단계를 따르십시오.
  10. 양고추냉이 과산화효소(HRP) 기질을 사용한 이미지.

5. 나노입자 추적 분석(NTA)을 통한 작은 세포외 소포체 확인

  1. NTA를 수행하여 샘플에 있는 모든 입자의 농도와 크기를 분석합니다. PBS의 각 샘플을 1:1000의 희석 계수로 희석하여 이를 수행합니다.
  2. 샘플을 NTA 기기에 주입하고 550nm의 파장에서 샘플을 판독합니다. 이 단계에서 입자 수량을 사용하여 MISEV 지침에서 권장하는 대로 입자당 단백질의 양(일반적으로 펨토그램으로 표시)을 측정합니다.
  3. 다음으로, 형광 NTA의 경우 PBS에서 1:1000의 희석 계수로 희석된 세포 마스크 오렌지(CMO)(샘플 내의 모든 생물학적 입자 염색)를 수행합니다. 이로부터 sEV 시료를 이용하여 CMO 염료를 1:10의 희석계수로 희석한다 - 이 희석 단계를 4°C에서 30분간 암흑 속에서 배양한다.
  4. PBS를 사용하여 두 번째 CMO 희석액을 1:1000의 희석 계수로 희석합니다.
    참고: CMO 염료의 최종 희석은 1:10 000 000이어야 합니다.
  5. NTA 기기를 사용하여 550nm의 파장에서 각 sEV 샘플의 CMO를 판독합니다.
  6. 테트라스파닌 형광 항체( 재료 표 참조)의 경우 먼저 각 항체를 PBS에 1:10의 희석 계수로 희석합니다. 이로부터 sEV 시료를 이용하여 각 염료를 1:10의 희석계수로 희석하고, 4°C에서 2시간 동안 암흑 속에서 희석 단계를 배양한다.
  7. PBS를 사용하여 두 번째 항체 희석액을 1:1000의 희석 계수로 희석합니다.
    참고: 각 테트라스파닌 항체의 최종 희석량은 1:100 000이어야 합니다.
  8. NTA 기기를 사용하여 550nm 파장에서 sEV 샘플의 형광 항체 판독값을 읽습니다.

6. 투과전자현미경(TEM)에 의한 작은 세포외 소포체 확인

참고: 이 프로토콜은 리버풀 대학의 생체 의학 현미경 시설에서 수행했습니다.

  1. 먼저 글루타르알데히드를 사용하여 sEV 샘플을 수정하고 우라닐 아세테이트를 사용하여 염색합니다.
  2. 등급이 매겨진 일련의 알코올을 통해 TEM에 사용할 수 있는 샘플을 탈수합니다.
  3. 적절한 투과 전자 현미경을 사용한 이미지 샘플.

7. Proteinase K 및 RNase A 처리

  1. 50 μL의 분리된 뇌 유래EV에 1 μL의 20 μg/μL proteinase K를 첨가하고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 1x proteinase inhibitor cocktail을 첨가하여 각 반응을 중지하고 얼음에서 10분 동안 배양합니다.
  3. 배양 후 각 샘플에 10 μg/μL RNase A 1 μL를 추가하고 37 °C에서 30분 동안 추가로 배양합니다.
    참고: 즉시 섹션 8로 이동합니다.

