CRISPR-Cas9 리보핵단백질(Ribonucleoprotein) 복합체 매개 유전자 절제를 이용한 쥐 CD4 T 세포 분화 조사

요약

CD4 T 세포 분화에서 유전자 기능을 조사하기 위해 쥐 미나 CD4 T 세포에서 CRISPR-Cas9 리보핵단백질 복합체 매개 유전자 절제를 사용하는 적응력이 뛰어난 접근 방식을 간략하게 설명합니다.

초록

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)-Cas9 기술의 광범위한 접근성으로 인해 일차 세포의 유전자 표적화는 T 세포의 유전자 기능을 평가하기 위한 일상적인 방법이 되었습니다. 녹아웃(KO) 마우스 균주의 비용과 제한된 가용성을 감안할 때, 유전자 표적 동물 모델을 사용하여 T 세포의 유전자 기능과 관련된 예비 가설을 테스트하는 것은 불가능할 수 있습니다. 그러나 연구자들은 사전 설계된 가이드 RNA(gRNA)를 포함하여 상업적으로 이용 가능한 리소스를 사용하여 T 세포 활성화 및 분화 연구에 사용할 수 있는 유전자 표적 미접촉 T 세포를 편리하게 생성할 수 있습니다.

여기에서는 nucleofection-delivered CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes(RNP)를 사용하여 in vitro에서 CD4 T 세포 분화에서 유전자 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 유전자 KO murine naive CD4 T cell을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 간략하게 설명합니다. 마우스 2차 림프 기관에서 naive CD4 T cell을 분리한 후 Cas9-gRNA complexes를 이용한 nucleofection은 downstream T cell 활성화 전에 gene KO가 시작되도록 보장하며, 일반적으로 T cell의 사전 활성화를 필요로 하는 retroviral-mediated gRNA delivery에 비해 전략적인 이점을 제공하여 naive T cell의 효과를 평가하지 않습니다. 또한, 이 뉴클레오펙션 기반 방법은 유전자 KO 동물과 관련된 잠재적인 발달 문제를 우회합니다.

Cas9-gRNA 전달 후 in vitro polarization을 사용하여 CD4 T 세포를 Th1, Th2, Th17 및 Treg 계통으로 분화하는 방법을 연구하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 이 프로토콜은 다른 체 외 T 세포 활성화 연구 및 생체 내 채택 전달 연구를 포함한 수많은 다운스트림 응용 분야에 유전자 표적 CD4 또는 CD8 T 세포를 사용하는 데 적용할 수 있습니다. CRISPR-Cas9 방법의 사용은 T 세포의 유전자 기능을 평가하는 능력을 간소화하고 많은 관심 유전자의 일상적인 KO를 가능하게 하여 연구자들이 유전자 KO 동물 연구와 관련된 한계에서 벗어날 수 있도록 했습니다.

서론

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) 기반 기술의 사용은 게놈 DNA 염기서열을 조작하는 능력을 변화시켜 수많은 생물학적 시스템에서 유전자 기능을 연구하는 능력을 크게 향상시켰습니다. CD4 T 세포와 관련하여 CRISPR-Cas9 리보핵단백질(RNP) 복합체를 활용하는 방법이 등장하여 시험관 내 및 생체 내 연구에 사용할 수 있는 1차 비진 T 세포에서 효율적인 유전자 녹아웃(KO)을 촉진합니다 1,2,3,4. CD4 T 세포 분화를 조절하는 것으로 추정되는 새로운 유전자의 확인은 종종 전사체 및 후성유전체 분석에 의해 주도되며, 특히 유전자가 여러 조직에 영향을 미치고 조건부 유전자 표적 마우스를 사용하여 평가해야 할 경우 조사할 자원이 적거나 얻기 어려운 새로운 표적을 생성합니다. gRNA ^5,6<....

프로토콜

여기에 설명된 모든 절차에는 야생형(WT) C57/BL6J 마우스를 사용했습니다. 마우스는 NIAID(프로토콜 LISB-22E) 및 NIH의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Welfare Assurance #A-4149-01)의 지침에 따라 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 유지 및 처리되었습니다.

