방법 논문

CRISPR-Cas9 리보핵단백질(Ribonucleoprotein) 복합체 매개 유전자 절제를 이용한 쥐 CD4 T 세포 분화 조사

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DOI:

10.3791/67380

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2025년 6월 20일

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

이 논문에서

요약

CD4 T 세포 분화에서 유전자 기능을 조사하기 위해 쥐 미나 CD4 T 세포에서 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체 매개 유전자 절제를 사용하는 적응력이 뛰어난 접근 방식을 간략하게 설명합니다.

초록

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas9 기술의 광범위한 접근성으로 인해 일차 세포의 유전자 표적화는 T 세포의 유전자 기능을 평가하기 위한 일상적인 방법이 되었습니다. 녹아웃(KO) 마우스 균주의 비용과 제한된 가용성을 감안할 때, 유전자 표적 동물 모델을 사용하여 T 세포의 유전자 기능과 관련된 예비 가설을 테스트하는 것은 불가능할 수 있습니다. 그러나 연구자들은 사전 설계된 가이드 RNA(gRNA)를 포함하여 상업적으로 이용 가능한 리소스를 사용하여 T 세포 활성화 및 분화 연구에 사용할 수 있는 유전자 표적 미접촉 T 세포를 편리하게 생성할 수 있습니다.

여기에서는 nucleofection-delivered CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes(RNP)를 사용하여 in vitro에서 CD4 T 세포 분화에서 유전자 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 유전자 KO murine naive CD4 T cell을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 간략하게 설명합니다. 마우스 2차 림프 기관에서 naive CD4 T cell을 분리한 후 Cas9-gRNA complexes를 이용한 nucleofection은 downstream T cell 활성화 전에 gene KO가 시작되도록 보장하며, 일반적으로 T cell의 사전 활성화를 필요로 하는 retroviral-mediated gRNA delivery에 비해 전략적인 이점을 제공하여 naive T cell의 효과를 평가하지 않습니다. 또한, 이 뉴클레오펙션 기반 방법은 유전자 KO 동물과 관련된 잠재적인 발달 문제를 우회합니다.

Cas9-gRNA 전달 후 in vitro polarization을 사용하여 CD4 T 세포를 Th1, Th2, Th17 및 Treg 계통으로 분화하는 방법을 연구하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 이 프로토콜은 다른 체 외 T 세포 활성화 연구 및 생체 내 채택 전달 연구를 포함한 수많은 다운스트림 응용 분야에 유전자 표적 CD4 또는 CD8 T 세포를 사용하는 데 적용할 수 있습니다. CRISPR-Cas9 방법의 사용은 T 세포의 유전자 기능을 평가하는 능력을 간소화하고 많은 관심 유전자의 일상적인 KO를 가능하게 하여 연구자들이 유전자 KO 동물 연구와 관련된 한계에서 벗어날 수 있도록 했습니다.

서론

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) 기반 기술의 사용은 게놈 DNA 염기서열을 조작하는 능력을 변화시켜 수많은 생물학적 시스템에서 유전자 기능을 연구하는 능력을 크게 향상시켰습니다. CD4 T 세포와 관련하여 CRISPR-Cas9 리보핵단백질(RNP) 복합체를 활용하는 방법이 등장하여 시험관 내 및 생체 내 연구에 사용할 수 있는 1차 비진 T 세포에서 효율적인 유전자 녹아웃(KO)을 촉진합니다 1,2,3,4. CD4 T 세포 분화를 조절하는 것으로 추정되는 새로운 유전자의 확인은 종종 전사체 및 후성유전체 분석에 의해 주도되며, 특히 유전자가 여러 조직에 영향을 미치고 조건부 유전자 표적 마우스를 사용하여 평가해야 할 경우 조사할 자원이 적거나 얻기 어려운 새로운 표적을 생성합니다. gRNA 5,6의 레트로바이러스 transduction을 통한 유전자 표적화는 T 세포의 유전자 기능을 평가하는 데 사용되어 왔지만, 레트로바이러스 감염을 위해서는 T 세포 활성화가 필요하며 미성숙 T 세포의 유전자를 표적화하는 데는 사용할 수 없습니다. naive T cell에서 Nucleofection으로 전달된 CRISPR-Cas9는 시간과 비용이 많이 드는 마우스 모델에 투자하기 전에 새로운 관심 유전자를 검증하고 조사할 수 있는 상대적으로 저렴하고 빠른 대체 도구를 제공합니다.

