방법 논문

죽상동맥경화증에서 대동맥 조직의 3차원 이미징

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DOI:

10.3791/67400

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2024년 10월 25일

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1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

이 논문에서

요약

여기에서는 쥐 대동맥을 3차원(3D)으로 이미지화하기 위해 최적화된 조직 제거 프로토콜을 제시합니다. 우리는 면역 염색, 광학 제거 및 이미징에 대한 최첨단 절차를 설명하며, 죽상 경화성 플라크가 있는 말초 신경계의 해부학적 근접성과 죽상 경화증의 외막을 정의하기 위해 설명합니다.

초록

최근 연구는 죽상동맥경화증을 경벽의 만성 염증성 질환으로 이해하는데, 여기에는 내막플라크(intima plaque), 미디어(media), 동맥의 외측 결합 조직 외피를 형성하는 외막(adventitia)을 포함한 동맥벽의 3층이 모두 포함됩니다. 우리의 최근 연구는 외막이 말초 신경계에 의해 모든 조직 세포에 도달하는 통로로 사용된다고 제안했습니다. 우리는 또한 말초 신경계, 즉 감각 및 교감 신경계가 죽상 경화성 플라크에 인접한 축삭 네트워크의 신생과 관련된 주요 리모델링 과정을 겪는다는 것을 발견했습니다. 이러한 맥락에서 신경망의 구조와 질환이 있는 동맥의 혈관 구성 요소와의 상호 작용을 이해하는 것은 심혈관 질환 발병에 대한 더 나은 이해를 위한 중요한 약속을 가지고 있습니다. 이러한 목표를 달성하기 위해서는 손상되지 않은 건강한 동맥과 병든 동맥의 세포 내 구조를 주변 혈관 주위 구획과 함께 시각화하는 방법이 필요합니다. 조직 투명화를 통해 다른 방법으로는 접근할 수 없는 더 큰 조직 구획의 온전한 심부 조직 이미징을 수행할 수 있습니다. 이를 통해 라벨링, 투명화, 고급 현미경 이미징 및 이미지 처리 도구의 통합을 통해 손상되지 않은 동맥의 체적 이미징을 수행할 수 있습니다. 여기에서는 두 가지 별개이지만 상호 보완적인 수동 조직 세정(passive tissue clearing) 접근법, 즉 수성 기반 2, 2-티오디에탄올(TDE) 세정화 및 용매 기반 면역 라벨링 지원 용매 세정성 장기(iDISCO) 세정에 대한 3차원 이미징을 통해 전체 마우스에서 분리된 대동맥 분절 또는 전체 대동맥 제자리 영상을 촬영할 수 있습니다.

서론

조직학적 기법은 조직/장기의 절단을 통해 생물학적 샘플에 대한 기본적인 이해를 제공합니다. 그러나 3D(three dimansion)에서 복잡한 해부학적 세포/세포 및 조직/조직 상호 작용의 묘사는 최근까지 달성하기 어려웠습니다. 이러한 미충족 욕구는 건강한 상태와 질병이 있는 상태의 심혈관계의 맥락에서 특히 분명했습니다. 과거에는 온전한 조직을 이미징하는 것이 빛의 흡수와 광 산란으로 인해 본질적으로 불투명하기 때문에 어려웠습니다. 조직 투명화는 이러한 제한을 최소화하여 온전한 생물학적 샘플을 투명하게 만듭니다. 최근 조직 투명화 기술의 발전으로 절제되지 않은 투명 조직의 고해상도 3D 이미징을 통해 마이크로미터 해상도에서 전체 장기의 세포 및 구조적 미세구조에 대한 상당한 통찰력을 얻을 수 있게 되어 해부학적 연결 네트워크를 정의할 수 있습니다.

