인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

Summary

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

Abstract

인간 뇌 오가노이드는 인간 만능줄기세포(hPSC)에서 파생된 3차원(3D) 구조로, 태아 뇌 발달의 측면을 요약합니다. 시험관 내에서 등쪽과 복부 국소적으로 지정된 뇌 오가노이드의 융합은 흥분성 및 억제성 뉴런과 기능적으로 통합된 미세 회로를 가진 assembloids를 생성합니다. 구조적 복잡성과 다양한 뉴런 개체군으로 인해 assembloids는 비정상적인 네트워크 활동을 연구하는 데 유용한 in vitro 도구가 되었습니다. MEA(Multi-electrode Array) 기록은 세포막 무결성을 손상시키지 않으면서 뉴런 집단에서 전기장 전위, 스파이크 및 종방향 네트워크 역학을 캡처하는 방법 역할을 합니다. 그러나 장기 녹음을 위해 전극에 접합체를 부착하는 것은 크기가 크고 전극과의 접촉 표면적이 제한되어 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 2개월 동안 전기생리학적 활성을 기록하기 위해 MEA 플레이트에 어셈블로이드를 도금하는 방법을 보여줍니다. 현재 프로토콜은 인간 대뇌 피질 오가노이드를 활용하지만, 다른 뇌 영역을 모델링하기 위해 분화된 오가노이드에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신경 네트워크의 발달을 연구하기 위한 강력하고 종단적인 전기생리학적 분석을 확립하며, 이 플랫폼은 뇌전증 치료 개발을 위한 약물 스크리닝에 사용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

Introduction

인간 만능줄기세포(hPSC) 유래 뇌 오가노이드는 in vivo에서 조직 구조와 발달 궤적을 반영하는 공간적으로 자체 조직화된 3D 구조입니다. 전구세포(신경상피세포, 요사상아교세포, 신경세포전구세포, 신경교세포), 신경세포(피질유사흥분성 뉴런 및 억제성 중간뉴런), 신경세포(성상교세포 및 희소돌기아교^세포)를 포함한 여러 세포 유형으로 구성됩니다^1,2. 집합체는 차세대 뇌 오가노이드를 대표하며, 3D 배양 내에서 여러 뇌 영역 및/또는 세포 계통을 통합할 수 있습니다. 생체 내 뇌 영역과 유사한 다양한 뇌 영역 간의 연결을 모델링하고, 뉴런과 성상교세포 간의 상호 작용을 캡처하여 성숙하고 복잡한 신경망을 더 잘 모방하고, 신경 회로의 조립을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 따라서 아셈블로이드는 간질 병태생리학의 특징을 요약하는 데 널리 사용되는 도구가 되고 있으며, 질병의 원인에 있을 수 있는 비정상적인 신경망을 조사하기 위해 기능적 조치가 필요합니다 3,4,5,6.

대뇌 피질 대뇌 신경 세포와 GABAergic interneurons 간의 상호 작용을 모델링하기 위해 여러 그룹은 등쪽 및 배쪽 뇌를 닮은 별도의 오가노이드를 개발한 다음 이를 다중 영역 집합체 ^7,8,9,10으로 융합했습니다. 여기에서, 이전에 설명한 지역적으로 특이적인 신경 아형(regional specific neural subtype)을 가진 집합체(assembloid) 배양 프로토콜이 적용되었다⁹. 그러나 중요한 장벽은 신경 발달 중 신경망 활동을 모니터링하기 위한 재현 가능한 기능 분석이 없다는 것입니다. 오가노이드 네트워크의 많은 기능 테스트는 분화 배치와 세포주 간에 높은 변동성을 갖는 결과를 산출합니다. 오가노이드를 절단하거나 해리하는 기술은 시냅스 연결성을 절단함으로써 고유한 네트워크를 변화시킨다⁸.

다중 전극 어레이(MEA)는 배양 조건이나 세포막 무결성을 방해하지 않고 오가노이드의 전기생리학적 특성을 특성화하기 위해 높은 시간 분해능으로 시간 경과에 따른 네트워크 활동에 대한 대규모 보기를 제공합니다¹¹. 패치 클램프 전기생리학과 비교했을 때, MEA는 단일 세포가 아닌 많은 뉴런 집단을 기반으로 고처리량 데이터 수집을 가능하게 합니다. MEA 플랫폼은 전극 밀도가 다양하여 뇌 오가노이드 연구의 다양한 요구를 충족시킨다¹². 이 프로토콜에서 나타난 바와 같이, 널리 이용되는 체계는, 우물 당 8개에서 64개까지의 전극을 기록한다 13,14,15. 웰당 최대 26,400개의 전극이 있는 고밀도 MEA는 향상된 공간 및 시간 분해능, 활동 전위 전파 속도의 정량화 및 광유전학 자극과의 조합을 가능하게 합니다 14,16,17. 따라서 MEA는 체외에서 간질을 모델링하기 위한 강력한 도구이자 항발작 약물 스크리닝을 위한 중개 패러다임 역할을 합니다.

한 가지 주요 과제는 장기 녹음을 위해 소수성 금속 표면에서 대형 아셈블로이드를 안정화하는 것입니다. 이 프로토콜은 약리학적 분석과 함께 장기 종단 기록을 위해 MEA 플레이트에 온전한 아셈블로이드를 도금하는 자세한 방법론을 설명합니다. 이 프로토콜의 고유한 장점으로는 전기적 활성을 잃지 않고 전극 표면에 assembloid를 안정적으로 부착하고, 도금 후 기능적 네트워크 성숙을 가속화하기 위해 상업적으로 이용 가능한 신경생리학적 기저 매체를 사용하고, 약물 처리와 같은 다운스트림 기능 분석을 수행할 수 있는 타당성, 다른 영역별 프로토콜로 생성된 오가노이드에 대한 광범위한 적용이 있습니다.