8. 작은 세포외 소포체에서 총 RNA 분리

  1. 전체 RNA를 분리하려면 50μL의 뇌 유래 EV(BDsEV) 샘플에 700μL의 고품질 RNA 회수 용해 시약을 추가합니다. 각 샘플을 1시간 동안 교반합니다.
  2. 클로로포름 140μL를 추가하고 각 샘플을 20초 동안 세게 흔든 다음 RT에서 3분 동안 배양합니다.
  3. 12,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 시료를 원심분리하고 시료에서 계면을 수집합니다. 100% 에탄올의 1.5배 부피를 추가합니다.
  4. 700μL의 계기/에탄올 혼합물 RNA 분리 컬럼을 추가하고 ≥8000 x g 에서 실온에서 15초 동안 원심분리합니다.
    참고: 모든 계기/에탄올 샘플을 사용하여 이 단계를 반복합니다.
  5. 컬럼에 700μL의 세척 버퍼를 추가하고 ≥8000 x g 에서 15초 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  6. 500μL의 완충액 RPE를 추가하고 ≥8000 x g 에서 15초 동안 다시 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  7. 500μL의 80% 에탄올을 넣고 ≥8000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 플로우 스루를 폐기합니다.
  8. 이 시점에서 뚜껑을 연 상태에서 5분 동안 최대 속도(>8000 x g)로 컬럼을 원심분리하여 컬럼 멤브레인을 건조시킵니다.
  9. 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고, 14μL의 RNase-free 물을 컬럼 멤브레인에 직접 첨가하고, ≥8000 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 BDsEV에서 총 RNA를 용리합니다.
  10. miRNA 정량화 분석 키트를 사용하여 샘플로 전체 microRNA를 정량화하고, 정량화 형광측정기에서 샘플을 측정하고 miRNA 분석 유형을 선택합니다.

9. 작은 RNA 시퀀싱

  1. 시료 내 miRNA를 정량화한 후 Small RNA-Seq Library Prep Kit를 사용하여 cDNA 라이브러리를 합성합니다.
    참고: 이 프로토콜을 사용하여 라이브러리 생성에는 3' 어댑터 ligation, purification, 5' adapter ligation 및 reverse transcription의 4단계가 포함되었으며, 최종적으로 RNA/cDNA 라이브러리가 형성됩니다. 라이브러리 생성 후, 종말점 PCR 증폭은 인덱스 프라이머가 추가되면서(멀티플렉싱 목적으로 사용됨) 발생하며, 그 후 샘플이 정제됩니다.
  2. RNA 품질을 테스트하려면 각 제제의 크기와 피크 강도를 자세히 설명하는 품질 관리 응용 프로그램 분석을 사용하십시오.
  3. DNA 농도를 테스트하려면 dsDNA 분석 유형을 선택하여 정량화 형광계에서 DNA 정량화를 측정합니다.
  4. 시약 키트를 사용하여 Small RNA Seq에 대한 샘플을 준비한 후 샘플을 플로우 셀(flow cell)에 로드합니다.

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결과

BDsEV의 존재를 확인하기 위해 웨스턴 블로팅(western blotting), NTA 및 TEM의 세 가지 기술이 사용되었습니다(그림 3). 웨스턴 블롯 결과(그림 3A 및 보충 파일 1)는 5개의 양성 마커(CD9, CD63, CD81, Flot-1 및 TSG101)가 모두 존재하고 sEV(음성 대조군으로 사용됨)에 Calnexin이 없음을 보여 세포 내용물에 대한 오염이 없음을 확인합니다. 예상대로 뇌 균질체(BH)는 테스트된 마커에 대한 sEV에서 관찰된 것보다 더 많은 단백질을 보여줍니다. TEM 이미지는 BDsEV의 형태와 샘플 내 상대적 크기를 확인했으며(그림 3B), 이는 나노 입자 추적 분석(그림 3C)을 통해 추가로 확인되었습니다.

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토론

뇌에서 유래한 작은 세포외 소포체와 그 microRNA 화물을 분리하기 위한 이 수정 및 개선된 프로토콜은 다운스트림 제품의 품질과 수량을 손상시키지 않으면서 최소한의 조직을 사용할 수 있는 가능성을 보여줍니다. 바이오마커 발견 분야에서, 세포 및 조직 유형에 특이적인 분자 식별자를 식별하면 체액을 사용하는 비침습적 진단 테스트의 보다 접근하기 쉬운 수단으로 이어질 수 있습니다. 또한, 여기에 설명된 접근 방식은 다양한 세포 유형(신경 조직 대 신경교세포 조직), 조직 유형(해마 조직 대 전전두엽 피질 조직) 및 생체 유체 내에서 특정 sEV 하위 집단을 식별하기 위한 프레임워크를 제공하며, 이를 통해 화물 적재 신호, 병태 생리학 및 질병 범위에 대한 더 큰 이해를 제공할 것입니다. 이전에 Vella 등에서 개략적으로 설명한 바와 같이, 밀도 구배 초원심분리(최대 180,000 x g의 속도 사용)8와 함께 ...

