만성 상처를 치료하기 위한 상당한 노력에도 불구하고 성공은 제한적이었습니다. 정상적인 치유를 방해하고 만성 상처의 시작 및 발달에 기여하는 세포 및 분자 과정은 잘 알려져 있지 않습니다. 결과적으로 이러한 상처에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 것은 어려운 것으로 판명되었습니다. 이는 주로 인간의 만성 상처를 모방하는 동물 모델이 부족하고 만성 상처가 있는 인간을 대상으로 한 실험이 제한적이기 때문입니다. 이전에 우리는 인간의 당뇨병성 만성 상처와 많은 특성을 공유하는 만성 상처를 연구하기 위해 마우스 모델을 발표했습니다. 이 모델에는 상처에 외부 박테리아를 도입할 필요 없이 피부 미생물군과 환경에서 발견되는 박테리아로부터 자연적으로 형성된 생물막의 존재가 포함됩니다. 따라서 이 모델은 잠재적으로 상처가 어떻게 만성화되는지에 대한 근본적인 이해를 발전시킬 수 있습니다. 여기에서는 이 마우스 모델을 개발하기 위한 원래 프로토콜에 대한 업데이트를 제시합니다. 우리는 생쥐의 사망률을 ~30%에서 ~5%로 줄이는 데 집중했습니다. 또한 차세대 전사체 접근법을 사용하고, 감염 및 생물막 발달 중 박테리아 개체군 역학을 밝히고, 소분자를 포함한 치료의 효능을 테스트하는 가치를 입증함으로써 이 모델이 상처 만성의 시작과 진행을 이해하는 데 어떻게 사용되었는지 설명합니다. 지금까지 이것은 개입 없이는 치유되지 않는 유일한 만성 상처 모델입니다.
이 논문에서
초록
프로토콜
업데이트:
이것은 이전에 제시된 프로토콜에 대한 업데이트입니다1
모든 실험은 연방 규정에 따라 완료되었으며 캘리포니아 대학교 정책 및 절차는 캘리포니아 대학교 리버사이드 IACUC의 승인을 받았습니다.
1. 동물
1.1단계에 다음 참고 사항을 추가합니다.
참고: 동형접합 당뇨병 마우스를 공급업체로부터 직접 구입하는 경우, 정상 피부 세균총으로 피부가 집락화될 수 있도록 기존 사육관에 마우스를 수용하십시오. 남성과 여성 모두 사용할 수 있습니다.
1.3단계 뒤에 다음 섹션을 추가합니다.
1.4.유전형 분석 수행
참고: 1.31단계까지 이전에 설명한 대로 동물을 번식시킨 후 유전자형 분석을 수행합니다. 다음 프로토콜은 이전에 게시된 절차2에서 수정되었습니다. 수컷과 암컷 마우스 모두 젖을 뗄 때 빠르면 14-21일에 유전자형을 분석할 수 있습니다.
1.4.1. 조잡한 DNA 추출
1.4.1.1. 마우스로부터 귀 펀치 생검을 수집하고 조직 샘플을 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
1.4.1.2. 180μL의 50mM NaOH를 첨가하여 시료가 잠기도록 합니다.
1.4.1.3. 샘플을 95°C에서 10분 동안 배양하고 5분마다 튜브를 감압하고 소용돌이치게 합니다.
1.4.1.4. 샘플을 얼음 위에서 최소 1분 동안 식힙니다.
1.4.1.5. pH 8.0 및 소용돌이에서 1M Tris HCl 20μL를 첨가합니다.
1.4.1.6. 샘플을 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
1.4.2. 중합효소 연쇄 반응
1.4.2.1 다음 프라이머 혼합물을 미세 원심분리기 튜브에 조립합니다(프라이머 표).
참고: 프라이머는 LepR의 점 돌연변이 주변 영역을 증폭합니다.