목표는 네트워크 활동을 조사하고, 질병별 변화를 조사하고, 간질에서 치료 가능성이 있는 약물을 테스트하기 위해 높은 시간 해상도의 기능 분석을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜의 가장 어려운 단계에 대한 비디오 지침이 제공되며, MEA 플레이트에 아셈블로이드를 도금하는 기술과 이러한 배양물의 대표적인 기록을 보여줍니다.

Protocol

아래에 제시된 모든 실험 절차는 University of Michigan Medical School Institutional Review Board 및 Human Pluripotent Stem Cell Research Oversight Committee의 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜과 대표 실험에 사용된 iPSC 라인은 상업적 출처에서 얻은 인간 포피 섬유아세포에서 파생되었습니다. 이 연구에 사용된 세포주, 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. iPSC에서 운명 특이적 뇌 오가노이드 유도

참고: 이 프로토콜에는 6웰 플레이트의 5개 합류(~85%) 웰에서 마이크로웰 배양 플레이트에 3개의 웰을 준비하기 위한 정보가 포함되어 있습니다. iPSC 유지 프로토콜은 세포주에 따라 다릅니다.

1. 표 1에 상세히 기술된 조성물을 사용하여 개별 세포 배양 배지를 준비한다. 최대 2주 동안 4 °C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
2. 마이크로웰 배양 플레이트에 사용할 모든 웰을 1mL의 DMEM/F-12로 한 번 헹굽니다. 1 mL/웰 mTeSR 플러스 + 50 μM Y-27632를 추가하고 플레이트를 2000 x g 에서 실온에서 5분 동안 회전시켜 마이크로웰에서 기포를 제거합니다. 플레이트를 37°C 5% CO₂ 인큐베이터에 보관합니다.
3. 멸균 P10 피펫 팁을 사용하여 층류 클린 벤치에서 현미경으로 분화된 iPSC의 영역을 세척합니다. 칼슘 또는 마그네슘이 없는 1mL/웰 PBS로 단층에서 세포 파편을 씻어냅니다.
4. 예열된 세포 해리 시약 1mL/웰을 추가하고 플레이트를 37°C 5% CO₂ 인큐베이터에 4-7분(세포주의 특성 및 밀도에 따라 다름) 동안 대부분의 세포가 이륙할 때까지 2-3분마다 부드럽게 교반하여 단층을 단일 세포로 분리합니다.
5. 각 웰에 4mL의 DMEM/F-12를 추가하여 세포 해리 시약을 희석하고 10mL 혈청학적 피펫으로 적당히 삼중합니다. 동일한 라인의 모든 웰에서 세포 현탁액을 50mL 코니컬 튜브로 수집합니다.
6. 실온에서 200 x g 에서 4분 동안 회전하고 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 2mL의 mTeSR 플러스 + 50 μM Y-27632에 세포를 재현탁시킵니다. 10 μL 세포 현탁액, 트리판 블루와 1:1 (v/v) 혼합물을 제거하고 자동 세포 카운터로 세포를 계수합니다.
7. 플레이트 3 x 10 웰당⁶ 개의 살아있는 세포, 라인당 3개의 웰. 필요에 따라 mTeSR plus + 50 μM Y-27632를 추가하여 총 부피를 2 mL/웰로 만듭니다. 실온에서 100 x g 로 3분 동안 플레이트를 회전시키고 인큐베이터에 다시 넣습니다.
   참고: 여기에 사용된 마이크로웰 배양 플레이트에는 웰당 300개의 마이크로웰이 포함되어 있으므로 3 x 10⁶ 셀을 도금하면 10,000개의 셀/마이크로웰이 생성됩니다.
8. 다음 날, P1000 피펫 팁으로 1mL의 배지를 부드럽게 제거하고 1mL의 mTeSR 플러스 배지(Y-27632 제외)를 천천히 추가하여 절반 부피의 배지 교체를 수행합니다. 팁을 매체 표면 근처에 두고 하단의 응집 세포를 방해하지 않도록 가능한 한 천천히 흡입합니다.
9. 매체 교체 후 하루 후에 도립 현미경으로 확인하면 각 응집체의 명확한 윤곽을 볼 수 있습니다. P1000 피펫 팁을 사용하여 각 웰에서 원본 매체를 제거합니다.
10. 0.5mL의 신경 유도 매체(NIM)를 도르소모르핀(DM) 및 SB-4321542(SB)와 함께 멸균 절단 P1000 팁으로 각 웰에 적당히 분사합니다. 즉시, 배지에 현탁된 응집체를 부드럽게 파이프로 올려 멸균된 10cm 현탁액 배양 접시에 옮깁니다. 모든 집계가 전송될 때까지 반복합니다. triturate하지 마십시오.
11. 필요에 따라 NIM + SB/DM을 추가하여 총 부피를 접시당 10mL로 만듭니다. 응집체의 자연 융합을 방지하기 위해 37 °C 5% CO₂ 인큐베이터의 궤도 셰이커에 접시를 놓습니다. 이식 날짜를 오가노이드 배양의 Day 0으로 표시합니다.
12. 1일차부터 끝까지 표 1의 미디어 레시피와 그림 1의 미디어 변경 타임라인⁹를 따릅니다. 특히, 오가노이드는 4일차에 "등쪽(dorsal)"과 "복부(ventral)"로 지정된 두 개의 현탁 배양 접시로 나뉩니다.
    참고: 명심해야 할 몇 가지 주요 시점: 오가노이드 확장은 배지가 EGF/FGF와 함께 NDM(Neural Differentiation Medium)으로 전환되는 6일째에 시작됩니다. 뉴런 분화는 NDM + BDNF/NT3에 의해 25일부터 지원되며, 오가노이드는 46일째부터 성장 인자 없이 NDM에서 유지됩니다.

2. 바이러스 라벨링 및 어셈블로이드 생성

참고: 바이러스 라벨링 ^7,9는 집합체에서 각 영역 특이적 오가노이드의 정체성을 인식하고 특정 전극에서 집합체 영역으로 전기생리학적 활성을 할당하는 데 권장됩니다. 각 MEA 웰에 대해 단일 오가노이드만 도금하는 것이 가장 좋습니다. 이 프로토콜은 단일 오가노이드 도금에도 적용할 수 있습니다.