죽상동맥경화증은 동맥벽의 3층을 포함하는데, 여기에는 내막층, 중간층, 외결합조직층이 포함되며, 이를 외막증이라고 합니다. 동맥 내층에 있는 죽상경화성 플라크(Atherosclerotic plaques)는 수십 년 동안 전통적인 연구 대상이었다 1,2. 그러나 외막층에는 말초 신경계의 혈관, 림프관 및 신경 섬유가 포함되어 있습니다. 더욱이, 외막은 말초 신경과 혈관 주위 신경절을 포함한 혈관 주위 지방 조직 및 신경 조직 구성 요소와 연결되어 있습니다 3,4. 말초 신경은 외막을 멀리 있는 표적 조직, 더 나아가 세포에 도달하기 위한 통로로 사용하는 것으로 알려져 있다5. 우리의 최근 연구는 면역 체계, 신경계 및 심혈관 시스템을 포함하는 주요 생물학적 시스템의 다층적 상호 작용을 이해하는 데 진전을 이루었습니다. 우리는 이러한 상호작용을 신경면역-심혈관 인터페이스(neuroimmune-cardiovascular-interface) 6,7이라고 명명했습니다. 죽상형성 동안, 동맥벽 구성요소는 강력한 재구조화와 리모델링을 거칩니다. 예를 들어, 내막에서 죽상경화성 플라크 진행에 인접하여 면역 세포 응집체가 형성되고 쥐 대동맥 외막에서 신경 세포 축삭 신생이 발생합니다 6,8,9. 죽상동맥경화증이 진행됨에 따라 면역세포 응집체는 T 세포, B 세포 및 형질 세포 영역이 뚜렷한 잘 구성된 동맥 3차 림프 기관(ATLO)으로 발달합니다10. 그러나 이러한 변화를 3D로 묘사하기 위해서는 불충분한 막 투과화와 고유한 광 산란으로 인해 온전한 조직의 고해상도 이미징이 어려웠습니다11. 조직 제거 접근법은 기존 조직학 접근법 11,12,13,14,15의 주요 한계를 극복했으며, 굴절률(RI)을 균일하게 조정하여 온전한 조직이나 장기 깊숙이 도달할 수 있는 항체 침투를 향상시켜 복셀에서 더 높은 이미징 깊이를 가진 마이크로미터 규모의 해상도 이미지를 제공합니다. 샘플의 RI는 글리세롤(RI 1.46) 또는 이멀젼 오일(RI 1.52)과 일치시킬 수 있으므로 광 산란 및 구면 수차를 크게 줄여 고분해능을 구현할 수 있습니다. 최근 수성 기반 2,2-티오디에탄올(TDE) 및 용매 세척 장기의 면역 라벨링 지원 3D 이미징(iDISCO)과 같은 전체 장기 또는 전신 조직 투명화 기술의 발전은 체적 이미징 기술(공초점, 다광자 및 광시트 현미경 이미징 포함)과 함께 연결성 아틀라스11,16을 구축하여 혈관 구조의 미세해부학을 재구성할 수 있게 했습니다. 이러한 세포 및 구조적 연결을 3D로 시각화하면 지금까지 답이 없었던 생물학적 질문에 답할 수 있는 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

본 연구는 지역 및 국가 동물 사용 및 관리 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 노화 중 죽상동맥경화증이 자발적으로 발생하는 표준 설치류 차우 식단을 유지한 C57BL/6J 배경의 고지혈증 수컷 Apoe-/- 마우스를 본 연구에서 사용했습니다.

