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방법 논문

여성 Drosophila melanogaster 생식세포 줄기세포 틈새의 확장된 라이브 이미징

1.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67389

⸱

2024년 12월 20일

 ,  , 
1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC/Universidad Pablo de Olavide/JA, 2Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

이 논문에서

요약

여기에서는 초파리 난소 틈새 시장에서 생식세포 줄기세포(GSC)의 비대칭 분열에 대한 실시간 이미징을 수행하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 분광 단백질 Par-1의 녹색 형광 단백질(GFP) 융합을 유비쿼터스하게 발현하는 형질전환 라인을 사용합니다.

초록

라이브 이미징 방법을 사용하면 동적 세포 과정을 실시간으로 자세히 분석할 수 있습니다. 초파리 난소는 시간이 지남에 따라 세포 분열, 줄기성, 분화, 이주, 세포사멸, 자가포식, 세포 접착 등과 같은 수많은 발달 과정의 역학을 탐구할 수 있는 훌륭한 모델입니다. 최근에는 암컷 초파리 GSC 틈새 시장에 대한 확장된 체외 배양 및 라이브 이미징을 구현했습니다. GFP::P ar-1 전이유전자를 보유한 초파리 계통을 예로 들면, 이 방법을 사용하면 GSC의 틈새 내에서 GSC의 비대칭 분열을 시각화하고 세포 주기에 따른 분광 형태의 변화를 설명할 수 있습니다. 여기에서는 Drosophila germaria의 생체 외 배양에 대한 자세한 프로토콜을 제시하여 암컷 GSC 틈새를 장기간 시각화할 수 있습니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 스톡 센터 및/또는 초파리 연구 커뮤니티에서 사용할 수 있는 여러 형광 표지 관심 단백질이 있는 라이브 이미징 GSC에 광범위하게 적용할 수 있다는 것입니다.

서론

생물학적 과정의 실시간 이미징은 직접적인 실험적 증거를 얻는 데 중요한 역할을 합니다. 첨단 컨포칼 현미경 검사법과 방법론 최적화의 결합을 통해 여러 생물학적 사건을 매우 정밀하게 탐색할 수 있습니다. 조직 조작 및 해부, 시료 준비 및 보존, 현미경 수집 설정과 같은 프로토콜의 단계를 최적화하는 것은 얻은 결과의 신뢰성과 견고성을 극대화하는 데 매우 중요합니다. 여기에서는 특히 Drosophila melanogaster 난소에 초점을 맞춘 확장 이미징을 위해 샘플을 모니터링하는 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster ovary는 광범위한 발달 과정의 분석을 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 다른 많은 것들 중에서도 초파리 Drosophila melanogaster의 이 생식 기관에는 매우 잘 정의된 성체 줄기 세포 틈새가 포함되어 있습니다. 이 GSC 틈새 시장은 성인기 동안 여성 배우자의 발달을 유지합니다. 초파리 난소는 약 18개의 난소로 구성되어 있으며, 난실은 게르마리움에서 발달합니다. 각 germarium의 끝에서 2-4 GSC는 주로 8-10 개의 세포의 말단 필라멘트, 5-8 개의 캡 세포의 로제트 및 2-3 개의 전방 에스코트 세포 ( 그림 1A)로 형성된 체세포 틈새에서 유지됩니다. 이 체세포 틈새 시장은 GSC에 줄기를 유지하고 증식을 제어하며 분화를 방지하기 위한 필수 신호와 물리적 지원을 제공합니다1,2,3,4,5.