여기에 설명된 프로토콜에서 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집은 핵 절편을 통해 naive CD4 T 세포에 전달되는 가이드 RNA(gRNA) 분자와 복합체를 이룬 재조합 Cas9 단백질을 사용하여 수행됩니다. gRNA는 trans-activating CRISPR RNA(tracrRNA)와 CRISPR RNA(crRNA)의 두 가지 구성 요소로 구성됩니다. 기능적으로 tracrRNA 유래 염기서열은 gRNA와 Cas9의 연관성을 촉진하는 반면, crRNA 염기서열은 관심 표적 DNA 영역에 대한 특이성을 포함합니다. Cas9-gRNA 복합체는 표적 이중 가닥 DNA(dsDNA) 절단을 매개하며, gRNA는 Cas9 엔도뉴클레아제 활성의 염기서열 특이성을 매개합니다 7,8. dsDNA의 Cas9 매개 절단은 표적 세포9에서 비상동 말단 결합 후 indel 돌연변이의 생성을 통해 유전자 불활성화를 유발합니다. 이 프로토콜에서는 naive CD4 T 세포에서 강력한 KO를 보장하기 위해 관심 유전자를 표적으로 하는 여러 gRNA를 사용하는 것이 좋습니다.

도우미 CD4 T 세포는 면역 체계의 핵심 플레이어로, 많은 면역 세포 유형의 기능을 조절하는 다양한 사이토카인 생성을 통해 면역 반응을 안내합니다. 특정 사이토카인이 존재하는 상태에서 T 세포 수용체(TCR)를 통해 자극을 받으면 순수 CD4 T 세포는 Th1, Th2, Th17 및 조절 T 세포(Treg)10,11,12를 포함한 T helper(Th) CD4 T 세포의 별개의 계통으로 분화할 수 있습니다. 이러한 뚜렷한 CD4 T 세포 계통을 정의하는 것은 특정 계통을 정의하는 전사 인자(TF)와 사이토카인의 발현입니다(그림 1). CD4 T 세포 분화는 혈통 촉진 사이토카인이 존재할 때 TCR을 통해 활성화되는 naive CD4 T 세포를 사용하고 부적절한 계통 채택을 방지하는 차단 항체를 사용하여 in vitro polarization 13,14,15를 사용하여 모델링할 수 있습니다.

비진 CD4 T 세포의 CRISPR-Cas9 유전자 표적화와 체외 CD4 T 세포 분극을 결합하면 이러한 세포의 유전자 기능을 평가할 수 있는 강력한 시스템을 제공할 수 있습니다(그림 2). 유세포 분석에 의한 CD4 분화를 평가하기 위한 시약의 광범위한 가용성을 감안할 때, TF 발현 및 사이토카인 생산을 포함한 CD4 T 세포 분화의 주요 측면은 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 쉽게 조사할 수 있습니다. CD4 T 세포 기능을 조절하는 새로운 유전자의 확인은 이러한 세포에 대한 우리의 이해를 향상시키며, CRISPR-Cas9 방법은 in vitro polarization과 쌍을 이루어 유전자 KO 마우스 모델에 적용하기 전에 유전자 기능을 평가하기 위한 강력한 방식을 제공합니다.

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프로토콜

여기에 설명된 모든 절차에는 야생형(WT) C57/BL6J 마우스를 사용했습니다. 마우스는 NIAID(프로토콜 LISB-22E) 및 NIH의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Welfare Assurance #A-4149-01)의 지침에 따라 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 유지 및 처리되었습니다.

1. 시작하기 전에 고려해야 할 사항

  1. gRNA 시약 선택
    참고: 이 프로토콜에 사용된 마우스 게놈을 표적으로 하는 사전 설계된 gRNA 시약을 얻으려면 재료 표를 참조하십시오.
    1. 관심 유전자(Table of Materials, Desired crRNAs)를 검색하고 사전 설계된 crRNA 상위 3개(2 nmol format)를 선택합니다. 또한 병렬로 사용할 음성 대조군 crRNA를 얻습니다(Table of Materials).
      참고: 기능적 gRNA를 형성하려면 crRNA를 tracrRNA와 이중화해야 합니다. tracrRNA 시약을 얻고 섹션 3의 단계를 따릅니다.
    2. 맞춤형 타겟 gRNA 염기서열을 설계합니다.
      참고: 맞춤형 타겟 gRNA 염기서열의 설계는 이 프로토콜의 범위를 벗어나지만 CRISPick(Table of Materials)과 같은 공개적으로 사용 가능한 도구를 사용하여 수행할 수 있습니다.
  2. 버퍼, 매체 및 장비
    알림: 달리 명시되지 않는 한 차가운(4°C) 버퍼와 시약을 사용하십시오.
    1. 절차를 시작하기 전에 MACS 완충액, FACS 완충액, 0.5% Triton X-100 완충액, 1x 투과화 완충액, 전체 RPMI 배지 및 전체 IMDM 배지(Table of Materials)를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
    2. 이 절차를 시작하기 전에 naive CD4 T cell isolation 및 anti-FITC microbead kit(Table of Materials)를 확보합니다.
    3. 핵 절제(섹션 4)를 시작하기 전에 5mL의 완전한 IMDM 배지를 예열(37°C)하고 37°C로 예열된 5ng/μL에서 IL-7이 보충된 최소 10mL의 완전한 IMDM을 준비합니다(재료 표). 핵 절제 후 샘플당 125μL를 추가할 수 있도록 필요에 따라 예열된 배지의 부피를 조정합니다. 핵 절제된 세포의 수에 따라 필요에 따라 IL-7을 포함하는 완전한 IMDM의 부피를 조정합니다(섹션 4).
    4. 항원제시세포(APC) 분리를 시작하기 전에 미토마이신 C 2mg 바이알(0.5mg/mL 스톡 농도)에 4mL의 멸균 H2O를 추가하여 미토마이신 C 시약을 준비합니다.
      참고: 조직 배양 후드에서 모든 단계를 수행하고 멸균 무균 기술을 사용합니다.