1. 고립된 대동맥 및 TDE 개간술의 전체 마운트 이미징

  1. 조직 준비
    1. 마우스당 150mg/kg의 케타민과 30mg/kg의 자일라진( 재료 표 참조)으로 마취제를 준비합니다. 복강내 주사로 생쥐를 깊이 마취시키고 심부 통증 테스트에 대한 반응이 없음을 확인합니다.
      참고 : 주입의 농도와 양은 다음과 같습니다 : 케타민 100 mg / mL; 자일라진 20 mg/mL; 주입 부피 50:50 3 μL / g에서 케타민과 자일라진의 부피 혼합물.
    2. 수술용 종이 타월로 덮인 폼 플레이트에 마우스를 놓고 테이프로 팔과 다리를 누운 자세로 고정합니다. 흉부를 75% 에탄올로 소독하고( 재료 표 참조) 1mL 일회용 주사기로 좌심실을 통해 혈액을 채취하여 혈액을 제거하여 더 나은 관류를 위해 혈액을 제거합니다.
      참고: 개흉술을 통한 심장 혈액 채취도 사용할 수 있습니다.
    3. 심장이 드러나도록 가슴의 정중선을 절개하고 심장 관통을 가능하게 하기 위해 우심방을 작게 절개합니다. 좌심실을 통해 인산염 완충 식염수(PBS)에 10mL의 5mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, 재료 표 참조)을 5분 동안 주입한 다음 혈액이 배출될 때까지 5-10분 동안 20mL의 PBS를 관류합니다. 마지막으로 10mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 20분 동안 관류합니다.
      알림: 모든 절차는 실온(RT)에서 100-125mmHg 압력의 연동 관류 펌프로 수행할 수 있습니다. 관류 바늘은 혈액 추출과 동일한 구멍을 통해 마우스 심장에 삽입됩니다.
    4. 수술 도구를 사용하여 비장, 간, 폐, 위장 및 생식 기관을 포함한 내부 장기를 제거합니다. 심장, 대동맥 및 신장을 제자리에 그대로 유지하십시오.
      알림: 장기 해부 및 제거에 사용되는 수술 도구는 해부 가위, 가는 홍채 가위, 스프링 가위, 뭉툭한 집게, 구부러진 집게 및 구부러진 가는 집게입니다.
    5. 상행 대동맥에서 장골 분기점까지의 전체 대동맥을 해부 실체 현미경(30-40배 배율)으로 노출시킵니다. 대동맥에 손상을 입히지 않고 흉선과 지방 조직을 조심스럽게 제거합니다.
      알림: 대동맥을 절단하지 않도록 주의하십시오. Apoe-/- 마우스의 경우, 연결된 구조를 위해 대동맥의 최소 둘러싸인 혈관 주위 지방 조직을 유지하십시오.
    6. 대동맥 전체를 PBS로 채워진 페트리 접시에 수확합니다. 대동맥을 다른 분절로 분리하고 홍채 또는 스프링 가위를 사용하여 전체 대동맥을 세로로 분할하여 TDE 제거를 위해 그림 1A 에 표시된 순서와 방향에 따라 내부 표면을 노출시킵니다.
    7. 그림 1A와 같이 평평한 검은색 왁스 플레이트에 Y자 모양으로 대동맥을 고정합니다. 4 °C에서 하룻밤 동안 4% PFA에 접미사를 붙입니다.
      알림: 다음 단계에서 접히거나 말리는 것을 방지하기 위해 고정하기 전에 대동맥을 왁스 플레이트에 고정하십시오.
    8. 대동맥을 고정하지 않고 PBS로 옮깁니다. 대동맥을 5분, 5회, 꼼꼼하게 씻습니다.
      알림: 세척을 위해 매번 PBS로 채워진 다른 튜브로 대동맥을 옮깁니다.
  2. 안면 대동맥에 대한 항체 염색
    참고: 모든 배양 단계는 2mL safe-lock 튜브에서 RT에서 부드럽게 회전하거나 흔들면서 수행됩니다.
    1. 차단 및 투과화를 위해 고정 대동맥을 차단 용액으로 2시간 동안 전달합니다.
      참고: 차단 용액은 1차 및 2차 항체에 따라 다릅니다. 예를 들어, 차단 용액: 0.5mg/mL CD16/32(1:100), 10% 일반 당나귀 혈청, PBS의 2% Triton X-100( 재료 표 참조)
    2. 위의 차단 용액(단계 1.2.1)의 1차 항체, 예를 들어 CD3e(1:100 희석), NF200(1:200 희석) 및 B220(1:200 희석)과 함께 대동맥을 24시간 동안 배양합니다( 재료 표 참조). PBS에서 대동맥을 5분, 5회, 대동맥 세척합니다.
    3. 10% 정상 당나귀 혈청(1:300 희석) 및 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI, 1mg/mL)의 2차 항체와 함께 대동맥을 배양하여 밤새 핵 염색을 합니다( 재료 표 참조). PBS에서 대동맥을 5분 동안 5회 세척하고 조직 제거 절차가 완료될 때까지 PBS에서 4°C의 대동맥을 보관합니다.