1.4.2.2. PCR 튜브에 20μL의 중합효소 연쇄 반응을 설정합니다. 2x Taq 중합효소 마스터 믹스 10 μL( Taq DNA 중합효소, dNTP, MgCl2 및 KCI 포함), 프라이머 믹스 1 μL( 프라이머 표 참조), 조 DNA 추출물 4 μL 및 H2O 5 μL를 첨가합니다.
1.4.2.3. 열순환 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 94°C에서 2분 동안; 30초 동안 97°C, 45초 동안 52°C, 45초 동안 72°C의 40사이클; 이어서 72°C에서 2분, 10°C에서 무한 유지.
1.4.2.4. PCR이 완료된 후 4μL의 6x DNA 로딩 염료를 PCR 산물에 첨가하고 2% 아가로스 겔에서 분리합니다(그림 1).
참고: 각 PCR 반응은 3개의 PCR 산물(610bp 공통 산물, 406bp 돌연변이 T 대립유전자 산물, 264bp 야생형 G 대립유전자)을 생성합니다. 야생형 유전자형은 610bp와 264bp 산물로 구성되고, 이형접합체 유전자형은 세 가지 산물 모두로 구성되며, db/db 유전자형은 610bp와 406bp 산물로 구성됩니다.
2. 사육관과 축산
2.1단계를 다음 단계 및 참고 사항으로 바꿉.
2.1 db/db 마우스의 피부에 미생물총이 자리를 잡을 수 있도록 기존의 비바리움(장벽/특정 병원균이 없는 시설이 아님)에 db/db 마우스를 수용합니다. 만성 상처로 고통받는 인간을 구체적으로 모델링하기 위해 더 엄격한 사육실 청소 조건으로 인해 연구의 필수 병원체가 손실될 수 있으므로 마우스 환경에서 발견되는 자연 병원체에 대한 노출을 방지하기 위해 특별한 예방 조치를 취하지 마십시오.
참고: 이 마우스는 매우 크고 당뇨병이 있기 때문에 만성 상처 실험에 사용하기 전에 케이지당 최대 3db/db 마우스를 수용하는 것이 가장 좋습니다.
3. 만성 상처 발생에 대한 요구 사항
3.2단계 뒤에 다음 단계를 추가합니다.
3.3. 상처 조직이 건조되지 않도록 상처를 항상 투명 필름 드레싱으로 덮으십시오.
5. 시약 설정
5.2 뒤에 다음 메모를 추가합니다.
알림: 재료 표에 나열된 회사의 ATZ만 사용하십시오. 다른 회사의 ATZ는 이 모델과 호환되지 않으며 사망률을 증가시킵니다.
6. 수술
6.1. 치료 및 마취
참고: 업데이트된 마취 요법은 아래에 설명되어 있습니다.
6.1.5. 개방형 시스템에서 O2 와 함께 전달된 5% 이소플루란을 유속(2-3.5L/min)으로 마우스에 투여하여 마취를 유도합니다. 마우스의 상태를 지속적으로 모니터링합니다.
참고: 마우스가 의식을 잃거나 더 이상 움직이지 않으면 흰색 수술용 패드 위에 놓고 수술 중에 이소플루란을 지속적으로 투여할 수 있도록 기화기에 고정된 노즈콘으로 머리를 맞춥니다.
6.1.6. 개방형 시스템에서는 수술 중 동일한 유속으로 1% 이소플루란을 투여하고 이소플루란의 흐름을 조절하여 마취 깊이를 유지합니다.
6.3. 부상
6.3.5. 절차가 끝나면 마우스에 대한 1% 이소플루란 투여를 중단합니다.
7. 수술 후 치료 및 회복
원래 프로토콜의 7.1단계를 다음 단계로 바꾸고 참고하십시오.
7.1. 수술 직후 투명 필름 드레싱을 도포한 후 인슐린 주사기를 사용하여 투명 필름 드레싱을 바늘로 관통시켜 마우스 등쪽에 생성된 상처 상단에 MSA를 국소적으로 침착시킵니다. 수술 후 10분 이내에 멸균 PBS 용액에 150mg/kg의 MSA를 사용하십시오. 이 농도는 이전에 설명한 바와 같이 광범위한 문헌 검색 후에 결정되었습니다 3,4.