2. 나이브 CD4 T 세포 분리

참고: Naive CD4 T cell은 자기 절연을 사용하거나 세포 분류를 통해 분리할 수 있습니다. 자기 분리를 통해 얻은 순도는 일반적으로 97%이고 세포 생존율이 매우 높은 반면, 전자 분류는 세포 생존율을 희생하면서 세포 순도를 향상시킬 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 자기 절연을 사용하지만 두 시나리오 모두에 적용할 수 있습니다. LS 컬럼이 적절하게 준비되었는지 확인합니다(재료 표).

  1. 비장과 림프절(서혜부, 상완부, 축방향 및 경추)을 마우스(여기에 사용된 WT C57BL/6J 마우스)에서 분리합니다.
  2. 처리된 각 조직에 대해 5mL의 완전한 RPMI(Table of Materials)와 함께 70μm 스크린을 60mm 접시에 놓습니다. 림프절과 비장을 다른 접시에 넣어 처리하여 수율을 높입니다. 3mL 주사기의 플런저를 사용하여 필터를 통해 조직을 부드럽게 분쇄합니다. 필터를 1-3mL의 배지로 헹구고 단일 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.
  3. 필요에 따라 추가 림프절과 비장 조직에 대해 2.2단계를 반복합니다.
  4. 단일 셀 현탁액을 500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하십시오.
  5. 다음과 같이 셀 수를 세울 준비를 합니다.
    1. 비장 샘플의 경우, 상층액을 흡인하고, 1mL의 ACK 용해 완충액에 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁하고, RT에서 2-5분 동안 배양한 다음, 2mL의 완전한 RPMI를 추가하고, 스핀다운하고, 5mL의 완전한 RPMI로 재현탁하고, 세포를 계수합니다.
    2. 림프절 세포의 경우, 상층액을 흡인하고, 5mL의 새로운 완전 RPMI에 세포 펠릿을 재현탁하고, 세포를 계수합니다.
  6. naive CD4 isolation kit에 입력하려면 비장세포를 림프절 세포와 혼합하여 분리를 위해 원하는 세포 수에 도달합니다.
    참고: 일반적으로 WT-B6 마우스의 림프절과 비장 세포 × 1개는 2-8 × 106개의 순진한 CD4 T 세포를 생성합니다.
  7. 풀링된 비장 및 림프절 세포를 500 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 제조업체의 프로토콜(naive CD4 T cell isolation kit)에 표시된 대로 적절한 양의 MACS 완충액(Table of Materials)에서 세포 펠렛을 재현탁합니다.
  8. Naive CD4+ T Cell Biotin Antibody Cocktail, Anti-Biotin Microbeads 및 CD44 Microbeads를 사용하여 negative selection(Table of Materials)으로 naive CD4 T cell을 분리하기 위한 제조업체의 프로토콜을 정확하게 따릅니다. 이 분리를 위해 LS 컬럼을 사용하고 15mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다.
  9. 분리 후 500 × g 에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 완전한 RPMI 배지 2mL에 재현탁하고, 세포를 계수합니다.
  10. 핵 절제를 시작할 준비가 될 때까지 세포를 4°C에서 보관합니다.

3. Cas9-gRNA 복합체 형성

참고: negative control 및 유전자 특이적 crRNA stock을 준비합니다. 음성 대조군 조건에 대해 하나의 고유한 crRNA를 사용하고 유전자 표적화 조건에 대해 세 개의 고유한 crRNA를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다. 3개의 서로 다른 crRNA를 동시에 사용하면 관심 유전자의 KO를 보장할 수 있습니다.