      알림: 세척을 위해 매번 PBS로 채워진 다른 튜브로 대동맥을 옮깁니다. 1.2.3 단계에서 튜브를 어두운 곳에 두기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮으십시오.
  3. TDE 조직 세정력
    참고: 모든 배양 단계는 2mL safe-lock 튜브에서 수행되며 RT에서 부드럽게 회전하고 어두운 곳에서 알루미늄 호일로 덮습니다. TDE( 재료 표 참조) 작업 솔루션은 투과성이 높으므로 흄 후드에서 조심스럽게 다루어야 합니다. 현지 규정에 따라 폐기물을 수거하고 폐기하십시오.
    1. 염색된 대동맥을 20% TDE 작업 용액으로 옮기고 1시간 동안 배양합니다.
    2. 대동맥을 47% TDE 작업 용액으로 옮기고 12시간 동안 배양합니다. 대동맥을 60% TDE 작업 용액으로 옮기고 샘플이 RI와 일치하도록 가시광선에서 투명해질 때까지 24-36시간 동안 배양합니다.
    3. 이미징 때까지 어두운 곳에서 RT에서 60% TDE의 대동맥을 보관합니다.
      참고: 단기 배양 기간(예: 1.3.1단계) 동안 30분마다, 장기 배양 기간(예: 1.3.2단계)의 경우 4시간마다 작업 솔루션을 새로 고칩니다. 각 단계의 배양 시간은 더 나은 항체 침투 또는 투명도를 얻기 위해 조직 크기에 따라 조정할 수 있습니다. 지방 조직으로 둘러싸인 Apoe-/- 마우스 대동맥의 경우 배양 시간을 적절하게 연장해야 합니다.
  4. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용한 TDE 청소 대동맥 이미징
    1. 시중에서 판매되는 두께가 0.2mm인 양면 접착식 직사각형 이미징 스페이서 웰을 사용합니다( 재료 표 참조). 깨끗한 유리 슬라이드에 웰을 붙이고 깨끗한 대동맥을 옮깁니다. en face aortic adventitia가 coverslip을 향하고 있는지 확인하십시오.
      알림: 각진 집게를 사용하여 안면 대동맥의 abluminal 쪽이 위쪽에 오도록 en face aorta를 평평하게 부드럽게 두드립니다. 필요한 경우 조직 크기에 맞게 여러 개의 이미징 spacer well을 쌓습니다.
    2. 60% TDE 용액 방울로 대동맥을 장착합니다. 샘플과 커버슬립 사이에 기포가 생기지 않도록 커버슬립을 웰에 조심스럽게 부착합니다.
      알림: 커버슬립 전에 바늘로 기포를 조심스럽게 제거합니다. s로 과도한 양의 장착 용액을 사용하지 마십시오.ample가 떠다닐 수 있습니다.
    3. 20x 침수(멀티) 대물렌즈(NA: 0.75)가 장착된 반전된 CLSM 기기( 재료 표 참조)를 사용합니다.
      참고: CLSM을 사용하면 대동맥 외막에서 신경 직경과 신경-면역 세포 상호 작용을 분석하는 데 필요한 더 높은 해상도로 최대 70μm 깊이의 체적 이미징을 수행할 수 있습니다.
    4. 20x/0.75 침수(오일) 대물렌즈를 선택합니다. 염색된 염료를 기반으로 하이브리드 다이오드 검출기를 조정합니다. 디스플레이 설정을 조정하고 이미징을 위해 1024 x 1024 픽셀 XY 형식을 선택합니다.
      참고: 오일 침지 대물 렌즈는 물보다 신호를 더 잘 포착합니다.
    5. 이머젼 오일(글리세롤 함유)을 커버슬립의 대동맥을 따라 고르게 떨어뜨립니다. 63x 대물렌즈를 침지 오일/커버슬립에 닿을 때까지 샘플 쪽으로 거칠게 움직입니다.
    6. 63x 대물렌즈를 현미경 아래로 미세하게 움직여 관심 영역을 찾습니다. 3D 이미징을 위해 2-4μm 스텝 크기에서 최대 60μm 깊이까지 안면 대동맥의 외막 쪽에서 Z 스택을 획득합니다.
    7. 샘플 세부 정보를 사용하여 파일 이름을 지정하고, 세부 정보를 스캔하고, 데이터를 저장합니다.
  5. 다광자 현미경을 사용한 TDE 청소 대동맥 이미징
    1. 1.4.1-1.4.2 단계에 따라 슬라이드에 en face 대동맥을 장착합니다.
    2. 20x 대물렌즈(침수, NA: 1.00, 작동 거리 = 2mm)가 장착된 직립 다광자 현미경( 재료 표 참조)을 사용하여 최대 1.5mm 깊이의 체적 이미징을 가능하게 합니다.
    3. 10-15μm 스텝 크기에서 최대 700μm 깊이까지 abluminal 측에서 Z 스택을 획득합니다. 파일 이름을 지정하고 1.4.7단계와 같이 데이터를 저장합니다.