1. 사용할 바이러스 스톡 및 희석 배지의 부피 계산: 각 오가노이드를 라벨링하려면 바이러스가 포함된 200μL 배지가 필요합니다. 등쪽 오가노이드는 일반적으로 1:1000(v/v) 또는 약 2 x 10¹⁰ vg/mL의 희석 비율로 pAAV1-CAG-tdTomato로 표지됩니다. 복부 오가노이드의 경우 1:300(v/v) 또는 2 x 10¹¹ vg/mL pAAV1-mDLX-GFP 바이러스가 사용됩니다.
   참고: 희석액은 원하는 효과로 적정해야 하며 바이러스 역가의 영향을 받습니다.
2. 적절한 양의 매체를 37°C로 예열합니다. -80 °C에서 얼음 위에 보관된 바이러스 스톡을 해동합니다. 라벨링된 모든 오가노이드를 수용할 수 있는 충분한 48웰 플레이트를 라벨링합니다.
3. 후드에 표백제 10%가 들어있는 비커를 넣습니다. 바이러스와 접촉하는 모든 물질을 비커로 배출하십시오. 완전히 해동된 바이러스를 배양 배지에서 "등쪽" 및 "복부"로 표시된 별도의 15mL 원뿔형 튜브에 희석합니다.
4. Day 56 오가노이드를 배양 접시에서 48웰 플레이트로 이동합니다. 웰당 하나의 오가노이드는 정적 배양에서 자연 융합을 방지하기 위해 권장됩니다. 가능한 한 많은 잔류 배양 배지를 제거하십시오.
5. 각 웰에 각각 200μL의 바이러스-배지 혼합물을 추가합니다. 플레이트를 37°C 5% CO₂ 인큐베이터에 다시 넣습니다. 멸균된 빈 플레이트에서 플레이트를 기울여 바이러스 입자를 웰 바닥으로 농축하고 transduction 효율성을 최적화할 수 있습니다.
   참고: 바이러스 입자는 15mL 코니컬 튜브의 바닥으로 가라앉는 경향이 있으므로 각 웰에 바이러스를 추가하기 전에 바이러스를 배지와 혼합하기 위해 튜브를 자주 뒤집는 것이 모든 오가노이드에 대한 균일한 transduction 효율성을 보장하는 데 매우 중요합니다.
6. 다음 날(57일째)에 각 웰에 800μL의 배양 배지를 추가하여 총 부피를 1mL/웰로 만듭니다.
7. 3일 후(60일째), 라벨링된 오가노이드에 대해 전체 배지 교체를 수행합니다. 바이러스 입자와 접촉하는 모든 물질을 표백하십시오.
8. 3일 후(63일째), 형광 도립 현미경으로 형광 발현을 확인합니다. 신호가 강하면 어셈블로이드 생성을 시작합니다(2.9단계 참조).
9. 라벨이 부착된 모든 오가노이드를 1mL/well PBS로 두 번 헹구어 오가노이드 융합 중 남아 있는 바이러스 입자에 의한 교차 오염을 방지합니다. 절단된 P1000 피펫 팁을 사용하여 하나의 복부 오가노이드를 각 배쪽 웰로 옮기고(또는 그 반대로) 그에 따라 조립 플레이트를 다시 라벨링합니다. 더 나은 융합을 위해 2.5단계와 같이 플레이트를 기울입니다.
10. 융합 절차 3일(66일) 후에 조립을 중단하지 않고 절반 부피 매체 교체를 조심스럽게 수행합니다. 안정적인 조립체를 형성하는 데 일반적으로 약 일주일이 걸립니다(70일차).

3. 전처리된 MEA 플레이트에 어셈블로이드 배치

알림: 조립체를 도금하기 전에 MEA 플레이트의 표면 처리 절차를 완료하는 데 최소 4일이 걸립니다. 시간을 절약하기 위해 배쪽 및 배쪽 오가노이드(즉, 2.9단계)와 MEA 전처리를 병렬로 수행할 수 있습니다.