  1. 듀플렉스 버퍼를 사용하여 crRNA 및 tracrRNA를 100μM 스톡 농도로 재현탁합니다(Table of Materials). 이는 RNA 1nmol당 10μL의 완충액에 해당합니다.
  2. 멸균 PCR 튜브에서 개별 crRNA를 tracrRNA와 1:1 비율로 결합하고 피펫팅으로 혼합합니다. 열순환기에서 95분 동안 5°C로 가열합니다. 그런 다음 단지를 최소 10분 동안 벤치탑에서 RT로 식히십시오.
    참고: crRNA/tracrRNA duplexes 는 이 시점부터 gRNA라고 합니다. 단지는 -20 °C에서 보관하는 경우 최소 6 개월 동안 안정적입니다. 일반적으로 실행당 6 μL의 gRNA(3 μL crRNA + 3 μL tracrRNA)를 만들어 약 5개의 샘플(1 μL/샘플)에 충분한 물질을 제공합니다.
  3. 유전자 표적화 gRNA의 경우: 멸균 PCR 튜브에 3 μL의 gRNA(타겟당 3개의 고유한 gRNA 각각 1 μL), 1 μL의 Cas9 단백질 및 1 μL의 듀플렉스 버퍼(샘플당 총 5 μL)를 추가합니다. 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합하고 모든 재료가 튜브 바닥에 있는지 확인합니다. 상온에서 10분 동안 배양합니다. 이 단계의 타이밍을 핵 절제와 동기화합니다(단계 4.1-4.2).
  4. negative control gRNA의 경우: 멸균 PCR 튜브에 gRNA 1 μL, Cas9 단백질 1 μL, Duplex buffer 3 μL를 추가합니다(샘플당 총 5 μL). 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합하고 모든 재료가 튜브 바닥에 있는지 확인합니다. 상온에서 10분 동안 배양합니다. 다시 말하지만, 이 단계의 타이밍을 핵 절제와 동기화합니다(단계 4.1-4.2).
    참고: negative control을 위해 50 pmol의 gRNA를 사용하는 것이 (테스트의 경우 3 x 50 pmol과 비교) 더 비용 효율적이며 결과에 영향을 미치지 않습니다.

4. Nucleofection - Cas9-gRNA 매개 유전자 절제

  1. 원심분리기 1-8 × 106 개의 정제된 T 세포를 500 × g 에서 5분 동안, 핵 추출 샘플당 4°C. 가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 제거하십시오.
  2. 20 μL의 P3 완충액(샘플당 16.4 μL의 P3 + 3.6 μL의 보충제; Nucleofector Kit, Table of Materials)를 삽입하고 현탁액을 Cas9-gRNA 복합체를 포함하는 PCR 튜브로 옮깁니다. 16-well nucleocuvette의 독립적인 well로 혼합 및 이동(Nucleofector Kit, Table of Materials). 세포를 큐벳으로 옮길 때 기포가 형성되지 않았는지 확인하면 핵 절단 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 큐벳을 작업 표면에 대고 두드려 모든 재료가 각 웰의 바닥에 있고 기포가 없는지 확인합니다.
  3. 참조된 핵세포의 DN100 프로그램을 사용하여 핵 절제를 수행합니다(재료 표). 125μL의 예열된 완전 IMDM 배지를 뉴클레오큐벳 웰에 즉시 추가하고 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 모든 세포가 수집되도록 125μL의 예열된 배지로 각 웰을 한 번 더 헹굽니다.
  4. 500 × g 에서 5분, 4°C 동안 세포를 원심분리하고 모든 배지를 제거한 다음 200μL의 가열된 완전한 IMDM 배지 + 5ng/mL IL-7(재료 표)에 재현탁합니다.
  5. 세포 200μL를 배양 플레이트로 옮기고 예온된 완전 IMDM 배지 + 5ng/mL IL-7을 추가하여 플레이트 크기에 따라 원하는 최종 부피를 만듭니다: 48웰 플레이트(웰당 배지 1mL)에서 웰당 1-2 × 106 개 셀, 24웰 플레이트(웰당 배지 1.5mL) 부피에서 웰당 2-4 × 106 개 세포, 12웰 플레이트(웰당 2mL의 배지)에서 웰당 4-6 ×10 6 개 세포, 6웰 플레이트(웰당 4mL의 배지)에서 웰당 6-10 ×10 6 개 세포. 인큐베이터에서 37°C, 5% CO2 에서 3일 동안 세포를 배양합니다.
    참고: 단백질의 회전율 및 다운스트림 분석에 따라 이 배양 기간을 최적화합니다. 최적의 휴식기간은 3일이지만, 이러한 조건을 이용하여 표적 유전자에 따라 1일에서 7일 사이로 조정할 수 있습니다.
  6. 완전한 IMDM 배지 + 5ng/mL IL-7에서 배양한 후 피펫팅으로 세포를 재현탁하고 15mL 원뿔형 튜브로 수확합니다. 500 × g 에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 완전한 RPMI 배지 1mL에 재현탁합니다.
  7. 세포를 계수하여 관심 있는 gRNA-nucleofected 세포에 해당하는 살아있는 naive CD4 T 세포의 수를 결정합니다.
    참고: nucleofection의 과정에서, 이 프로토콜이 진행되는 동안 입력 세포의 ~ 50%가 손실될 것으로 예상하고 그에 따라 사용되는 naive CD4 T cell의 수를 조정하십시오. 또한 이 시점에서 다양한 기술(유세포 분석, 웨스턴 블롯, qPCR 또는 T7EI 분석)을 사용하여 naive CD4 T 세포에서 유전자 표적화의 효율성을 테스트할 수 있습니다.