GSC는 일반적으로 비대칭으로 분열하여 체세포 틈새와 딸세포인 낭세포(cystoblast, CB)와 접촉을 유지하는 새로운 줄기세포를 생성하며, 이 세포는 체세포 캡 세포와의 직접적인 접촉을 잃고 분화합니다. GSC 및 CB는 매우 역동적이고 세포질 소기관인 분광체를 포함하며, 주요 기능은 유사분열 동안 유사분열 방추체의 올바른 방향6입니다. CB는 불완전 사이토카인시스(incomplete cytokinesis)로 4번 분열하여 16세포 낭종을 발생시키며, 생식세포 중 하나는 난모세포로 지정되고 다른 15개 세포는 간호사 세포가 됩니다. CB 분광체는 16개의 세포가 상호 연결된 생식세포 세포를 연결하는 fusome이라고 하는 분지 구조로 성장합니다. 분광체는 serine-threonine kinase Par-1 및 막 구성 요소인 Hu-li tai shao (Hts)7과 같은 작은 소포 및 골격 단백질이 풍부합니다. GSC 세포주기 동안 분광체는 새로운 물질이 추가되어 성장하고 모양이 변경되어 G1, S, G2 및 M 상을 식별 할 수 있습니다 (그림 1B) 8,9.

우리는 최근 최대 16시간 동안 살아있는 GSC를 이미징할 수 있는 Drosophila germarium의 생체 외 배양 방법을 구현했습니다. 이러한 세포는 평균 15.5시간마다 한 번씩 분열하기 때문에8, 이 방법을 사용하면 GSC 세포 주기의 많은 부분을 촬영할 수 있습니다. 따라서 다른 도구와 함께 당사의 배양 방법을 통해 GSC 세포주기 동안 분광체 형태를 설명하고 생체 내에서 다른 세포주기 단계의 지속 시간을 분석 할 수있었습니다 8 ( 그림 1C). 여기에서는 방법론을 설명하는 단계별 안내 비디오에서 지원하는 이 확장된 라이브 이미징 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다(그림 2).

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프로토콜

참고: 1.4단계는 최소 2일 전에 완료해야 합니다. 2.1단계와 2.2단계는 1일 전에 수행할 수 있습니다.

1. 실험 전 설정 I

  1. 스트렙토마이신/페니실린 항생제 혼합물(10,000 U/mL 페니실린 및 10 mg/mL 스트렙토마이신) 100 μL 분취액을 준비하고 사용할 때까지 -20 °C에서 보관합니다.
  2. 오토클레이브 순수를 사용하여 15mL의 용액을 준비하고 4°C에서 보관하고 한 달 이내에 사용하십시오: 중탄산나트륨(NaHCO3) 0.1M pH 8.0 및 0.1% Tween 20.
  3. 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 다음 배양 배지와 용액을 준비합니다. 멸균된 필터 팁과 튜브를 사용하십시오.
    1. 희석되지 않은 소 태아 혈청(FBS) 분취액 2mL를 준비하고 무균 조건에서 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
    2. 15% FBS 및 0.6% 스트렙토마이신/페니실린 항생제 혼합물이 보충된 Schneider의 초파리 배지를 준비합니다. 7mL의 부분 표본을 준비하고 4°C에서 보관합니다. 하나의 부분 표본은 두 개의 MatTek 플레이트에 충분합니다(섹션 2 참조).
      1. Ringer's solution(고압멸균된 순수에 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 35.5 mM Sucrose, 5 mM Hepes, pH 6.9)을 준비합니다. 1mL 부분 표본을 준비하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
  4. GFP(poly Ubiquitin-mGFP6::p ar-1 line)에 융합된 Par-1 단백질을 구성적으로 그리고 유비쿼터스하게 발현하는 1-2일 된 파리를 모아 효모 분말이 보충된 플라이 푸드가 있는 새 튜브에 넣습니다. 해부 전에 인큐베이터에서 25 °C에서 2 일 동안 배양하십시오 .
    참고: 이 단계는 관심 있는 형광 태그가 지정된 기자로 수행할 수 있습니다.

