이 프로토콜은 표재성 방광암의 정소성 모델을 구성하기 위한 고유한 방법을 설명합니다.
방법 논문
Establishing a Murine Superficial Bladder Cancer Model via an Intravesical Cell Administration 기법
이 논문에서
요약
초록
본 연구는 높은 효율성과 정밀한 종양 국소화로 정소성 쥐 방광 종양 모델을 확립하기 위한 혁신적인 방법을 제시합니다. 누운 자세로 암컷 C57BL/6J 마우스를 마취한 후 24G 정맥 주사 바늘을 방광에 삽입하여 내용물을 배출합니다. 그런 다음 34G의 디스펜싱 바늘을 카테터에 삽입하고 5회 회전시켜 방광 돔 점막에 국소 손상을 입힌 다음 제거합니다. MB49 셀 현탁액은 흡인되어 카테터를 통해 방광에 삽입되는 30G 디스펜싱 바늘에 연결됩니다. 종양 세포는 압력을 받아 방광에 점막하 주입됩니다. 이 기술은 마우스에 대한 외상을 최소화하고, 종양 채취율이 높으며, 종양 위치를 고정시킵니다. 단순성과 뛰어난 재현성이 특징입니다. 이 모델은 방광암에 대한 방광 내 치료법을 개발하기 위한 이상적인 실험 플랫폼을 제공하여 이 악성 종양에 대한 치료 전략의 발전 및 최적화를 촉진합니다.
서론
방광암은 전 세계적으로 상당한 건강 부담을 안고 있으며, 발병률과 예후에서 성별에 따른 불균형이 두드러집니다. 이 악성 종양은 각각 다양한 병원성 경로와 관련된 뚜렷한 분자 아형을 특징으로 합니다. 비근육 침습성 방광암(Non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)과 근육 침습성 방광암(muscle-invasive bladder cancer, MIBC)은 분자 및 병리학적 특징에 큰 차이가 있습니다1,2. NMIBC는 사례의 약 75%를 차지하며, 전이 또는 전이 없이 국소적으로 남아 있는 이행기 상피 기원의 종양을 특징으로 합니다. 반대로, MIBC는 암세포가 방광의 근육층으로 침투하는 것이 특징이며, 전파 위험이 높아 임상 실습에서 방광 절제술이 필요한 경우가 많습니다3.
전임상 연구에서 질병의 표재성 단계를 정확하게 나타내는 모델은 약물 요법을 평가하는 데 필수적입니다. 따라서 표재성 방광 상피내암 모델의 확립은 임상 약물 개발 및 혁신적인 점안 요법을 위한 중요한 연구 도구 역할을 하는 매우 중요합니다.
쥐 정소성 방광암 모델의 개발은 전통적으로 어려움에 직면해 왔습니다. 화학적으로 유도된 모델은 종종 표재성 종양으로 시작하지만 침습적 형태로 발전할 수 있으며, 가변성으로 인해 대규모 실험에서의 유용성이 제한될 수 있다4. 방광벽5을 통해 종양 세포를 주입하는 데 의존하는 전통적인 정소성 이식 모델은 표재성 방광암을 충실하게 재현하는 데 어려움을 겪습니다. 종양세포 점안6,7,8,9,10과 결합된 점막 손상을 포함한 대체 방법이 시도되었지만 높은 사망률과 낮은 종양 채취율로 인해 제한적이어서 광범위한 적용에 방해가 되고 있습니다.
본 연구는 기존 모델에 비해 안정성이 높고, 사망률이 낮으며, 종양 위치가 고정된 표재성 방광암 모델을 구축하기 위한 새로운 방법을 개발하는 것을 목표로 한다. 현재 모델은 초기 단계에서 질병을 보다 정확하게 표현함으로써 예방 및 치료 개입에 대한 엄격한 평가를 강화하여 방광암 치료를 발전시킬 준비가 되어 있습니다.
프로토콜
모든 동물 실험 프로토콜 및 절차는 중국 톈진시 톈진 의과대학 동물실험윤리검토위원회(승인번호 SYXK: 2020-0010)의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 6주에서 8주 된 암컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 동물들은 12시간의 명암 주기, 21-25°C 범위의 온도, 30%-70% 사이의 조절 가능한 습도 수준, 달리 명시되지 않는 한 음식과 물에 대한 제한 없는 접근을 포함하여 통제된 환경 조건에서 수용되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 세포 준비
- 최적의 성장을 지원하기 위해 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 완전한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 쥐 방광암 세포주 MB49를 배양합니다.