5. 항원제시세포(APC) 분리

참고: 분리 후 APC를 치료하는 데 사용될 미토마이신 시약이 준비되었는지 확인하십시오(재료 표). 시작하기 전에 제조업체의 anti-FITC microbead 프로토콜을 읽고 LS 컬럼이 적절하게 준비되었는지 확인하십시오(Table of Materials).

  1. APC 분리를 위해 지정된 WT 마우스에서 비장을 분리합니다.
  2. ACK 용해 완충액으로 상술한 바와 같이(2.2, 2.5.1) 적혈구를 용해시키고, 세포 펠렛을 완전한 RPMI(4°C)의 5mL에 재현탁탁하고, 세포를 계수합니다.
    참고: APC 분리 후 입력 세포 수의 약 절반을 얻을 것으로 예상합니다(예: 1 × 108 입력 비장 세포는 ~40-50 × 106 APC를 생성합니다. 분리를 위해 원하는 수의 비장세포를 준비합니다.
  3. 500 × g 에서 5분, 4 °C 동안 세포를 원심분리하고 세포 펠릿을 800 μL의 MACS 완충액에 재현탁합니다(재료 표).
  4. 비장세포에 FITC-conjugated anti-CD4 및 anti-CD8 항체(Table of Materials)를 각각 4μL씩 추가합니다. 잘 섞어 4°C에서 15분 동안 배양합니다.
  5. 500 × g 에서 5분, 4°C 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 제조업체의 지침에 따라 권장량의 MACS buffer에서 세포를 재현탁하고 적절한 양의 anti-FITC microbeads를 추가합니다(Table of Materials).
  6. 4°C에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 세포를 원심 분리하십시오. 500μL의 MACS 완충액에 세포를 재현탁하고 제조업체의 프로토콜에 설명된 대로 준비된 LS 컬럼에 세포를 통과시켜 15mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다.
  7. 600 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 2.7mL의 멸균 1x PBS에 세포를 재현탁합니다.
    참고: APC는 펠릿이 잘 되지 않을 수 있습니다. 원심분리에 더 빠른 속도를 사용하십시오.
  8. 300μL의 미토마이신 C 용액을 세포에 첨가하여 최종 농도를 50μg/mL로 만듭니다. 잘 섞어 37 °C의 수조에서 30 분 동안 또는 37 ° C에서 45 분 동안 인큐베이터에서 5 % CO2 배양합니다.
  9. 배양 후 600 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 10mL의 멸균 1x PBS로 세척합니다. 진공을 사용하여 가능한 한 많은 상층액을 제거하십시오. 세척을 2회 반복합니다.
  10. 600 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 세포를 다시 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 세포 펠릿을 5mL의 완전한 RPMI 배지(4°C)에 재현탁합니다. 세포를 세십시오. CD4 T 세포 분화를 수행할 준비가 될 때까지 APC를 4°C에서 보관합니다.

6. CD4 T 세포 분화

참고: 이 프로토콜은 웰당 48-well plate 형식-2 ×10 5 naive CD4 + 1 × 106 APC로 세포를 배양하도록 설정됩니다. 세포는 완전한 IMDM 배지에서 배양됩니다. 여기에서는 Th1, Th2, Th17 및 Treg CD4 T 세포의 분화를 위한 조건을 제공합니다. 다만, 사용자의 관심에 따라 개별 계보 조건이 선택될 수 있습니다.