참고: MSA는 지속적으로 교반하지 않으면 침전되는 경향이 있습니다. 계산된 용량을 마우스에 전달하기 위해 상처에 적용하기 전에 MSA가 용액에 완전히 용해되었는지 확인하십시오.
원래 프로토콜의 7.4단계를 다음 단계로 바꿉니다.
7.4. 수술 후 6시간 후에 부프렉스의 두 번째 용량을 투여합니다. 그런 다음 처음 48시간 동안 현지 IACUC 규칙에 따라 주기적으로 마우스를 투여합니다.
참고: 이 마우스 모델에서 피하 투여가 필요한 진통제의 서방형 제형을 사용하는 것은 권장되지 않습니다. 지질 결합 부프레노르핀은 중쇄 지방산 트리글리세리드(MCT) 오일에 현탁될 수 있습니다. MCT 오일의 효과는 매우 어린 db/db 마우스에서 테스트되었지만 노인 또는 노인 비만 db/db 마우스에 대한 MCT의 효과는 테스트되지 않았습니다 5,6. 생쥐의 체중을 감안할 때 상처 근처에 피하로 주사되는 다량의 진통제는 상처 치유와 만성 상처 시작 및 발달의 세포 및 분자 과정에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 이 진통제는 이 쥐의 높은 수준의 지방에 용해되므로 통증을 없애는 데 효과적이지 않을 수 있으며 독성이 될 수 있습니다.
8. 데이터 수집, 부상 후 생쥐 취급, 생존 전략 및 추가 팁
8.1 데이터 수집
8.1.3단계 뒤에 다음 단계를 추가합니다.
8.1.4. 분석을 위해 수집된 조직에는 대조군 상처와 만성 상처 모두에서 상처 가장자리에서 2mm 떨어진 조직만 포함되어야 합니다. 상처는 MSA 적용 후 빠르면 1-2시간 후에 절제를 통해 수집할 수 있습니다.
8.1.5. 투명 필름 드레싱을 뚫어 멸균 주사기로 상처 또는 상처 삼출물에서 축적된 과도한 체액을 수집합니다. 박테리아 연구의 경우 -20°C, 화학 및 분자 연구의 경우 -80°C에서 보관하십시오.
8.1.6 생물막을 포함한 전체 상처 조직을 수집하려면 10일 후 PBS에 4% PFA를 상처에 10분 동안 국소적으로 도포한 후 집게와 가위로 절제합니다. 조직을 제거할 때 상처 조직이 추가 정상 조직으로 지지되도록 5-10mm 상처 가장자리를 추가하십시오. PBS에서 4% PFA로 고정을 계속하고 후속 세척 및 포매 준비를 합니다.
참고: 수술 후 10일 동안의 만성 상처는 조직학을 위해 수집하기에는 너무 취약해질 수 있습니다.
8.5. 생존 전략
8.5.1. 추가 수분 공급 지원 제공: 생쥐가 무기력해지고 수술과 만성화 발생이 스트레스를 주기 때문에 적극적으로 먹거나 마시지 않는지 확인하십시오. 수술 후 처음 48-72시간 동안 따뜻한 식염수를 체중 10g당 0.25mL의 부피로 피하 또는 복강 내로 투여합니다. 수분 공급 지원은 쥐가 얼마나 무기력한지에 따라 하루에 최대 2-3회 필요할 수 있습니다. 또한 쉽게 접근할 수 있도록 식품 알갱이와 워터 젤을 침구에 넣을 수 있지만 더 자주 케이지를 교체해야 할 수도 있습니다.