- 37°C의 표준 조건에서 5% CO2가 있는 가습 인큐베이터에서 세포 배양을 유지합니다. 세포 건강과 생존력을 보장하기 위해 2-3일마다 배지를 새로 고칩니다.
- 표준화된 트립신 분해 절차를 사용하여 세포를 수확합니다. 트립신을 바르고 짧은 기간 동안 배양한 후 배양 플라스크에서 세포를 제거하기 위해 부드럽게 피펫팅합니다.
- 정확한 세포 밀도를 결정하기 위해 혈구계를 사용하여 수확된 세포를 계수합니다. 인산염 완충 식염수(PBS)에서 세포를 2 x 103/μL로 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 세포 생존력을 유지하기 위해 이 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오.
2. 동물 준비
- 그룹은 생쥐(케이지당 5마리의 마우스)를 개별적으로 환기가 되는 폴리카보네이트 케이지에 수용합니다.
- 연구를 시작하기 전에 7일 동안 마우스가 적응하도록 합니다.
3. 동물 정소성 종양 모델 생성
- Avertin의 2.5% 용액을 사용하여 복강내 주사를 통해 마우스에 마취를 투여합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
- 깊이가 증가함에 따라 호흡수가 감소하고, 눈꺼풀 및 각막 반사가 없으며, 근육 긴장도 및 반사 반응이 감소하고, 꼬리 꼬집기에 대한 반응이 없는 것으로 알 수 있듯이 마우스가 수술을 위한 적절한 마취 수준에 도달할 때까지 기다립니다.
- 마취된 마우스를 누운 자세로 배치하여 절차를 용이하게 합니다.
- 요도 카테터 삽입 절차를 위해 바늘 탐침을 제거한 상태에서 24G 정맥 카테터를 사용합니다. 카테터에 충분한 윤활제를 바르면 불편함을 최소화하고 부드러운 삽입이 가능합니다.
- 외음부 주름 바로 뒤쪽과 질 앞쪽에 위치한 요도를 확인하고 마우스를 누운 자세로 유지합니다.
- 치골 아래를 탐색하기 위해 45도 각도로 요도에 접근하여 카테터 삽입을 시작합니다. 카테터가 요도를 통해 방광으로 들어갈 수 있도록 더 얕은 각도로 조정합니다.
- 저항에 과도한 힘을 가하면 요도 또는 방광 천공이 발생할 수 있으므로 피하십시오. 카테터 내의 소변을 확인하여 방광 내강 내에서 카테터의 위치를 확인합니다.
- 방광에서 소변이 배출되는 것을 용이하게 하기 위해 마우스의 하복부에 부드럽게 압력을 가합니다. 절차의 후속 단계를 준비하기 위해 방광을 완전히 비웠는지 확인하십시오.
- 24G 정맥 카테터를 방광 위쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 카테터의 끝이 방광의 정점에 닿도록 합니다.
- 접촉이 확인되면 카테터를 풀어 약간 수축시킵니다. 카테터를 마우스에 대해 고정된 위치에 유지하여 안정성을 보장하고 이탈을 방지하십시오.
- 24G 카테터를 따라 변형된 34G 분배 바늘을 삽입합니다. 바늘이 방광 상단에 도달할 때까지 바늘을 전진시킵니다.
- 위치를 잡은 후 바늘을 6번 회전하여 방광 정점에 국소 점막 손상을 만듭니다. 회전을 완료한 후 카테터를 따라 바늘을 조심스럽게 빼냅니다.
- 30G 디스펜싱 바늘을 1mL 주사기 상단에 연결합니다. 바늘과 주사기가 단단히 연결되었는지 확인하십시오.
- 연결되면 플런저를 부드럽게 당겨 사전 준비된 2 x 10³/μL MB49 세포 현탁액을 주사기에 주입합니다. 세포 현탁액이 기포 없이 주사기로 흡인되었는지 확인합니다.
- 24G 카테터를 따라 30G 분배 바늘을 삽입합니다. 바늘이 카테터 내에 올바르게 정렬되고 고정되었는지 확인하십시오.
- 위치가 설정되면 1mL 주사기의 플런저에 압력을 가하여 내용물을 주입합니다(1단계에서 준비). 플런저에 대한 압력을 60초 동안 일정하게 유지하여 내용물이 현저한 부피 감소 없이 전달되도록 합니다.
- 60초 후 카테터에서 주사기와 30G 분배 바늘을 조심스럽게 빼냅니다.
4. 수술 후 모니터링
- 마취된 마우스를 오른쪽 반사가 돌아올 때까지 가열 패드에 누운 자세로 놓습니다.
- 동물이 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 않도록 하십시오.