  1. 사용할 48웰 플레이트의 세포 수를 결정하고 각 세포 유형에 필요한 세포 수를 계산합니다.
    참고: 예를 들어, 10개의 웰은 1:5 비율을 유지하기 위해 2 × 106 나이브 CD4 및 10 ×10 6 APC가 필요합니다. 셀 수가 허용하는 경우, 도금 시 파이펫팅 오류를 설명하기 위해 하나의 추가 웰에 충분한 셀을 계산하십시오.
  2. 원하는 수의 naive CD4 및 APC를 1:5로 혼합하고, 600 × g 에서 4°C에서 5분 동안 세포를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 웰당 500μL의 완전한 IMDM 배지(예: 5mL의 배지 중 10웰에 해당하는 세포)에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
  3. 500μL 단위의 세포를 48웰 플레이트의 웰로 플레이트화하여 각 웰에 2 × 105 나이브 CD4 + 1 × 106 APC가 포함되도록 합니다.
  4. 원하는 CD4 T 세포 분화 조건을 위해 표 1에 설명된 대로 완전한 IMDM에서 2x 사이토카인 + 항체 혼합물을 준비합니다. 이전에 도금된 500μL 단위의 세포에 500μL의 2x 혼합물을 추가하여 시약의 최종 농도를 1x로 만듭니다.
    참고: 이 예시는 각 조건에 대해 5개의 웰에 충분한 2.5mL의 2x 제제를 만드는 것을 기반으로 합니다. 다시 말하지만, 시약의 양이 허락하는 경우, 파이펫팅 오류를 설명하기 위해 2x mix를 한 번 더 증가시킵니다.
  5. 500 μL의 CD4/APC 세포 함유 웰에 500 μL의 2x 사이토카인 + 항체 배지를 추가하여 1x에서 시약의 최종 농도를 만듭니다.
  6. 48웰 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 5% CO2와 함께 놓습니다. CD4 분극이 완료될 수 있도록 72시간 동안 세포를 배양합니다.
    참고: 강력한 성장을 보장하기 위해 배양 기간 후에 플레이트를 검사하십시오. 배지는 배양 후 주황색이어야 하며 노란색 배지는 잠재적인 세포 과증식을 나타냅니다.

7. CD4 T 세포 분화에서 유전자 절제의 영향 평가

참고: 모든 염색 단계에서 필요한 염색 완충액에 적절한 희석액으로 첨가된 항체의 마스터 믹스를 준비합니다. 샘플당 50μL 부피의 항체/완충액 칵테일이 사용됩니다. 실험에 따라 사용되는 특정 항체를 조정합니다. 사용자는 특정 실험과 관련된 항체 패널을 선택해야 합니다. 여기에서 우리는 여기에서 표적이 되는 유전자의 맥락에서 이에 접근할 수 있는 템플릿을 제공합니다.

  1. CD4 분화 후 600μL의 상층액을 조심스럽게 제거한 다음 피펫팅으로 각 웰의 세포를 재현탁합니다.
  2. 각 웰에서 세포 200μL를 제거하고 전사 인자 염색을 위해 라벨링된 96웰 플레이트에 추가합니다. 4°C에서 5 분 동안 500×g으로 회전하여 샘플을 펠렛화하고 상층액을 튕겨낸 다음 표면 염색을 진행합니다(7.5단계).
  3. 사이토카인 분석을 위해 나머지 200μL의 세포를 PMA(50ng/mL), 아이오노마이신(500ng/mL) 및 골지정지(1/2,000 희석)로 완전한 IMDM으로 재복원합니다. 2x 복원 혼합물 200 μL를 각 웰에 추가하고 37 °C, 5% CO2 에서 4시간 동안 배양합니다.
    참고: 48웰 플레이트에 200μL가 남아 있어야 합니다. 따라서 PMA(2x, 100ng/mL), 아이오노마이신(2x, 1μg/mL) 및 골지정지(2x, 1/1,000)의 2x 혼합물 중 200μL를 추가하면 1x의 최종 농도가 생성됩니다(재료 표).
  4. 그 동안 전사 인자 염색을 시작하십시오. 샘플당 원하는 형광 접합 항체를 포함하는 50μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁하여 표면 항원 염색을 수행합니다(표 2). 4 °C의 어둠 속에서 30 분 동안 배양하십시오.
  5. 각 웰에 150μL의 FACS 완충액을 추가하여 염색 완충액을 씻어냅니다. 플레이트를 500 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 튕겨냅니다. 총 두 번 세탁을 반복합니다.
  6. 100μL의 Foxp3 고정 용액(재료 표)으로 암흑 실온에서 25분 동안 세포를 고정합니다.
  7. 25분 후 각 웰에 100μL의 FACS 완충액을 첨가하여 정착제를 씻어냅니다. 플레이트를 500 × g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 튕겨냅니다. 총 두 번 세탁을 반복합니다.
  8. 어두운 곳에서 4°C에서 최소 1시간 동안 샘플당 직접 접합된 전사 인자 특이적 항체를 포함하는 50μL의 1x Foxp3 투과화 완충액(표 2)에 세포를 재현탁하여 세포 내 염색을 수행합니다.
  9. 세포 내 염색이 완료된 후 각 웰에 100μL의 FACS 완충액을 추가합니다. 플레이트를 500 × g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 튕겨냅니다. 총 두 번 세탁을 반복합니다. 유세포 분석을 위해 최종 부피 200 mL로 세포를 재현탁합니다.
  10. PMA/ionomycin/Golgi Stop restimulation 후 피펫팅으로 세포를 재현탁시키고 각 사이토카인 샘플 400μL를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 펠렛 화하고 상층액을 제거합니다. 세포 샘플을 100μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 표면 염색을 위해 96웰 플레이트로 옮깁니다. 500 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 회전하여 샘플을 다시 펠렛 화하고 상층액을 튕겨냅니다.
  11. 표면 항원에 대한 형광 항체를 함유한 FACS 완충액으로 표면 염색 칵테일을 준비합니다(표 2). 샘플당 50μL의 염색 완충액에 세포를 재현탁하고 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
  12. 각 웰에 150μL의 FACS 완충액을 추가하여 염색 완충액을 씻어냅니다. 플레이트를 500 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 튕겨냅니다. 총 두 번 세탁을 반복합니다.
  13. 100μL의 4% PFA(Table of Materials)에 있는 셀을 실온 상태에서 25분 동안 암흑 속에서 고정합니다.
  14. 각 웰에 100μL의 FACS 완충액을 추가하여 정착제를 씻어냅니다. 플레이트를 500 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 튕겨냅니다. 총 두 번 세탁을 반복합니다.
  15. 검체당 0.5% Triton X-100 염색 완충액을 함유한 항사이토카인 항체 50μL에 세포를 재현탁하여 세포 내 사이토카인 염색을 수행합니다(표 2).
  16. 세포 내 염색이 완료된 후 각 웰에 100μL의 FACS 완충액을 추가합니다. 플레이트를 500 × g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하고 상층액을 튕겨냅니다. 총 두 번 세탁을 반복합니다. 유세포 분석을 위해 최종 부피 200 mL로 세포를 재현탁합니다.
  17. 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 transcription factor와 사이토카인 염색 시료를 분석합니다.
    참고: 요약된 염색 패널에서 예상되는 유세포 분석 프로필이 대표 결과 섹션에 표시됩니다.