2. 유리 바닥 판 코팅 및 준비

  1. 특정 Cell-Tak 접착제(이하 세포 및 조직 접착제라고 함)를 3mm poly-D-lysine 코팅 플레이트(유리 바닥 접시, 재료 표 참조)의 커버슬립 중앙에 수동으로 펴지 않고 3μL 방울 떨어뜨립니다. 멸균 팁을 사용하십시오.
    참고: 세포 및 조직 접착제는 4°C에서 보관해야 합니다. 두 가지 유전 질환(일반적으로 대조군 및 돌연변이 질환)을 사용한 실험의 경우, 잘 분리된 두 방울의 접착제를 동일한 유리 바닥판에 떨어뜨립니다. 이렇게 하면 두 유전적 배경이 동일한 조건에서 이미지화됩니다.
  2. 그 직후, 0.1M NaHCO3 pH 8.0의 동일한 부피(이 프로토콜 설정에서는 3 μL)를 제조업체에서 권장하는 3 μL 접착제 방울에 조심스럽게 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.
  3. 완전한 증발을 위해 플레이트를 실온(RT)에서 20분 동안 배양한 다음 다음날 사용할 수 있도록 4°C에서 하룻밤 동안 유지합니다. 또는 준비된 플레이트를 37°C에서 완전히 증발할 때까지 25분 동안 배양하고 다음 단계로 바로 진행합니다. 두 경우 모두 덮개가 있는 플레이트를 유지하십시오. 멸균 팁을 사용하십시오.
  4. 준비된 유리 바닥 접시를 사용하기 전에 15-20분 동안 벤치에 놓아 RT에 도달하도록 합니다.
  5. 준비된 접시를 3번 조심스럽게 씻습니다. 접착층을 만지거나 방해하지 마십시오. 각 세척에서 6μL의 오토클레이브 순수를 첨가한 다음 NaHCO3 용액의 잔류물을 제거하기 위해 세 번의 세척 각각에 대해 깨끗한 팁을 사용하여 물을 제거합니다.
  6. 깨끗하고 준비된 플레이트를 RT에 놓고 뚜껑을 덮은 상태에서 5-10분 동안 해부하여 먼지 입자를 방지하여 물이 완전히 증발할 수 있도록 합니다.

3. 초파리 난소 박리 및 난소 분리 및 장착

참고: 난소 박리는 샘플 조직이 접착제에 달라붙는 것을 방해할 수 있는 단백질의 존재를 방지하기 위해 FBS 없이 Ringer's solution(Schneider's medium) 대신 Ringer's solution에서 수행됩니다.