2. 전신 면역염색 및 iDISCO 조직 클리어링

  1. 조직 준비
    1. 마취, 마우스 고정 및 관류를 위해 위의 1.1.1-1.1.3 단계를 따르십시오.
    2. 수술 기구를 사용하여 비장, 간, 폐, 위장 및 생식 기관을 포함한 피부와 내부 장기를 제거합니다. 심장, 대동맥 및 신장을 제자리에 그대로 유지하십시오.
    3. 횡격막 수준 이상으로 신체 부위를 절개하고 4 °C에서 1-2 일 (초) 동안 4 % PFA로 하체 부분을 고정합니다.
      참고: 부드럽게 회전하는 셰이커에서 50mL 튜브에 고정, 세척 및 배양을 수행합니다. 새 튜브에서 용액을 2-3회 새로 고칩니다.
    4. RT에서 10분 3회 샘플을 철저히 세척합니다.
      참고: 대동맥을 매번 PBS로 채워진 다른 튜브로 옮깁니다.
    5. 탈색을 위해 20% 투명하고 방해받지 않는 뇌/신체 이미징 칵테일 및 컴퓨터 분석(CUBIC) 용액에서 48시간 동안 샘플을 배양합니다.
      참고: 20% CUBIC 용액의 경우 Triton X-15 15mL와 Quadrol 28mL에 요소 25g을 용해하고 최종 부피 100mL에 PBS를 추가합니다. 재료가 자극적이므로 후드에서 준비하십시오( 재료 표 참조).
    6. RT에서 PBS에서 1시간 동안 샘플을 5회 철저히 세척합니다.
  2. 항체 염색
    참고: 모든 배양 단계는 50mL safe-lock 튜브에서 4°C에서 부드럽게 회전하거나 흔들면서 수행됩니다.
    1. 투과화 및 차단을 위해 PBS-gelatin-Triton X-100-serum (PGST) 용액에서 샘플을 밤새 배양합니다.
      참고: 차단 용액은 항체에 따라 다릅니다. 예를 들어, 차단 용액: PBS-젤라틴-트리톤 X-100-혈청(PGST, 재료 표 참조) 용액: PBS에 함유된 0.2% 돼지 피부 젤라틴, 0.5% 트리톤 X-100 및 5% 염소 혈청.
    2. PGST 용액(예: NF200(1:200 희석, 재료 표 참조))의 1차 항체와 함께 샘플을 4°C에서 배양하고 10-12일 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 RT에서 1시간 5회 PGST로 샘플을 철저히 세척합니다.
    3. 2차 항체 용액(1:300 희석) 및 DAPI(1mg/mL)를 PGST에서 4°C에서 7일 동안 시료를 배양합니다.
    4. PGST에서 샘플을 RT에서 1시간 5회 철저히 세척합니다. 샘플을 PBS로 옮기고 추가 단계를 위해 4°C의 PBS에 대동맥을 보관합니다.
      알림: 튜브를 알루미늄 호일로 덮어 2.2.3-2.2.4 단계 동안 어둡게 유지하십시오.
  3. 변형된 iDISCO 조직 세정력
    알림: 청소하는 동안 튜브는 직접적인 자연광/인공 조명 노출로 인한 신호 표백/담금질을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 덮어야 합니다. DISCO 세척에 사용되는 모든 유기 시약은 유해하며 모든 세척 단계는 흄 후드에서 수행해야 합니다. 시약을 다룰 때는 실험실 가운, 장갑, 마스크를 착용하여 흡입하거나 피부와 눈과의 접촉을 피하십시오. 깨끗한 폐기물을 모아 후드의 적절한 폐기물 용기에 버리십시오.
    1. 2.2.4단계에서 염색된 샘플을 탈수를 위한 일련의 증가된 농도의 테트라하이드로푸란(THF, 재료 표 참조) 작업 용액, 즉 50%, 70%, 90% 및 100%(2배 100%)로 옮깁니다. 농도당 12시간 동안 배양합니다.
      알림: THF 시약(99%-100%)을 증류수에 희석하여 후드에서 다른 농도의 작업 용액을 만듭니다. 6시간마다 작업 솔루션을 새로 고칩니다.
    2. 지질 제거를 위해 샘플을 절대 디클로로메탄(DCM, 재료 표 참조) 용액으로 3시간 동안 옮깁니다.
    3. 샘플을 RI 매칭 벤질-알코올-벤질-벤조에이트(BABB) 작업 용액으로 옮깁니다( 재료 표 참조). 조직이 반투명하고 가시광선에서 대부분 투명해질 때까지 3-6시간 동안 배양합니다.
      알림: BABB 작업 용액을 준비하려면 유리병에 벤질 알코올 1부와 벤질 벤조에이트 2부(1:2)를 혼합합니다. 후드에서 5분 동안 부드럽게 흔듭니다.
  4. 광시트 현미경을 사용한 iDISCO 투명 조직 이미징
    참고: 최적의 투명도가 달성되는 즉시 클리어링된 샘플을 이미지화하십시오. 이미징에는 ultramicroscope-II( 재료 표 참조)와 같은 광시트 현미경이 사용됩니다. 이미징 저장소를 최종 세척 용액인 BABB 용액으로 채웁니다. 악기 손상을 방지하기 위해 악기에 BABB를 흘리지 않도록 주의하십시오.
    1. 전체 샘플의 전체 너비를 커버하는 저배율 이미지를 위해 1x air objective를 사용합니다. 종이 천에 세척 용액의 샘플을 부드럽게 옮기고 곧 말리십시오.
      알림: 샘플을 쥐어짜지 않도록 뭉툭한 집게를 사용하십시오.
    2. 샘플/조직 크기에 따라 적절한 크기의 샘플 홀더를 선택하고 샘플의 뒷면을 초강력 접착제로 샘플 홀더에 부착합니다.
      알림: s까지 1-2분 동안 기다립니다.ample 홀더에 단단히 부착되어 있습니다.
    3. 광시트 현미경의 이미징 저장소에 BABB 용액을 채우고 샘플을 부드럽게 넣습니다. 샘플 홀더를 조정하여 샘플이 라이트 시트에 수직이고 적절하게 조명되도록 합니다.
    4. 대물렌즈를 낮추어 샘플에 초점을 맞추고 초점을 맞추는 동안 디스플레이 설정을 조정하여 view 샘플을 제대로 . 현미경 소프트웨어에서 적절한 광 시트를 선택하고 너비를 조정하여 전체 시야를 균일하게 비춥니다.
      알림: 양면 레이저 조명이 있는 초현미경 시스템에서는 레이저를 한쪽에 정렬하고 초점을 맞추는 것으로 시작합니다. 양쪽이 설정되면 양쪽 레이저를 활성화하여 두 조명에서 병합된 스캔 이미지를 관찰합니다.
    5. NF200으로 염색된 신경 세포를 이미지화하려면 원적외선 채널(680nm)을 선택하고, 염색되지 않은 대동맥 및 결합 조직을 이미지화하려면 자가형광 채널(488nm)을 선택합니다. 최적의 신호 대 잡음비, 노출 시간 및 광 시트의 너비를 위해 형광 신호 강도에 따라 레이저 출력을 조정합니다.
    6. x-y-z 스캔 모드를 선택합니다. 2-8 μm의 z-단계로 z-stack 스캔을 설정하고 샘플의 복부 및 등쪽 표면을 덮는 타일 스캔(16비트)의 세로 y축을 따라 25%-60% 중첩을 선택하여 전체 샘플 부피(최대 6-8mm 깊이)를 이미지화합니다.
    7. 스캔 날짜, 샘플 이름, 사용된 항체, 대물렌즈, 확대/축소 계수, z-스텝 및 사용된 레이저를 포함한 자세한 정보와 함께 스캔의 이름을 지정합니다. 데이터를 저장합니다.
    8. 확대 기능을 통해 더 높은 배율(2배 또는 4배)로 변경하여 관심 있는 특정 신체 영역을 이미지화할 수 있습니다.
    9. 이미징을 위해 위의 2.4.4-2.4.7 단계를 수행하고 데이터를 저장합니다.

3. 이미지 처리 및 분석

참고: 처리를 위해서는 고출력 처리 워크스테이션이 필요합니다. 많은 양의 이미징(이미지당 5-100GB)으로 인해 처리 직후 데이터 백업을 보장합니다.