1. 표면 전처리 및 코팅을 위한 시약을 준비합니다.
   1. 1% 세제/효소 용액을 준비하려면 0.5mL의 탈이온수에 효소/세제 분말 50g을 녹입니다. 분말이 완전히 녹을 때까지 철저히 와류하십시오. 용액을 MEA 웰에 추가하기 전에 생물안전 캐비닛의 제균 튜브 상단 진공 필터로 용액을 멸균합니다. 매번 사용하기 전에 신선하게 만드십시오.
      알림: 세제/효소는 MEA 표면을 살균하고, MEA 제조 공정에서 잔류 오일을 제거하며, 표면이 친수성 화합물 폴리에틸렌이민(PEI)¹⁸과의 상호 작용을 촉진할 수 있을 만큼 충분히 친수성인지 확인합니다.
   2. 0.07% PEI 용액¹⁹를 제조하려면 50% PEI 용액 1mL를 15mL 원추형 튜브에 6mL의 1x 붕산염 완충액이 있는 스톡 7% PEI 용액을 만드는 것으로 시작합니다. 1x 붕산염 완충액 99mL에 스톡 7% PEI 용액 1mL를 희석하여 최종 작업 농도를 얻습니다. 멸균을 위해 사용하기 전에 생물 안전 캐비닛의 0.22μm 필터 장치를 통해 여과하십시오.
      참고: 양전하를 띤 폴리머인 PEI는 1차 코팅 공정에서 BMM(Basement Membrane Matrix) 및 아셈블로이드(²⁰)를 사용하여 음전하를 띤 2차 코팅의 부착을 용이하게 하는 데 사용됩니다. 원추형 튜브에 피펫팅하는 대신 50% PEI 1mL를 꺼냅니다., 원액은 점성이 매우 높기 때문입니다. 필요한 양은 원뿔형 튜브에 무게를 달아 더 쉽게 측정할 수 있으며 50% PEI 용액의 밀도는 1.08g/mL입니다. 7% 재고 PEI 용액은 -20°C에서 최대 한 달 동안 1mL 부분 표본으로 보관할 수 있습니다. 생물 안전 작업대에서 모든 후속 단계를 수행하십시오.
2. 각 어셈블로이드의 크기를 고려하여, 웰당 64개의 전극이 있는 6웰 MEA 플레이트를 사용하여 웰당 하나의 어셈블로이드를 수용할 수 있습니다. 충분한 생물학적 복제를 보장하기 위해 실험에 필요한 MEA 플레이트의 수를 계산합니다.
3. 멸균 MEA 플레이트의 각 웰에 1% 세제/효소 용액 1mL를 추가합니다. 피펫 팁으로 전극이 손상되지 않도록 주의하십시오. 세척을 위해 진공 흡입기를 사용하는 경우 팁이 전극 어레이에 닿지 않도록 하십시오. 37°C 인큐베이터에서 2시간 동안 배양합니다.
4. 세제/효소를 제거하고 1.5mL의 멸균 탈이온수로 각 물을 5회 잘 세척합니다. 세제/효소는 생체 적합성이 없기 때문에 남아 있는 화학 물질을 완전히 씻어내는 것이 중요합니다.
5. 사전 컨디셔닝을 위해 각 웰에 1mL의 배양 배지를 채웁니다. 플레이트를 37 ° C 5 % CO₂ 인큐베이터로 2 일 동안 다시 놓습니다. MEA 표면을 세포 배양 조건에 노출시키면 세포 부착이 촉진됩니다.
6. 배양 배지를 제거하고 각 웰의 MEA 전극을 1차 코팅을 위해 50μL의 0.07% PEI 용액으로 덮습니다. 37 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
7. PEI 용액을 완전히 흡입합니다. 멸균 탈이온수 1mL로 각각을 잘 세척합니다. 총 3번의 빠른 세탁을 수행합니다. 뚜껑을 닫은 상태로 생물 안전 캐비닛에서 플레이트를 실온에서 15분 동안 건조시킵니다.
8. 2차 코팅을 위해 배양 배지에 희석한 50μL의 1:20(v/v) BMM으로 각 웰의 전극 영역을 덮습니다. MEA 플레이트를 밤새 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다. 코팅 과정 전반에 걸쳐 충분한 습도를 보장하기 위해 우물을 둘러싼 구획에 멸균수를 추가하십시오.
9. 다음 날, 희석된 BMM을 진공 청소기로 흡인하여 표면에 얇은 층을 남깁니다. 두꺼운 층이 형성된 경우 P1000 피펫 팁을 사용하여 전극 접촉 부위에 배양 배지를 강제로 분무합니다. 두꺼운 덩어리를 제거하기 위해 필요한만큼 씻으십시오.
   알림: 잔류 두께 BMM은 셀과의 전극 접촉을 방해할 수 있습니다.
10. P1000 팁이 넓게 절단된 어셈블리를 모아 가능한 한 적은 매체를 전달하면서 웰의 전극 위에 놓습니다.
11. 해부 스코프가 있는 층류 후드에서 멸균 해부 바늘 또는 P20 팁을 사용하여 조립체를 원하는 위치로 조심스럽게 밀어 넣습니다. 이 위치에서는 등쪽 및 복부 오가노이드가 대부분 전극으로 덮일 수 있습니다. P20 팁을 사용하여 어셈블로이드 주변의 액체를 제거합니다. 모든 어셈블리 또는 하위 집합에 대해 이 작업을 반복하며, 몇 분 내에 수행할 수 있습니다.
    알림: 피펫 팁 및/또는 바늘로 MEA 표면을 만지거나 긁지 마십시오. 피펫 팁으로 조립체를 찌르거나 찢지 마십시오. 오가노이드가 완전히 건조되지 않도록 가능한 한 빨리 도금을 완료하십시오.
12. 37°C에서 10분 동안 접합체를 배양합니다(배지 제외). 플레이트를 인큐베이터에서 층류 후드로 옮기고 배양 배지에 희석한 1:50 BMM의 작은 방울 2-3방울을 해부 내시경으로 assembloids 위에 적용합니다. 37°C에서 30분 더 배양합니다.
13. 해부 내시경으로 assembloids 가까이에 배양 배지 3방울을 조심스럽게 추가합니다. 이렇게 하면 오가노이드가 수분을 유지할 수 있습니다. 37 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
    알림: 후속 단계에서 조립체가 움직이거나 뜨는 경우 3.11단계부터 도금을 다시 시작해야 합니다.
14. 매시간 20-50 μL의 세포 배양 배지를 절개 스코프의 각 웰에 조심스럽게 추가합니다. 이 작업은 하루 동안 수행할 수 있습니다. 하루가 끝날 때 총 부피의 최소 250μL에 도달하는 것이 목표입니다.
15. 다음 날, 모든 assembloids가 절개 범위 내에서 정착되고 안정화되었는지 확인하십시오. 750μL의 배양 배지를 추가하여 총 부피 1mL/웰에 도달합니다. 플레이트를 최소 2일 동안 방해하지 않고 그대로 두십시오.
16. 500 μL의 배양 배지를 제거하고 700 μL의 신경생리학적 기저 배지를 추가하여 매주 배지 교체를 신중하게 수행합니다. 추가된 매체의 추가 부피는 증발을 설명하며 사용 중인 MEA 플레이트의 증발량에 따라 조정할 수 있습니다. MEA 웰에서 증발을 최소화하기 위해 필요에 따라 웰 주변에 멸균수를 추가합니다.