1. 시작하기 전에 고려해야 할 사항

1. gRNA 시약 선택
   참고: 이 프로토콜에 사용된 마우스 게놈을 표적으로 하는 사전 설계된 gRNA 시약을 얻으려면 재료 표를 참조하십시오.
   1. 관심 유전자(Table of Materials, Desired crRNAs)를 검색하고 사전 설계된 crRNA 상위 3개(2 nmol format)를 선택합니다. 또한 병렬로 사용할 음성 대조군 crRNA를 얻습니다(Table of Materials).
      참고: 기능적 gRNA를 형성하려면 crRNA를 tracrRNA와 이중화해야 합니다. tracrRNA 시약을 얻고 섹션 3의 단계를 따릅니다.
   2. 맞춤형 타겟 gRNA ....

결과

당사의 프로토콜(섹션 2)을 사용하여 순수 CD4 T 세포 집단을 얻었는지 확인하기 위해 유세포 분석을 사용하여 자기 분리 전후에 이러한 세포를 식별했습니다. 우리의 접근 방식을 사용하여 분리 후 살아있는 CD4⁺TCRb⁺CD25-CD44-CD62L⁺ naive CD4 T 세포의 매우 순수한 집단을 얻었습니다(그림 3A). 또한, Cas9-gRNA 복합체가 naive CD4 T 세포(섹션 4)에 성공적으로 핵 형성되었음을 확인하기 위해 대조 세포와 Cas9-gRNA 처리 세포에 대한 유세포 분석을 수행하고 이 프로토콜에 사용된 tracrRNA에 부착된 염료인 Atto550의 형광을 조사했습니다(그림 3B). 우리는 대조군에 비해 핵 절제된 세포에서 Cas9-gRNA .......

토론

CRISPR-Cas9 복합체를 미접촉 CD4 T 세포에 전달하기 위한 프로토콜과 CD4 T 세포 분화 연구 방법을 통합하면 CD4 T 세포 생물학을 조절하는 새로운 유전자를 탐색할 수 있는 강력한 도구를 얻을 수 있습니다. 여기에서는 작업하기 쉬운 상업적으로 이용 가능한 Cas9 및 gRNA 시약을 활용하기 위한 포괄적인 가이드를 제공합니다. Cas9-gRNA 복합체를 naive CD4 T 세포로 nucleofection-mediated delivery는 매우 효율적인 유전자 편집을 제공하여 관심 유전자의 거의 완전한 knockout을 용이하게 합니다. 또한 in vitro polarized CD4 T cell의 유세포 분석을 통해 계통 분화를 종합적으로 검사할 수 있을 뿐만 아니라 CRISPR 매개 유전자 절제를 검증할 수 있는 편리한 도구를 사용할 수 있습니다.