  1. CLSM 및 다광자 이미지의 이미지 처리
    1. CLSM 및 다광자 현미경의 Z-stack 타일 이미지를 3D 및 2차원(2D) 시각화, 세분화 및 정량화를 위해 Las X, Imaris(이미지 분석 소프트웨어) 또는 Fiji 소프트웨어가 장착된 이미지 처리 워크스테이션으로 로드합니다.
    2. 세포 또는 구조의 부피 깊이를 색상으로 구분하려면 이미지 복원 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 원시 이미지를 디콘볼루션하고 Las X 또는 Fiji에서 시간 색상 코딩을 사용하여 디콘볼루션된 데이터의 최대 강도 프로젝션을 생성합니다.
  2. 광시트 이미지의 이미지 처리
    1. Z-stack 타일식 TIFF 이미지 시리즈를 Fiji 소프트웨어에 로드합니다. 피지의 스티칭 플러그인으로 이미지를 스티치하고 스티치된 이미지를 TIFF 형식으로 저장합니다.
      참고: 필요한 경우 스티칭된 이미지를 LZW 형식으로 압축하여 다른 소프트웨어로 빠르게 처리할 수 있습니다.
    2. 이미지 분할을 위해 스티칭된 이미지를 3D 시각화 소프트웨어( 재료 표 참조)에 로드합니다. x-y-z 축에서 신경 세포와 혈관 구조를 수동으로 추적합니다. 작은 신경 섬유를 수동으로 추적하려면 대동맥과 신경절 사이의 신경 섬유의 전체 경로를 따라 모든 z 평면에서 NF200+ 신호를 픽셀 단위로 수동으로 선택합니다.
    3. 전처리된 이미지를 이미지 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)에 로드하여 이미지의 비디오 생성, 2D 및 3D 시각화를 수행할 수 있습니다.
    4. 자가형광을 사용하여 이미지 분석 소프트웨어에서 림프절과 근육을 포함한 대동맥 및 결합 조직을 분할합니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 별도의 pseudocolors를 적용하여 대동맥 벽 및 플라크와 같은 뚜렷한 대동맥 분절을 시각화합니다.
    5. 피지 소프트웨어의 CLAHE(contrast-limited adaptive histogram equalization) 기능을 사용하여 처리된 이미지의 배경에 대한 로컬 대비를 향상시킬 수 있습니다.

결과

손상되지 않은 건강한 대동맥과 병든 대동맥의 미세해부학적 구조를 입증하고 죽상동맥경화증의 마우스 모델에서 면역계, 신경계, 심혈관계의 물리적 연결성을 밝히기 위해 두 가지 상보적인 조직 정화 접근법, 즉 분리된 대동맥의 TDE 투명화와 전체 마우스의 iDISCO 투명화를 사용했습니다(그림 1). 전체 마운트 면역염색 후, 대 동맥은 일련의 TDE 작업 솔루션으로 제거되었습니다. RI는 최종 단계의 TDE 농도에 따라 1.4-1.5에서 일치하여 부피를 변경하지 않고 대동맥 조직의 최적 투명도를 달성합니다(그림 1A). TDE 투명화와 달리, iDISCO 투명화 프로토콜에는 전체 마운트 면역염색 전 탈색 및 투과화 단계가 포함되며, 그 다음에는 다양한 화학 용매를 사용한 탈립화 및 탈수, 1.56에서 RI 정합이 포함됩니다(그림 1B). iDISCO 클리어링을 사용하면 조직의 수축으로 인해 큰 조직과 전체 마우스 본체를 시각화할 수 있습니다.

TDE 투명 전체 마운트 en face 대동맥의 컨포칼 및 다광자 3D 이미징을 통해 다른 구조 중에서 내막 플라크, 외막 세포성 및 외막 신경 돌기를 포함한 구조를 시각화할 수 있는 반면, iDISCO 투명 마우스의 광시트 이미징을 통해 혈관 주위 지방 조직, 신장 림프절 및 신경 및 신경절을 포함한 관련 신경 구성 요소와 함께 동맥 나무를 시각화하고 복원할 수 있습니다(그림 1C)을 사용합니다. 예를 들어, TDE가 제거된 죽상경화성 대동맥의 컨포칼 이미징은 플라크에서 여러 CD3e 염색 T 세포를 검출하고 ATLO에서 서로 다른 직경의 NF200 염색 신경 섬유의 광범위한 신생을 감지한 반면, TDE의 다광자 이미징은 노화된 Apoe-/- 마우스에서 전체 마운트 질환 복부 대동맥을 제거함으로써 ATLO 내 B220 음성 T 세포 영역에서 NF200 발현 축삭돌기의 영역성을 보여주었습니다(그림 2A). 반대로, iDISCO의 광시트 이미징은 전체 생쥐 복부를 청소하여 대동맥과 인접한 교감신경절 사이의 공간적 관계를 시각화했습니다. 신경절에서 대동맥 표면까지의 개별 축삭돌기의 3D 이미지 분할 및 추적은 죽상동맥경화성 플라크에 인접한 대동맥 외막에서 새로 형성된 NF200 염색된 축삭돌기를 포함하여 강력한 신경 재구조화를 보여주었습니다(그림 2B).