4. MEA 기록 및 데이터 분석

1. 신경 생리학적 기저 매체로 전환한 후 약 일주일 후(보통 약 78일) MEA 기록을 시작합니다.
2. 레코딩 챔버가 설정 온도(보통 37°C)에 도달할 때까지 기다립니다. 플레이트를 장치로 옮기고 녹음하기 전에 최소 5분 동안 평형을 이루도록 합니다.
3. 하드웨어 라이브 설정
   1. 샘플링 주파수, 즉 원시 전압 데이터가 기록되는 속도를 설정합니다. 기본 설정(12.5kHz)을 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 아날로그 모드(이 경우와 같이 일반적으로 Neural Spikes)를 지정하여 특정 응용 프로그램에 대한 하드웨어 대역폭과 이득을 구성합니다. 녹화 중 활동을 시각적으로 모니터링하려면 Spike Detector 및 Burst Detector 모듈을 사용하십시오.
      알림: 아날로그 설정은 원시 전압 데이터가 기록되는 방식에 영향을 미치며 데이터가 기록된 후에는 변경할 수 없습니다.
   3. (선택 사항) 레코딩 데이터에 하드웨어 디지털 필터를 적용합니다. 저역 통과 필터 옵션에는 2kHz 또는 3kHz Kaiser Window가 포함됩니다. 기본 설정은 아날로그 설정을 선택한 후 수정할 수 있습니다.
   4. referencing by median(기본값)으로 설정하며, 이 경우와 같이 신경 기록에 매우 권장됩니다. 참조는 채널 그룹에 공통적인 노이즈 간섭을 줄여 낮은 진폭 신호의 품질을 향상시킵니다.
      참고: 위의 매개변수는 어셈블리에서 볼 수 있는 활동에 따라 필요에 따라 조정할 수 있지만 주어진 실험의 모든 녹음에 대해 일관되게 유지되어야 합니다.
4. 플레이트 맵과 설명을 추가합니다(필요한 경우). 동일한 플레이트에 대한 이전 기록에서 플레이트 맵을 가져와 일관성을 보장하고 배치 데이터 처리를 용이하게 합니다. 파일 이름이 올바르게 지정되었는지 확인합니다.
5. 신호가 양호해 보이면(노이즈 및 아티팩트 최소화) 원시 데이터를 기록합니다. 일반적으로 2-5분의 녹음은 대표 샘플에 충분합니다.
6. 실험 설계에 따라 일주일에 한 번 또는 두 번, 5-15분 동안 전기 활동을 종단으로 기록합니다. 각 미디어 교체 직후 전기 활동이 떨어지므로 다음 녹음을 시작하기 전에 모든 미디어 교체 후 최소 24시간 동안 기다리십시오.
7. (선택 사항) 배쪽 오가노이드와 배쪽 오가노이드 간의 전기적 활성을 국소화하고 구별해야 하거나 각 전극의 활성을 개별적으로 분석해야 하는 경우 각 기록 후 명시야 및 형광 하에서 각 집합체의 이미지를 얻을 수 있습니다(그림 2B).
8. 데이터를 분석할 때 스파이크/버스트 감지기 및 통계 컴파일러를 포함한 분석 구성을 적용합니다. 스파이크 감지를 위해 기준선에서 5.5-6 표준 편차로 설정된 적응형 임계값을 사용합니다. 버스트를 100ms에 ≥5번의 스파이크가 있는 활동으로 식별¹³. 총 활성 전극의 25% 이상이 100ms 이내에 발사되고 네트워크 버스트당 최소 50개의 스파이크가 발생할 때 네트워크 활동을 정의합니다^13,14.
   참고: 이러한 매개변수는 특정 실험의 발사 특성에 따라 변조됩니다. 낮은 진폭 스파이크에 대한 감도를 높이려면 스파이크 감지에 대한 적응형 임계값을 낮출 수 있습니다. 폭발 감지를 위해 다양한 방법을 사용할 수 있으며, 배경 활동과 크게 다른 급증의 폭발을 감지하도록 매개변수를 조정할 수 있습니다. 네트워크 활성 파라미터는 특히 집합체가 전극의 전체 필드를 커버하지 않는 경우 더 낮은 비율의 전극으로 변조될 수 있습니다. 모든 매개변수는 종단 비교를 허용하기 위해 실험 기간 동안 일관되게 유지되어야 합니다.
9. 기록된 데이터를 재생하는 동안 일괄 처리를 위해 통계 컴파일러 모듈을 실행합니다. 고급 분석을 위해 고급 메트릭 및/또는 스파이크 출력 파일을 내보냅니다.
   참고: 고급 메트릭 출력에는 평균 발사, 파열 및 동기화에 대한 전극, 우물 및 그룹 평균이 있는 .csv 파일이 포함되어 있습니다. 스파이크 출력(.spk 파일)에는 모든 스파이크에 대한 파형 추적이 포함되어 있으며, 고급 분석(예: 스파이크 정렬)을 위해 다른 플랫폼으로 가져올 수 있습니다.

5. End-point 약리학적 분석 및 플레이트 재활용

참고: 약물 치료 분석은 아셈블로이드가 충분히 성숙하고 전기 활성이 최고조에 달한 후에 수행할 수 있습니다. 기준선/치료 전 활동과 치료 후 활동의 기록은 같은 날에 수행해야 합니다.