  1. 시작하기 전에 3웰 해부 접시, 집게, 해부 바늘을 70% 에탄올로 세척하십시오.
  2. 3개의 웰 각각에 충분한 부피(~200μL)의 Ringer's solution을 추가합니다.
  3. 표준 절차10,11에 따라 두 쌍의 집게를 사용하여 첫 번째 웰에서 Ringer's 용액 200μL에 있는 효모를 먹인 암컷 5마리의 난소를 절개합니다. 흉부와 복부의 교차점에 있는 초파리 암컷을 집게 중 하나로 잡습니다. 그런 다음 후복부의 큐티클을 부드럽게 찢고 두 개의 난소가 드러날 때까지 복부 큐티클을 당깁니다.
  4. 절개된 난소를 두 번째 웰로 옮겨 해부로 인한 다른 조직의 잔해나 파편으로 인한 오염을 줄입니다.
  5. 발광 다이오드(LED) 조명과 미세한 점겸자가 있는 실체현미경(줌 8X-13.5X)을 사용하여 15-20개의 난소의 근육초를 제거합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 난소 전체를 고정하고 두 번째 집게를 사용하여 후기 단계의 난실을 부드럽게 잡고 근육이 부러지고 뒤처질 때까지 부드럽게 스트레칭합니다.
    참고: 난소의 이 부분과의 접촉을 줄이는 것만으로도 저마리아의 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 8-9단계보다 오래된 난자를 제거합니다.
  6. 겸자를 사용하여 15-20개의 근육초가 없는 난소를 200μL의 Ringer's medium이 들어 있는 세 번째 웰로 하나씩 옮깁니다.
  7. 피펫팅으로 20-200 μL 팁을 0.1% Tween 20으로 미리 적십니다. 이것은 난소가 끝의 플라스틱 벽에 접착되는 것을 방지합니다.
  8. 미리 적신 팁을 사용하여 근육초가 없는 난소를 포함하는 Ringer's 용액 6μL를 준비된 접착판(RT로 유지)으로 옮깁니다.
    알림: 난소 침착(다음 단계) 후 게르마리아 박리를 방지하기 위해 팁과 접착층 사이의 모든 접촉을 피하십시오. 약 30%의 제르마리아가 예상대로 부착되지 않습니다.
  9. 이식된 난소가 접착 표면에 부착되도록 하려면 해부 바늘이나 집게를 사용하여 접착 표면에 닿을 때까지 Ringer의 방울 바닥까지 조심스럽게 누릅니다.
    알림: 일단 난소가 가라앉으면 난소를 재배열하려고 하지 마십시오.
  10. 15% FBS 및 0.6% 스트렙토마이신/페니실린 항생제 혼합물이 보충된 슈나이더 배지 3mL로 MatTek 플레이트를 조심스럽게 채웁니다(1.3단계). 난소가 박리되는 것을 방지하려면 플레이트의 바깥쪽 가장자리 주위에 한 번에 1mL씩 천천히 추가합니다.
  11. 평평한 표면에 근육초가 없는 난소가 들어 있는 플레이트를 현미경 스테이션으로 운반합니다.

4. 컨포칼 현미경을 사용한 라이브 이미징

  1. 스피닝 디스크 현미경 또는 컨포칼 현미경(유사한 장비를 사용할 수 있음)의 63x 대물렌즈에 플레이트를 놓고 샘플의 초점을 맞춥니다. 각 germarium에 대한 중간 z 평면을 선택합니다.
  2. 다음 실험 매개변수를 구성합니다: 캡처 유형: 3D 타임랩스, 70/100의 레이저 출력 조정, 여기 파장: 488nm, z 스택 범위: 30μm 및 Z 스택 간 거리: 1.2μm, 지속 시간: 17시간, 시점 간 간격: 10분마다.
  3. 사용 가능한 경우 다중 위치 옵션을 사용하여 샘플의 XY 좌표를 재정의하고 Z 스택이 이 위치의 중앙에 배치되므로 각 germarium의 중간에 있는 Z 평면을 선택합니다. 획득 시작.
    참고 : germarium의 정상 너비는 30 μm이므로 각 Z 스택은 ~ 25-27 섹션이됩니다. 컨포칼에 따라 10분 간격 내에 최소 25개의 germaria를 이미지화할 수 있습니다. 일반적으로 40x/1.30 NA 또는 63x/1.40 NA 오일 이멀젼, 플라나포 보정 대물렌즈가 사용됩니다.
  4. Imaris 또는 ImageJ(피지) 소프트웨어를 사용하여 시간 및 Z축에서 이미지를 분석하여 spectrosome morphology의 특정 변화를 시각화합니다12,13. 관찰에 대한 특정 시간이 표시됩니다(그림 1B'). 동영상을 마운트하려면 각 시점에서 최상의 Z 평면을 수동으로 선택합니다.

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결과

이 확장된 라이브 이미징 프로토콜을 통해, 우리는 뚜렷한 생물학적 교란 없이 니치 내부에서 암컷 GSC의 비대칭 유사분열을 기록할 수 있습니다. 이를 위해 GFP::Par-1 단백질이 편재적으로 발현되는 생식샘(germaria)을 사용하며, 이 단백질은 GSC 세포 주기 동안 다섯 가지의 뚜렷한 스펙트로솜(spectrosome) 형태인 Round, Plug, Bar, Fusing, 그리고 Exclamation point를 구분해 줍니다(그림 1B,C). 더 자세한 설명으로는, Round-G2 스펙트로솜의 강한 GFP:Par1 신호(그림 1C, 패널 a)가 G2-M-G1 단계 동안 급격히 감소하는 것을 관찰했습니다. 중요한 점은, 이 형질전환 라인을 사용함으로써 GSC의 유사분열 진입을 시각화할 수 있다는 것인데, 이는 초기 전기(prophase) 동안 대부분의 GFP::Par-1이 스펙트로솜을...