8.5.2. 추가 보온 지원 제공: 수술 직후와 사육장에 있을 때 순환수(93 °C)로 따뜻하게 한 패드 위의 케이지에 마우스를 넣으면 수술 후 생존율이 크게 증가합니다. 케이지를 패드 위에 1/2 위, 1/2 떨어뜨려 동물이 너무 뜨거워지면 더위를 피하고 추워지면 패드 위로 이동할 수 있도록 합니다.
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결과
그림 1: 육종가를 만들기 위해 이형접합체를 식별하기 위한 유전자형 분석. 예시 젤은 8개의 알려지지 않은 마우스 샘플의 결과를 보여줍니다. 샘플 2와 5는 3개의 밴드(610bp, 406bp 및 264bp)를 포함하므로 이형접합체입니다. 샘플 1, 3, 4, 6, 7 및 8은 2개의 밴드(610bp 및 264bp)만 포함하므로 야생형입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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토론
이 만성 상처 모델을 사용한 결과:
이 모델은 만성 상처 시작 및 진행의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하기 위한 시도로 여러 연구를 수행하는 데 사용되었습니다. 항산화 효소를 억제함으로써 db/db 마우스에 만성 상처가 생성될 수 있는 것으로 나타났습니다. 상처에는 시간이 지남에 따라 특정 생물막 형성 박테리아에 대해 선택된 다미생물 군집이 포함되어 있었습니다. 만성은 마우스를 두 가지 항산화제로 치료함으로써 역전되었습니다: 마우스 IP에 α-토코페롤을 투여하고 상처에 국소적으로 적용한 N-아세틸 시스테인. 이러한 치료로 OS가 크게 감소하고, 생물막이 치료에 대한 민감도가 증가했으며, 적절한 콜라겐 침착 및 리모델링으로 건강한 육아 조직이 형성되는 것으로 나타났습니다3. 이 데이터는 만성 상처를 생성하고 역전시킬...
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1mm 귀 펀치 | Fisherbrand | 13812201 | 구멍 직경 2mm |
| -아미노-1,2,4-트리아졸(ATZ)TCI | A0432 | ||
| 70% 에탄올 | |||
| Acu Punch 7mm 피부 생검 펀치 | Acuderm Inc. | P750 | |
| 아가로스 | |||
| 나6. BKS(D)-Leprdb/J | 잭슨 연구소 | 00697 | 동형접합체 및 이형접합체 사용 가능 |
| Buprenex (부프레노르핀 HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg / ml, Class 3 |
| 젤 로딩 염료, 보라색 (6X) | New England Biolabs | B7024S | |
| 장갑 | |||
| 모제 로션 수제 알로에 및 라놀린 | Nair | 제모 | |
| 요법 (물) 펌프 HTP-1500 | Adroit MedicalSystems | ||
| 가열 패드 | Conair | Moist 건식 가열 패드 | |
| 호스 어댑터 | Adroit MedicalSystems | ||
| 인슐린 주사기 | BD | 329461 | 0.35mm(28G) x 12.7mm(1/2") |
| 이소플루란 | Henry Schein 동물 건강 | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| 이소플루란 기화기 | JA Baulch & 어소시에이츠 | ||
| Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Hyper-Hypothermia 담요 | 신시내티 서브 제로 | 고양이 번호 247 | 22" x30" 재사용 가능한 헤비 듀티 패드 |
| 메르캅토숙신산(MSA) | Aldrich | 88460 | |
| 마우스 노즈 콘 | |||
| 산소 | 탱크는 기화 시스템과 호환되어야 합니다 | ||
| 산염 완충액(PBS), | 오토클레이브 멸균 | ||
| 카로운 수술용 가위 작은 | |||
| 플라스틱 용기 | |||
| 수산화나트륨 | |||
| Taq 2X 마스터 믹스 | 뉴잉글랜드 바이오랩스 | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | 참조: 1624W | 투명 필름 드레싱(6cm x 7cm) |
| 얇은 금속 주걱 | |||
| Tri-HCl | |||
| 튜브 | |||
| 핀셋 Wahl | |||
| 이발기 | Wahl | 리튬 이온 프로 |
참고문헌
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
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