1. 조립체 바로 위에 1-10 μL의 약물 용액을 추가하고 플레이트를 부드럽게 휘젓습니다. 균일한 혼합물을 보장합니다. 예를 들어 글루타메이트/GABA 수용체 작용제/길항제를 사용한 시냅스 관련 약물 처리 분석(그림 2E)과 같은 일부 경우에는 약물 함유 배지에서 더 긴 배양 시간이 권장됩니다(자세한 내용은 결과 섹션 참조).
   알림: 일반적으로 큰 부피 변화는 일시적으로 전기 활동을 감소시키기 때문에 최종 작업 농도를 얻기 위해 각 웰에 소량의 약물 용액을 추가하는 것이 좋습니다. 관심 약물이 용해되는 비히클의 추가가 전기생리학적 매개변수에 중대한 변화를 유발하지 않도록 하는 것이 중요합니다.
2. 충분한 PBS 세척(일반적으로 3회)을 수행하고 치료 후 기록 후 약물을 세척합니다. 약물 세척 후 다음 날 추가 녹음을 수행하여 전기 활동이 기준선 수준으로 돌아오는지 확인합니다.
3. 선택적으로, 추가 실험(예: 실시간 이미징, 전체 마운트 면역염색을 위한 4% 파라포름알데히드로 고정 또는 RNA 또는 단백질 추출을 위한 용해)을 수행하기 위해 기록이 끝날 때 MEA 플레이트에서 아셈블로이드를 분리하기 위해 매체를 강제로 피펫합니다.
4. 분석을 위해 각 조건에 대해 최소 3개의 기술적 및 생물학적 복제를 사용하십시오. 전기생리학적 데이터를 n ≥ 3회 반복의 평균으로 표현합니다.
5. 실험이 끝날 때 플레이트를 재활용하려면 부착된 응집체를 제거한 후 남은 매체를 흡입하십시오. 멸균 PBS로 한 번 세척하십시오. 0.25% 트립신-EDTA의 200μL/웰로 금속 영역을 완전히 덮고 플레이트를 밤새 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다.
6. 다음 날, 트립신을 흡인하고 70% 멸균 에탄올로 2회, 멸균 탈이온수로 3회 세척합니다.
7. 뚜껑을 닫은 상태에서 또는 완전히 건조될 때까지 생물 안전 캐비닛의 플레이트를 15분 동안 자연 건조합니다. 세척된 접시를 비닐 봉지에 밀봉하고 나중에 사용할 때까지 실온에 보관하십시오.
   알림: 잘 청소한 MEA 플레이트는 녹음 품질을 크게 떨어뜨리지 않고 세 번 재사용할 수 있습니다.

Results

인간 배쪽-복부 아셈블로이드는 6-웰 MEA 플레이트(분화당 n = 6, 3개의 분화)에 도말되었으며, 각 웰에는 64개의 전극이 포함되었습니다(그림 2A). 종방향 기록을 위해 계획된 10개의 아셈블로이드 중 9개는 시험관 내에서 50일 이상 전극에 단단히 부착되었습니다(그림 2D). 약리학적 분석을 위해 지정된 8개의 아셈블로이드 중 6개는 개발 단계에 적합한 네트워크 활성을 통해 세척 단계를 통해 성공적으로 정착되었습니다(그림 2E). 한 대표적인 웰의 위상차 및 형광 이미지가 표시되어 있으며(그림 2B), AAV-CAG-tdTomato-labeled dorsal 및 AAV-mDLX-GFP-labeled ventral organoids는 쉽게 구별됩니다 ^7,9.

MEA에 대한 뉴런의 활성을 분석하여 다양한 매개변수를 통해 전반적인 세포 흥분성 및 네트워크 활성을 평가할 수 있습니다. 배양 전반의 전반적인 발화율은 세포 및 네트워크 흥분성에 대한 정보를 제공하며, 여러 전극에서 동기화된 파열 빈도는 뉴런의 시냅스 활성 네트워크의 범위를 나타냅니다. 짧은 기간 동안 공간적으로 구별되는 전극에서 발생하는 여러 번의 반복적인 스파이크(네트워크 파열)는 발작과 유사한 활동에 대한 생물학적 상관 관계로 작용할 수 있지만, MEA에 대한 집합체는 실제 발작을 일으킬 수 있는 전체 유기체에 비해 제한적입니다. 그림 2C 는 84일과 91일에 상업적으로 이용 가능한 신경생리학적 기저 배지에서 배양된 아셈블로이드의 네트워크 파열 패턴을 보여주며, 뉴런의 기능적 성숙으로 인해 이후 시점에서 파열 지속 시간이 증가했을 수 있습니다. 이 경우, 셀룰러 및 네트워크 활성은 어셈블로이드가 도금된 날부터 점차 증가하며, 일반적으로 92일째에 최고조에 달하고 125일째에 거의 사라집니다(그림 2D). 나중 단계에서 증가된 성숙도는 후기 기록 시점에서 연장된 동기화된 버스트 지속 시간에 기여할 수 있습니다.

GABA_A 수용체 길항제인 Bicuculline은 108일째에 약물을 추가한 후 상당히 높은 발사 속도와 (네트워크) 파열 빈도로 나타난 바와 같이 아셈블로이드의 동기화된 네트워크 활성을 향상시킵니다(그림 2E). 이는 이전에 단일세포 전기생리학 기록(single-cell electrophysiology recordings)²¹에서 입증된 것과 유사하다. 약리학적 분석을 위한 검정력 분석은 0.94의 효과 크기와 0.05의 알파에 대해 G*Power3 베이스를 사용하여 수행되었습니다. 0.8의 검정력을 달성하기 위해 n = 5인 3개의 동일한 크기의 그룹이 있는 15개의 아셈블로이드로 구성된 총 샘플이 필요했습니다(그림 2E). 응답이 소량의 매체 추가로 인해 발생할 수 있는 신호 강도의 변화뿐만 아니라 실제 신호 이벤트인지 확인하기 위해 차량 제어 장치가 포함되어 있습니다(그림 2E).