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결과

당사의 프로토콜(섹션 2)을 사용하여 순수 CD4 T 세포 집단을 얻었는지 확인하기 위해 유세포 분석을 사용하여 자기 분리 전후에 이러한 세포를 식별했습니다. 우리의 접근 방식을 사용하여 분리 후 살아있는 CD4+TCRb+CD25-CD44-CD62L+ naive CD4 T 세포의 매우 순수한 집단을 얻었습니다(그림 3A). 또한, Cas9-gRNA 복합체가 naive CD4 T 세포(섹션 4)에 성공적으로 핵 형성되었음을 확인하기 위해 대조 세포와 Cas9-gRNA 처리 세포에 대한 유세포 분석을 수행하고 이 프로토콜에 사용된 tracrRNA에 부착된 염료인 Atto550의 형광을 조사했습니다(그림 3B). 우리는 대조군에 비해 핵 절제된 세포에서 Cas9-gRNA ...

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토론

CRISPR-Cas9 복합체를 미접촉 CD4 T 세포에 전달하기 위한 프로토콜과 CD4 T 세포 분화 연구 방법을 통합하면 CD4 T 세포 생물학을 조절하는 새로운 유전자를 탐색할 수 있는 강력한 도구를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 작업하기 쉬운 상업적으로 이용 가능한 Cas9 및 gRNA 시약을 활용하기 위한 포괄적인 가이드를 제공합니다. Cas9-gRNA 복합체를 naive CD4 T 세포로 nucleofection-mediated delivery는 매우 효율적인 유전자 편집을 제공하여 관심 유전자의 거의 완전한 knockout을 용이하게 합니다. 또한 in vitro polarized CD4 T cell의 유세포 분석을 통해 계통 분화를 종합적으로 검사할 수 있을 뿐만 아니라 CRISPR 매개 유전자 절제를 검증할 수 있는 편리한 도구를 사용할 수 있습니다.