figure-results-1
그림 1: 연구의 작업 흐름. (A) en 직면 대동맥의 수성 기반 TDE 청소. (B) 전체 마우스의 솔벤트 기반 iDISCO 투명화. (C). 3D 광학적으로 투명화된 분리된 대동맥 또는 전체 마우스 샘플의 체적 이미징 및 이미지 처리. 이 그림은 Sun et al.17의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: TDE 및 iDISCO 투명화 조직의 3D 이미지 예.(A) TDE 투명화 대동맥의 3D 이미징. 상단 패널: 컨포칼 이미지는 내막 플라크에서 CD3e+ T 세포(빨간색, 화살표)와 죽상경화성 대동맥 외막증(ATLO)에서 NF200+ 신경 축삭돌기(녹색)를 보여주었습니다. 하단 패널: 다광자 이미지는 78주 된 수컷 Apoe-/- 마우스의 ATLO에서 NF200+ 신경 축삭돌기(녹색, 화살촉), B220+ B 세포(빨간색, 열린 삼각형), 콜라겐 유래 2차 조화 생성(SHG, 흰색)을 보여주었습니다. Sytox(파란색)와 DAPI(파란색)가 핵을 보여주었습니다. (B) iDISCO의 3D 재구성 및 분할 이미지는 전체 마우스 복부를 청소했습니다. NF200+ 신경 및 축삭돌기(화살표, 녹색)의 광시트 3D 재구성, 분할 및 추적과 온전한 복부 대동맥의 교감신경절(화살촉)과의 공간적 관계. 열린 삼각형은 죽상경화성 플라크에 인접한 새로 형성된 축삭돌기를 나타냅니다. 자가형광(auto)은 플라크(청록색) 및 신장 림프절(RLN, 파란색)을 포함한 대동맥 및 결합 조직을 이미지화하는 데 사용되었습니다. CG, 셀리악 신경절, SycG, 교감 사슬 신경절. 이 수치는 Mohanta et al.6 및 Sun et al.17의 허가를 받아 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

죽상동맥경화증은 동맥벽의 3층을 모두 포함하는 동맥의 경벽적 염증성 질환으로 볼 수 있습니다. 또한 동맥은 혈관 주위 지방 조직과 신경 조직으로 둘러싸여 있습니다. 죽상동맥경화증이 진행되는 동안 이러한 각 조직은 상당한 세포 및 구조적 변화를 겪으며, 이는 건강한 동맥과 병든 동맥을 둘러싼 온전한 조직에 대한 세포 내 광학적 접근을 획득하는 방법을 필요로 합니다. 이러한 방법은 세포-세포 및 세포-조직 상호 작용을 더 잘 이해하고 심혈관 질환 발병에 대한 이해를 증진하기 위해 여기에 제공됩니다. 조직 제거 및 후속 3D 현미경 이미징을 통해 지금까지 접근할 수 없었던 온전한 조직 구획을 대규모로 이미징하여 동맥의 상세한 재건을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 TDE 및 iDISCO 조직 투명화 기술에 대한 프로토콜을 소개하며, 거의 완전한 조직 투명도, 공초점/다광자 또는 광시트 현미경을 통한 효율적인 이미징, 동시에 구조적 무결성 유지를 달성하는 데 있어 효과와 단순성을 강조합니다.

TDE 투명화는 수용성 시약을 사용하여 RI를 조정하여 조직 투명도를 달성함으로써 조직의 형광 신호를 효과적으로 보존합니다. 이는 조직 수축 없이 마이크로미터에서 밀리미터 크기의 조직 부피인 더 작은 크기의 혈관을 위한 효율적인 조직 제거 방법을 나타냅니다. 그러나 더 큰 조직, 즉 밀리미터에서 센티미터 크기의 조직 부피의 경우 처리 시간이 더 오래 걸립니다. 중요한 것은 시약의 농도와 배양 시간을 조정하여 사용자의 필요에 맞게 절차를 조정할 수 있다는 것입니다. 반면에 iDISCO는 일련의 유기 용제를 사용하여 지질과 수분을 제거함으로써 더 큰 조직, 전체 장기 또는 전체 마우스 또는 더 큰 인간 조직의 조직 투명도를 향상시킵니다. 짧은 처리 시간과 큰 조직 볼륨에 대한 적합성이라는 고유한 이점을 제공합니다. 그러나 이는 투명화된 샘플의 수축, 형광 신호의 소멸 및 지질의 제거로 이어지며, 이는 지질이 풍부한 죽상경화성 조직의 주요 제한 사항입니다. 또한 광시트 현미경은 컨포칼 또는 다광자 현미경과 달리 마이크로미터 수준에서 세포 내 세부 사항을 시각화할 수 없으며 단일 축삭 및 다른 혈관 세포와의 연결과 같은 작은 직경의 신경 투영을 시각화할 수 없습니다.

혈관 신경 분포는 죽상동맥경화증의 발병에 중요한 역할을 합니다 6,7,18. 동맥 나무를 따라 말초 신경의 분포와 그 변화를 조사하면 질병 진행을 이해하는 데 도움이 될 것입니다. 효율적인 처리 능력으로 인해 iDISCO는 쥐와 생쥐의 죽상동맥경화증 모델에서 전체 혈관 네트워크 이미징에 일반적으로 사용되며12,19,20,21 고해상도 3차원 이미지를 제공합니다. 반면에 TDE는 특정 신경 세포 마커를 관찰하는 것과 같이 형광 표지의 보존이 필요한 연구에 적합하여 혈관 신경 분포의 미세한 구조와 변화를 정확하게 밝힙니다6. TDE 투명화는 수축을 포함하지 않고 지질을 이미지화할 수 있는 반면, iDISCO는 탈수 및 탈지질로 인해 조직을 축소하기 때문에 두 조직 투명화 프로토콜이 모두 필요합니다. 또한, 변형된 iDISCO 프로토콜은 인간 심혈관 조직의 조직 투명화에 사용할 수 있습니다22,23. 두 가지 정화 기법 모두 죽상동맥경화증의 동맥 재형성을 연구하는 데 보완적인 이점을 제공합니다. 두 방법의 장점을 결합함으로써 죽상동맥경화증의 병리학적 메커니즘에 대한 보다 포괄적이고 심층적인 이해를 달성할 수 있습니다.