그림 1: 연구 개요. 임계 단계 및 해당 소분자 보충제를 자세히 설명하는 차별화 프로토콜의 MEA 타임라인에서 이중 표지된 아셈블로이드의 생성 및 도금을 위한 프로토콜(조성에 대한 추가 정보는 표 1 및 재료 표 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: assembloids의 MEA 기록. (A) 82일째, 즉 도금 후 10일째에 단일 MEA 플레이트(n = 6웰)의 평균 소성 활동의 히트맵. 모든 우물은 동일한 조건과 유전자형의 배양을 나타냅니다. (B) assembloid의 대표적인 위상차 및 공초점 이미지로, 등쪽 assembloid는 빨간색으로, ventral은 녹색으로 표시됩니다. 흰색 화살촉은 GABAergic interneurons가 복부에서 등쪽으로 이동했음을 나타냅니다. 스케일 바 = 500 μm. (C) 대표 래스터는 단일 웰에서 120초 이상의 기록 시간을 플롯합니다. 네트워크 버스트는 자주색 상자로 강조 표시됩니다. 78일(도금 후 1주일, 기록 시작일)과 92일(도금 후 3주, 활동이 최고조에 달할 때)의 두 가지 별도 시점이 시연됩니다. (D) 78일째부터 127일째까지 평균 발사 속도, 버스트 빈도 및 네트워크 파열 빈도의 정량화(n = 3개의 분화, 3개의 집합체/분화). 각 곡선은 3개의 분화(색상으로 구분)로 컴파일된 하나의 개별 조합을 나타냅니다. 빨간색 곡선은 평균값을 보여줍니다. (E) bicuculline 분석 결과의 정량화(n = 6 assembloids/condition). 막대 그래프는 SEM± 평균으로 표시되었습니다. 각 점은 3개의 미분 배치(색상으로 구분됨)로 컴파일된 하나의 집합체를 나타냅니다. 비모수 Friedman 검정을 수행했습니다. **p < 0.01; ns, 중요하지 않습니다. MEA, 다중 전극 어레이. 히트 맵 및 래스터 플롯은 분석 소프트웨어 Neural Metric Tool을 사용하여 생성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 다양한 분화 단계의 매체 구성 요소. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

iPSC 유래 아셈블로이드에서 네트워크 활동의 전기생리학적 기록을 위한 MEA 기반 방법은 간질의 시험관 내 모델링에 사용되어^{왔다 22,23}. 흥분성 및 억제성 시냅스 연결을 통합하는 이 제안된 플랫폼은 신경 세포 과흥분성의 메커니즘과 간질 형성 과정에서 대뇌 피질 인터뉴런의 역할을 해결할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 또한 이 플랫폼을 사용하면 약리학적 섭동이 있는 경우에도 약 50일 동안 시험관 내에서 약 50일 동안 어셈블로이드를 안정화하고 종단 전기생리학적 데이터를 수집할 수 있으므로 잠재적인 치료 표적이 있는 화합물을 테스트하기 위한 접근 방식을 제공합니다.

성숙하고 상대적으로 큰 아셈블로이드를 체외에서 장기간 동안 소수성 표면에서 안정화하는 것은 기술적으로 어려운 일이었습니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 역하를 띤 화학 물질을 이중 코팅 전략으로 적용하여 전극 표면에 오가노이드가 장단기 부착할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 플레이트 코팅 시약을 폴리-L-오르니틴(PLO)/라미닌에서 PEI/BMM으로 전환하여 이전에 사용된 방법²⁴ 를 최적화하여 높은 성공률과 낮은 독성으로 견고한 부착을 달성합니다. 또한, 이 안정화된 장기 배양 시스템은 고처리량 데이터를 생성할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 예를 들어, 이중 바이러스를 사용한 사전 라벨링은 개별 전극별 스파이크 정렬을 보완하여 서로 다른 영역의 활동을 현지화하고 비교할 수 있습니다. 제안된 플랫폼은 또한 국소자기장 전위를 기록하기 위한 안정적인 도구를 제공하며, 이는 assembloids(²⁵)의 온전한 구조를 방해하지 않으면서 interneuron 기능에 매우 관련성이 있습니다. 이 프로토콜의 주요 제한 사항은 도금 후 조립체가 평평해진다는 것인데, 이는 초기 3D 구조가 보존되는지 여부에 대한 우려를 불러일으킵니다. 전극(²⁶ )으로 오가노이드를 감싸는 보다 발전된 MEA 플랫폼을 사용하여 전극 주변에 오가노이드를 성장시키는 것은 잠재적으로 이러한 한계를 극복할 수 있습니다.

오가노이드의 전기생리학적 기록을 위한 MEA 기반 방법의 주요 장애물 중 하나는 분화 프로토콜 및 분화 배치에 걸쳐 실험 결과의 가변성과 재현성입니다. 이전 연구에 따르면 MEA로 측정된 뉴런의 네트워크 활성은 등쪽 및 배쪽 오가노이드의 뉴런 성숙 상태에 따라 달라진다²⁷. 상대적으로 성숙한 뉴런과 회로를 가진 나중 시점에 집합체에서 기록하는 것은 일관성을 향상시키는 한 가지 방법입니다. 또한 고처리량 데이터를 생성하는 다중 웰 MEA 시스템을 선택하면 실험적 변동성에 비추어 통계적 비교가 가능합니다. 배양물의 전기생리학적 활성이 주어진 시점에서 예상되는 것과 일치하지 않는 경우, 면역세포화학적 및 전사체 분석을 포함한 품질 관리 조치를 위해 기능적 플랫폼에서 온전한 배양물을 수집하는 것이 중요하고 도움이 됩니다.