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공개 사항

저자 중 누구에게도 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 영국 알츠하이머 협회(Alzheimer's Society UK)의 조셉 모건(Joseph Morgan) 박사 과정 학생(보조금 번호 549/SERA-52)과 샐퍼드 대학교(University of Salford)의 혁신 전략 기금(보조금 SEFA-39)의 자금 지원을 받았습니다. 뇌 조직은 Brains for Dementia Network의 Manchester brain bank(REC Reference 09/H0906/52)에서 얻었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
소 혈청 알부민MerckA9418-100G
셀 마스크 주황색 플라즈마 멤브레인 염색ThermoFisher ScientificC10045
콜라겐 분해 효소 III형StemCell Technologies07422
ExoSpin 컬럼 및 버퍼세포 유도 시스템 Ltd.EX01-50이 키트에는 이 실험에 사용된 SEC 컬럼, 침전 버퍼 및 EV 프리 PBS가 포함되어 있습니다.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)ThermoFisher Scientific78429
Hibernate-E MediumThermoFisher ScientificA1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)BioRad1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep KitLexogen052.24이 키트에는 i7 Index 프라이머 플레이트가 있는 Small RNA 준비 시약 상자가 포함되어 있습니다.
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084이 키트에는 고품질 RNA 회수 용해 시약(Qiazol), RNA 분리 컬럼, 분리 버퍼(RWT, RPE) 및 RNase free water가 포함되어 있습니다.
MiSeq 시약 키트 v3IlluminaMS-102-3001이것은 Illumina 준비 키트
니트로셀룰로오스 막, 0.45 μ mThermoFisher Scientific88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 AntibodyBioLegend143914fNTA 분석에 사용
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 항체BioLegend349520fNTA 분석에 사용
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 항체BioLegend312118fNTA 분석에 사용
PhosSTOPMerck
Pierce BCA 단백질 어세이 키트ThermoFisher Scientific23225
Proteinase KThermoFisher Scientific25530049
Qubit microRNA 어세이 키트ThermoFisher ScientificQ32880
Qubit 1X dsDNA HS 어세이 키트ThermoFisher ScientificQ33230
Qubit 3.0 형광측정기ThermoFisher ScientificQ33216
RIPA 용해 및 추출 버퍼ThermoFisher Scientific89901
RNase AThermoFisher ScientificEN0531
SuperSignal West Femto 최대 감도 기판ThermoFisher Scientific34094
4906845001

참고문헌

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  3. Zhang, P., et al. Tumor-derived small extracellular vesicles in cancer invasion and metastasis: molecular mechanisms, and clinical significance. Mol Cancer. 23 (1), 18(2024).
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  5. Cheng, L., et al. Prognostic serum miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease shows concordance with neuropsychological and neuroimaging assessment. Mol Psychiatry. 20 (10), 1188-1196 (2015).
  6. Roser, A. E., Caldi Gomes, L., Schünemann, J., Maass, F., Lingor, P. Circulating miRNAs as diagnostic biomarkers for Parkinson's disease. Front Neurosci. 12, 625(2018).
  7. Jackson, N., Guerrero-Muñoz, M. J., Castillo-Carranza, D. L. The prion-like transmission of tau oligomers via exosomes. Front Aging Neurosci. 14, 974414(2022).
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  11. Ransom, L., et al. Human brain small extracellular vesicles contain selectively packaged, full-length mRNA. Cell Rep. 43 (4), 114061(2024).
  12. Gomes, P., et al. A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology. Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).
  13. Welsh, J., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV 2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2023).
  14. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  15. Pirisinu, M. The long journey of extracellular vesicles towards global scientific acclamation. Adv Pharm Bull. 13 (3), 489-501 (2023).
  16. Bender, A., Sullivan, B. P., Lillis, L., Posner, J. D. Enzymatic and chemical-based methods to inactivate endogenous blood ribonucleases for nucleic acid diagnostics. J Mol Diagn. 22 (8), 1030-1040 (2020).

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