공개 사항

SKM, CJY 및 AJRH는 Easemedcontrol R &D GmbH 및 Co. KG의 공동 설립자입니다.

감사의 글

이 연구는 독일연구재단(DFG) SFB1123/Z1, 독일 심혈관 연구센터(DZHK) DZHK 81X2600282, SKM에 대한 코로나 재단 보조금(S199/10087/2022)의 지원을 받았습니다. 및 ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 및 Easemedcontrol R &D GmbH 및 Co. KG의 AJRH에 대한 정부 보조금.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,2'-티오디에탄올 (TDE)시그마 166782맑게 하는 시약
AmiraThermo Fisher Scientific3D 시각화 소프트웨어; 3D 이미지에서 수동 분할 및 추적에 사용되는 이미지 처리 소프트웨어
벤질 알코올시그마 W213713청산 시약
벤질 벤조에이시그마B6630청산 시약
CD16/32eBioscience14-0161-82차단 용액
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 Leica MicrosystemsTCS-SP8 3X이미징 장치는 세포 내 해상도에서 특이성이 높은 온전한 생물학적 조직 또는 절편의 다차원 고해상도 이미징을 위한 장치입니다.
DAPIInvitrogenD3571핵 마커
디클로로메탄(DCM)시그마 270997청산 시약
해부 팬-블랙 왁스 써모 사이언티픽 S17432대동맥 박리 및 고정 
해부 실체현미경Leica Microsystems Stemi 2000쥐 장기 해부
에탄올 시그마E7023탈북 
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)로스 8040.1관류 완충액 
피지 (ImageJ, NIH)2D 및 3D 이미지를 위한 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어
염소 안티-햄스터 IgG, Cy3Dianova 127-165-0992차 항체
염소 항-토끼 IgG, Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-211092차 항체 
염소 항-쥐 IgG, Cy5Dianova712-175-1502차 항체
햄스터 항-CD3e BD 바이오사이언스145-2C11 Pan-T 세포 마커
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging, 네덜란드버전 19.10이미지 복원 소프트웨어; 주로 2D 및 3D 이미지의 디콘볼루션에 사용되는 이미지 처리 소프트웨어
이미지 처리 워크스테이션MIFCOM 공초점, 다광자 및 광시트 현미경으로 획득한 이미지의 후처리를 위한 Leica 애플리케이션 제품군 X, Fiji 및 Imaris를 포함한 모든 이미지 처리 소프트웨어가 장착된MIFCOM X5
ImarisBitplane버전 8.4이미지 분석 소프트웨어; 3D 이미지의 자동 분할에 사용되는 이미지 처리 소프트웨어
인큐베이터 및 로테이터 마샬 사이언티픽 Innova 4230조직
세척 중 배양 및 회전 장치 
iSpacerSunjin LabIS4020직사각형 우물 샘플 홀더
KetamineLivisto마취
Leica 응용 프로그램 제품군 X (LAS-X) Leica Microsystems버전 3.5Leica 현미경으로 획득한 이미지를 위한 이미지 처리 소프트웨어
광학 현미경Leica MicrosystemsDM LB밝은 파일 이미징을 위한 이미징 장치
라이트 시트  현미경LaVision BioTechUltramicroscope II얇은 광학 절편의 이미지를 빠르게 획득하여 낮은 광 노출로 대형 생물학적 표본 또는 전체 마우스의 빠른 고해상도 이미징을 위한 이미징 기술입니다.
다광자 현미경 LeicaMicrosystemsTCS-SP5II MP 장기간에 걸쳐 세포 내 및 분자 수준에서 온전하고 생존 가능한 생물학적 조직을 최소한의 침입으로 샘플 깊숙이 다차원적으로 고해상도로 이미징하기 위한 이미징 방식
일반 염소 혈청 SigmaG9023블로킹 솔루션
파라포름알데히드(PFA) 시그마 P-6148 고정 
인산염 완충 식염수 (PBS)Sigma P4417-100탭 세척 버퍼
돼지 피부 젤라틴시그마 G1890인큐베이션 버퍼
QuadrolSigma122262CUBIC 클리어링 시약
Rabbit Anti-NF200SigmaN4142Pan-neuronal marker
Rat Anti-B220 BD BioscienceRA3-6B2Pan-B 세포 마커
설탕시그마 90M003524V 탈수 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380핵 마커
TetrahydrofuranSigma 401757세척 시약 
트리톤 X-100로스 3051.1침투
요소시그마 U5128큐빅 클리어링 시약
자일렌 피셔 케미컬 x/0250/17 마취제 
트 이미지 처리 워크스테이션.

참고문헌

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