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토론

여기에서 우리는 최대 16시간의 장기간 동안 Drosophila melanogaster GSC 틈새를 모니터링하는 프로토콜을 제시합니다. 초파리 생물학적 과정을 생체 외에서 촬영하는 대부분의 프로토콜은 더 짧은 시간 창에 초점을 맞추고 있으며 상상의 날개 디스크(15,16,17), 배아 생식선(18,19) 또는 난소(20,21,22,23)에 대해 여러 예를 찾을 수 있습니다 . 확실히 ...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

원고에 도움이 되는 의견을 제시해 주신 Acaimo González Reyes와 María Olmedo López에게 감사드립니다. 이 연구는 PID2021-125480NB-I00 (H. S-G), Junta de Andalucía (J. G-M)의 "Ayudas a la contratación de personal Investigador Doctor", VI 및 VII PPIT-Seville University (P. R-R)의 "Ayuda a proyectos de investigación precompetitivos" 및 VI PPIT-Seville University (P. R-R)의 "Contrato de Acceso de I+D+i"의 지원을 받았습니다. 원본 출판물(doi:10.1242/DEV.199716)에서 각색된 이미지를 공유할 수 있는 권리를 친절하게 제공한 Company of Biologists Ltd에 감사

를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
9웰 유리판Corning 7220-85n / a
염화칼슘 이수화물시그마 AldrichC3881CaCl2· 2H2O; Ringer의 용액
Cell-TakCorning을 준비하려면 354240세포 및 조직 접착제는 플라스틱, 유리, 금속, FEP 폴리머 및 생물학적 재료를 포함한 다양한 유형의 표면에 세포 또는 조직 절편을 부착하는 데 사용됩니다.
Dumont #5 펜치 파인사이언11252-20n/a
Dumont #55 펜치 파인사이언11255-20크기 0.05 mm x 0.02 mm 및 길이 11 cm
태아 소 세럼Gibco10500-064인증, 열 비활성화, 유럽 승인, 남미 원산지 
유리 바닥 접시MatTekP35GC-1.5-10-C35 mm 접시, No. 1.5 커버슬립, 10 mm 유리 지름,  Poly-D-Lysine 코팅
HEPESSigma AldrichH4034Ringer의 용액
 시그마 알드리치M1028MgCl2; Ringer's 용액을 준비하기
위해 바늘 홀더Roboz RS-6061경량, 중공 스테인리스 스틸 핸들, 4 3/4" 길이.
니콘 SMZ18 쌍안경 니콘https://www.microscope.
healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18
페니실린-스트렙토마이신써모 피셔 사이언티픽1514012210,000 U/mL
염화칼시그마 알드리치P3911KCl; Ringer's solution을 준비하기 위해
Schneider's Drosophila MediumBiowest L0207곤충 세포용 세포 배양 배지
중탄산나트륨시그마 알드리치S8875 NaHCO3; ≥ 99.5 %, 분말
염화나트륨시그마 AldrichS9888NaCl; Ringer의 용액을 준비하기 위해
SucroseSigma AldrichS9378≥ 99.5%(GC); Ringer's solution을 준비하기 위해
텅스텐 해부 바늘Roboz RS-60640.25mm, 초미세, 1미크론 팁(Pk 10)
Tween 20Sigma AldrichP9416분자 생물학, 점성 액체
효모 분말Sigma Aldrich51475n/a
스 스 염화마그네슘을 준비하려면륨

참고문헌

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