제안된 플랫폼에서 가장 중요한 것은 등쪽에서 지역적으로 지정된 흥분성 피질 뉴런과 복부 쪽의 억제성 중간뉴런을 기능적으로 통합하는 것입니다. 문헌에서 발견되는 뇌 영역 특이적 오가노이드의 생성을 위한 프로토콜은 배지 조건, 배양 시기, 수율 및 성숙 프로파일 등과 관련하여 매우 다양하다²⁸. 이 프로토콜은 흥분성 뉴런 및 GABAergic 인터뉴런을 생성하는 능력에 있어서 피질 및 신경절 특정성을 가지고 있지만, 잘 확립된 분화 기법을 사용하여 운동 뉴런⁽²⁹ ) 및 Purkinje 세포⁽³⁰)와 같은 다른 정체성을 나타내는 iPSC 유래 뉴런을 생성할 수 있습니다. 따라서 제안된 플랫폼은 대뇌 피질과 척수/소뇌 사이의 신경 회로를 모델링할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 바이러스 라벨링을 통한 세포 유형의 시각화 및 도금 시기와 관련된 일부 최적화 후, 이 방법은 근위축성 측삭 경화증(ALS)¹⁷과 같은 간질 이외의 다른 질병 모델로 번역될 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm 코닝 비 TC 처리 배양 접시	Corning	08-772-32	셰이커
100 mL 비커	피셔 사이언티픽	FB100100
100% 에탄올	피셔 사이언티픽	BP28184-4L
2-메르캅토에탄올(&베타;-ME)	Thermo Fisher	21985023	작동 농도 100 μ M
48웰 세포 배양 플레이트	Fisher Scientific	50-202-140
6웰 세포 배양 플레이트	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R 냉장 원심분리기	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	1mM 원액을 얻기 위해 DMSO에 5mg을 현탁시킵니다. 분취량 및 &-minus에서 동결; 80°C. 1:10,000으로 희석하여 사용하십시오. 작동 농도 100 nM.
자동 세포 계수기	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6웰 플레이트	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA 플랫폼	Axion Biosystems	Maestro	온도 환경 제어 포함
B-27 보충제(일반, 비타민 A 포함)	Thermo Fisher	21985023
B-27 보충제(비타민 A 없음)	Thermo Fisher	12587010
기저막 매트릭스- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
구슬 목욕	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
벤치탑 도립 현미경	Olympus	CKX53	층류 클린 벤치에서 유지
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	작동 농도 10 & M
표백제	CLOROX	67619-26
붕산염 완충액 20x	Thermo Fisher	28341	에서 작동 농도
	StemCell Technologies	5790
세포 해리 시약(StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron 궤도 셰이커	HT-Infors	나69222
세제/효소(Terg-A-Zyme)	시그마-알드리치	Z273287	작동 농도 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-글루타민	써모 피셔	113300
DMSO	시그마-알드리치	67685
도르소모르핀	시그마-알드리치	P5499	DMSO에 5mg을 용해시켜 10mM 원액을 얻습니다. 분취량 및 &-minus에서 동결; 20°C. 1:2000으로 희석하여 사용하십시오. (작업 농도 5 & M)
칼슘 또는 마그네슘이 없는 D-PBS Thermo	Fisher	14190144
신경교세포주 유래 신경영양(GDNF)	Peprotech	450-10	용해 100 μ 1mL의 PBS에서 100 & mu; g/mL입니다. 분취량 및 &-minus에서 동결; 20 °C. 1:5000으로 희석하여 사용하십시오. (작동 농도 20 ng/mL).
GlutaMAX 보충제	Thermo Fisher	35050061
혈구계	선거 현미경 과학	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO 클린 벤치	Thermo Fisher	51029692
습도 제어 세포 배양 인큐베이터	Thermo Fisher	370	37 °로 설정; C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	분취량 및 &-minus에서 동결; 80°C. 실온에서 해동하면 침전됩니다. 냉동 분취량은 37 °에 직접 넣어야 합니다. C를 사용하십시오.
녹아웃 혈청 대체 (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (배지 + 보충제)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, 인간 iPSC 세포용 안정화 피더 프리 배지
N2 보충제	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
비필수 아미노산 (NEAA)	써모 피셔	11140050
NT3	Peprotech	450-03	용해 100 μ 1mL의 PBS에서 100 & mu; g/mL입니다. 분취량 및 &-minus에서 동결; 20 °C. 1:5000으로 희석하여 사용하십시오. (작동 농도 20 ng/mL).
NuFF 인간 신생아 포피 섬유아세포	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
페니셜/스트렙토마이신	Thermo Fisher	15140122
피펫(P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	오가노이드 수집용 고압멸균 절단 P1000 팁
(에틸렌이민)(PEI)	시그마-알드리치	P3143	멸균 붕산염 완충액에 원액을 희석하십시오. 작동 농도 0.07%. 원고에서 자세한 내용을 참조하십시오.
재조합 인간 표피 성장 인자(EGF)	R& D Systems	236-EG-200	PBS에 정지되어 있습니다. 분취하고 -20°C에서 동결합니다.
재조합 인간 섬유아세포 성장 인자(FGF)-기본	Peprotech	100-18B	는 PBS에서 정지되었습니다. 분취하고 -20°C에서 동결합니다.
조합 인간-뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)	Peprotech	450-02	재구성 전에 잠시 원심분리합니다. 100 & mu를 용해; 1mL의 PBS에서 100 & mu까지의 g; g/mL입니다. 분취량 및 &-minus에서 동결; 20 °C. 1:5000으로 희석하여 사용하십시오. (작동 농도 20 ng/mL).
레티노산(RA)	Sigma-Aldrich	R2625	100mg을 3.3mL의 DMSO에 녹여 100mM 원액을 얻습니다. 주식 100 &mu를 분취합니다. L/튜브 및 &-minus에서 동결; 80°C. 200 & mu를 가져가십시오. L of 100 mM 스톡을 10배 희석(DMSO 1.8 mL 추가)하여 10 mM 스톡을 만듭니다. 분취량 50 & L/튜브 및 &-minus에 저장; 80°C. 1:100,000으로 희석하여 사용하십시오. (작동 농도 100 nM).
ROCK 억제제 Y-27632	Tocris	1254	10 mM 스톡
SAG(평활 작용제)	Selleckchem	S7779	취량 및 &-minus에서 동결; 80 °C. 스톡 농도 1mM. 1:10,000 희석(작동 농도 100 nM)으로 사용하십시오.
SB-431542	Tocris	1614	5mg을 1.3mL의 DMSO에 용해시켜 10mM 원액을 얻습니다. 분취량 및 &-minus에서 동결; 80 °C. 1:1000으로 희석하여 사용하십시오. (작업 농도 10 & M)
혈청학적 피펫 필러	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip 진공관 상단 필터	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
멸균 세포 배양 후드	Baker Company	SG-600
트리판 블루 용액 (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
줌 실체현미경	Olympus	SZ61/SZ51	류 클린 벤치에 보관