여기에서는 시험관 내...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NIAID, NIH의 교내 연구 프로그램의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 M EDTA, pH = 8.0IPM Scientific11005-016
16% 파라포름알데히드, PFA전자 현미경 과학15710PBS로 희석하여 4% PFA 고착 용액
만들기 1x eBioscience 완충액 (1x 투과화 완충액)Thermo Fisher Scientific00-5523-00키트의 투과화 완충액을 사용하여 1x 용액
만들기 1x PBS, pH = 7.4품질 생물학114-058-101
2-메르캅토에탄올 (1000x)Gibco21985-023
4D 핵작용기 코어 유닛LonzaAAF-1003B
4D 핵작용기 X 유닛LonzaAAF-1003X
60 mm 접시Falcon353002
70 µ m 나일론 메시 스트레이너Fisherbrand22363548
ACK 용해 버퍼GibcoA10492-01
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032이 키트에는 다음이 포함됩니다: P3 Primary Cell Solution, Supplement 1, and 16-well nucleocuvette strip
anti-FITC microbeadsMiltenyi Biotec130-048-701Miltenyi Anti-FITC Microbeads Protocol Follow Miltenyi Anti-FITC Microbeads Protocol
안티-마우스 CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1원료 농도
안티-마우스 CD3e (145-2C11)-bioXcellBE0001-1에 대해서는 표 1 참조
; (XMG1.2)bioXcellBE0055원료 농도에 대해서는 표 1 참조
안티 마우스 IL-12p40 (C17.8),bioXcellBE0051원료 농도는 표 1 참조
항 마우스 IL-4 (11B11),bioXcellBE0045원료 농도는 표 1 참조
BioLite, 48-well Mutlidish, Thermo Fisher Scientific,
소 혈청, 알부민, BSA,Sigma Life ScienceA3059
Cas9 효소IDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 (10mg/mL) - 핵 국소화 서열
포함 완전한 IMDM + IL-7 배지5 ng/mL IL-7
완전한 IMDM 배지IMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% Pen/Strep, 0.1% BME
완전한 RPMI 배지RPMI-1640, 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 펜/스트렙, 0.1% BME
CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
원하는 crRNAs IDT 웹 사이트에서 사전 설계된 IDT
eBioscience FOXP3/Transcription Factor 염색 완충액 세트Thermo Fisher Scientific00-5523-00이 키트에는 고정/투과화 농축액(4x), 고정/투과화 희석액 및 투과화 완충액(10x)
FACS 완충액1x PBS, 1% FBS, 1mM EDTA
소 태아 혈청(FBS)VWR Seradigm Life Science97068-085사용 전에 열을 비활성화하십시오 (56°C로 따뜻하게; C 45 분 동안)
FITC 안티 마우스 CD4 (RM4-5)Biolegend1005101/200 희석 (0.5 mg / mL 스톡 농도)
FITC 안티 마우스 CD8 α (53-6.7)Biolegend1007061/200 희석(0.5 mg/mL 원료 농도)
Golgi StopBD Biosciences51-2092KZ1/2000 희석
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
Streptomyces conglobatus의 아이오노마이신 칼슘 염 (1 mg/mL)Sigma Aldrich10634권장 최종 농도 500 ng/mL
L-글루타민 200 mM (100x)Gibco25030-081
LS 컬럼Miltenyi Biotec130-042-401
MACS 버퍼1x PBS, 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 필터 멸균
Mitomycin C (0.5 mg/mL)Millipore SigmaM4287-2MG 
마우스 Naï ve CD4 T 세포 분리 키트Miltenyi Biotec130-104-453Miltenyi Naï을 따르십시오. CD4 T 세포 분리 프로토콜. 이 키트에는 Naï ve CD4+ T 세포 비오틴 항체 칵테일, 안티 비오틴 마이크로비즈 및 CD44 마이크로비즈
음성 대조군 crRNAIDT1072544자체음성 대조군 설계의 대안
뉴클레아제 무료 이중 버퍼IDT1072570
PCR 튜브 스트립USA Scientific1402-2700
페니실린 스트렙토마이신Gibco15140-023
Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA (100 µ g/mL)SigmaAldrichP8139권장 최종 농도 50ng/mL
ProSeries 고성능 15mL 원심분리기 튜브Alkali ScientificPS560015mL 원추형 튜브
재조합 인간 (h) IL-2Peprotech200-02재고 농도는 표 1 참조
재조합 인간 TGF-b1 (HEK293 파생)Peprotech100-21재고는 표 1 참조 농축
재조합 뮤린 IL-12p70Peprotech210-12
재조합 뮤린 IL-4Peprotech214-14
재조합 뮤린 IL-6Peprotech216-16
재조합 뮤린 IL-7Peprotech217-17100 ng/mL에서 준비
RPMI 1640 미디어Gibco21870-076
열 순환기응용 바이오시스템4375786우리는 이 열순환기 모델을 사용하지만, 이 프로토콜에서는 유사한 장비가 잘 작동할 것입니다
tracrRNA Atto550 라벨링;IDT1075928Atto550 형광을 판독으로 사용하여 nuceloefection 후 Cas9-gRNA 복합체를 검출할 수 있습니다. 가능하다면 이 시약을 권장합니다. 
Triton-X 완충액1x PBS, 0.5% TritonX-100, 0.1% BSA
TritonX-100BioRad161-0407
표지되지 않은 tracrRNA IDT1072534보다 비용 효율적인 tracrRNA 옵션이지만 Cas9-gRNA 복합체의 nucelofection 효율 평가를 허용하지 않습니다.
Veriti Thermal Cycler, 96-well FastThermo Fisher Scientific4375305우리는 이 thermocycler 모델을 사용하지만 유사한 장비가 이 프로토콜에서 잘 작동합니다
은 원료 농도 안티-마우스 IFN&gamma는 , , , , : 130187 사용 : https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  는 스톡 농도 에 대해서는 표 1 참조, 는 스톡 농도 에 대해서는 표 1 참조, , 스톡 농도 에 대해서는 표 1 참조, , . .

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