여기에서는 시험관 내.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5 M EDTA, pH = 8.0	IPM Scientific	11005-016
16% 파라포름알데히드, PFA	전자 현미경 과학	15710	PBS로 희석하여 4% PFA 고착 용액
만들기 1x eBioscience 완충액 (1x 투과화 완충액)	Thermo Fisher Scientific	00-5523-00	키트의 투과화 완충액을 사용하여 1x 용액
만들기 1x PBS, pH = 7.4	품질 생물학	114-058-101
2-메르캅토에탄올 (1000x)	Gibco	21985-023
4D 핵작용기 코어 유닛	Lonza	AAF-1003B
4D 핵작용기 X 유닛	Lonza	AAF-1003X
60 mm 접시	Falcon	353002
70 µ m 나일론 메시 스트레이너	Fisherbrand	22363548
ACK 용해 버퍼	Gibco	A10492-01
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit	Lonza	V4XP-3032	이 키트에는 다음이 포함됩니다: P3 Primary Cell Solution, Supplement 1, and 16-well nucleocuvette strip
anti-FITC microbeads	Miltenyi Biotec	130-048-701	Miltenyi Anti-FITC Microbeads Protocol Follow Miltenyi Anti-FITC Microbeads Protocol
안티-마우스 CD28 (37.51)	bioXcell	BE0015-1	원료 농도
안티-마우스 CD3e (145-2C11)	-bioXcell	BE0001-1	에 대해서는 표 1 참조
; (XMG1.2)	bioXcell	BE0055	원료 농도에 대해서는 표 1 참조
안티 마우스 IL-12p40 (C17.8),	bioXcell	BE0051	원료 농도는 표 1 참조
항 마우스 IL-4 (11B11),	bioXcell	BE0045	원료 농도는 표 1 참조
BioLite, 48-well Mutlidish	, Thermo Fisher Scientific	,
소 혈청, 알부민, BSA,	Sigma Life Science	A3059
Cas9 효소	IDT	1081059	Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 (10mg/mL) - 핵 국소화 서열
포함 완전한 IMDM + IL-7 배지			5 ng/mL IL-7
완전한 IMDM 배지			IMDM+GlutMAX, 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% Pen/Strep, 0.1% BME
완전한 RPMI 배지			RPMI-1640, 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 펜/스트렙, 0.1% BME
CRISPick			https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
원하는 crRNAs	IDT 웹 사이트에서 사전 설계된 IDT
eBioscience FOXP3/Transcription Factor 염색 완충액 세트	Thermo Fisher Scientific	00-5523-00	이 키트에는 고정/투과화 농축액(4x), 고정/투과화 희석액 및 투과화 완충액(10x)
FACS 완충액			1x PBS, 1% FBS, 1mM EDTA
소 태아 혈청(FBS)	VWR Seradigm Life Science	97068-085	사용 전에 열을 비활성화하십시오 (56°C로 따뜻하게; C 45 분 동안)
FITC 안티 마우스 CD4 (RM4-5)	Biolegend	100510	1/200 희석 (0.5 mg / mL 스톡 농도)
FITC 안티 마우스 CD8 α (53-6.7)	Biolegend	100706	1/200 희석(0.5 mg/mL 원료 농도)
Golgi Stop	BD Biosciences	51-2092KZ	1/2000 희석
IMDM (1x) + GlutMAX-1 Media	Gibco	31980-030
Streptomyces conglobatus의 아이오노마이신 칼슘 염 (1 mg/mL)	Sigma Aldrich	10634	권장 최종 농도 500 ng/mL
L-글루타민 200 mM (100x)	Gibco	25030-081
LS 컬럼	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS 버퍼			1x PBS, 0.5% BSA, 1 mM EDTA, 필터 멸균
Mitomycin C (0.5 mg/mL)	Millipore Sigma	M4287-2MG
마우스 Naï ve CD4 T 세포 분리 키트	Miltenyi Biotec	130-104-453	Miltenyi Naï을 따르십시오. CD4 T 세포 분리 프로토콜. 이 키트에는 Naï ve CD4+ T 세포 비오틴 항체 칵테일, 안티 비오틴 마이크로비즈 및 CD44 마이크로비즈
음성 대조군 crRNA	IDT	1072544자체	음성 대조군 설계의 대안
뉴클레아제 무료 이중 버퍼	IDT	1072570
PCR 튜브 스트립	USA Scientific	1402-2700
페니실린 스트렙토마이신	Gibco	15140-023
Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA (100 µ g/mL)Sigma	Aldrich	P8139	권장 최종 농도 50ng/mL
ProSeries 고성능 15mL 원심분리기 튜브	Alkali Scientific	PS5600	15mL 원추형 튜브
재조합 인간 (h) IL-2	Peprotech	200-02	재고 농도는 표 1 참조
재조합 인간 TGF-b1 (HEK293 파생)	Peprotech	100-21	재고는 표 1 참조 농축
재조합 뮤린 IL-12p70	Peprotech	210-12
재조합 뮤린 IL-4	Peprotech	214-14
재조합 뮤린 IL-6	Peprotech	216-16
재조합 뮤린 IL-7	Peprotech	217-17	100 ng/mL에서 준비
RPMI 1640 미디어	Gibco	21870-076
열 순환기	응용 바이오시스템	4375786	우리는 이 열순환기 모델을 사용하지만, 이 프로토콜에서는 유사한 장비가 잘 작동할 것입니다
tracrRNA Atto550 라벨링;	IDT	1075928	Atto550 형광을 판독으로 사용하여 nuceloefection 후 Cas9-gRNA 복합체를 검출할 수 있습니다. 가능하다면 이 시약을 권장합니다.
Triton-X 완충액			1x PBS, 0.5% TritonX-100, 0.1% BSA
TritonX-100	BioRad	161-0407
표지되지 않은 tracrRNA	IDT	1072534	보다 비용 효율적인 tracrRNA 옵션이지만 Cas9-gRNA 복합체의 nucelofection 효율 평가를 허용하지 않습니다.
Veriti Thermal Cycler, 96-well Fast	Thermo Fisher Scientific	4375305	우리는 이 thermocycler 모델을 사용하지만 유사한 장비가 이 프로토콜에서 잘 작동합니다

은 원료 농도 안티-마우스 IFN&gamma는 , , , , : 130187 사용 : https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  는 스톡 농도 에 대해서는 표 1 참조, 는 스톡 농도 에 대해서는 표 1 참조, , 스톡 농도 에 대해서는 표 1 참조, , . .