- 동물이 완전히 회복될 때까지 동물을 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오.
결과
점막하 주사의 효능은 초기에 Trypan Blue의 투여를 통해 평가되었습니다. 주입 후, 점막하층 내 염료의 분포를 명확하게 시각화하여 주입된 물질의 정확하고 통제된 전달을 확인했습니다(그림 1).
종양 발생을 꼼꼼하게 추적했습니다. 이식 후 약 14일 후, 방광 종양을 나타내는 심각한 증상인 혈뇨의 현저한 발병이 관찰되었습니다. 종양은 방광의 점막하층 내에 단단히 확립된 것으로 확인되었습니다. 이러한 종양의 초기 성장 패턴은 NMIBC의 분류와 일치하는 광범위하고 비침습적인 확장이 특징이었습니다. 조직학적 검사에서 종양이 점막하층에 국한되어 있는 근육 침범이 없는 것으로 확인되어 NMIBC의 기준과 일치했습니다(그림 2).
거시적 관찰은 종양 형성 과정을 더욱 확증했습니다. 종양은 시각적으로 뚜렷했으며, 다양한 크기와 모양으로 유두 성장을 보였습니다(그림 3). 또한 종양이 상대적으로 느리게 성장하여 실험 연구를 위한 충분한 시간을 제공했습니다(그림 4).
이 연구에서는 종양의 위치와 요도 파종의 부재를 확인하기 위해 MB49-luc 세포를 사용하여 이식한 다음 소동물 이미징을 수행했습니다. 그림 5 는 종양세포 주입 후 35일 후에 촬영한 체내 생물발광 이미지를 보여주며, 종양이 요도와 같이 이소성 파종의 증거가 없는 방광에 위치하고 있음을 명확하게 보여줍니다.
종양 조직은 일반적으로 이식 후 14일 후에 검출할 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면 생쥐의 70% 이상이 14일째까지 혈뇨를 보입니다. 이 절차는 일반적으로 사망률을 초래하지 않습니다. 개입이 없으면 60일째가 되면 안락사가 필요하게 됩니다. 안락사 기준에는 무기력증, 악액질, 주름진 털, 구부정, 무반응 행동 또는 초기 체중의 ≥20% 감소가 포함됩니다.
그림 1: 트리판 블루를 사용한 점막하 주사의 효능. Trypan Blue를 사용한 점막하 주사 효능 입증. 화살표는 PBS로 세 번 세척한 후에도 잔류 Trypan Blue가 보이는 주입 부위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 종양 이식의 조직학적 확인. H&E 염색을 통한 점막하 내 종양 이식의 조직학적 확인. 눈금 막대 : 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 방광 종양의 직접 시각화. 방광 종양의 직접적인 시각화, 종양 기저부에서 명백한 혈관 증식을 강조합니다. 눈금 막대: 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 착상 후 35일째의 종양 상태. 이식 후 35일째 종양 상태 평가. 종양 기저부의 방광 벽은 광범위하게 광범위한 종양 기저부를 동반한 혈관이 확장되고 무질서한 모습을 보입니다. 눈금 막대: 2mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 방광암의 생체 내 생물 발광 영상.MB49-LUC 방광암 세포 이식 후 35일 후 마우스의 생체 내 발광 이미지. 이미지는 형광 강도를 나타내기 위해 색상으로 구분되어 있으며, 빨간색은 높은 형광(높은 종양 활성)을 나타내고 파란색은 낮은 형광(낮은 종양 활성)을 나타냅니다. 종양에 특이적인 생물 발광 신호를 정량화하기 위해 방광 영역에서 관심 영역(ROI)을 선택했습니다. 결과는 종양이 요도와 같이 이소성 파종의 증거 없이 방광에 국한되어 있음을 보여줍니다. 낮은 신호 영역은 조직을 관통하는 고강도 영역의 산란 신호 때문일 수 있으며 반드시 종양 세포의 존재를 나타내는 것은 아닙니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 암세포의 방광 내 투여 다이어그램. 표재성 방광암의 정형소 모델을 구축하기 위한 암세포의 방광 내 투여에 대한 개략적인 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 수정된 디스펜싱 바늘의 구성. 24G 카테터 내에서 수정된 분배 바늘의 구성. (A) 24G 카테터 내에 있는 34G 분배 바늘의 사진. (B) 24G 카테터 내 30G 분배 바늘 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
토론
방광암에 대한 연구는 기초 및 응용 연구 모두에 필수적인 동물 모델에 의존합니다. 종양 성장 환경을 더 잘 모방하기 위해, 정소성 방광 종양 모델은 피하 종양 모델에 비해 우수한 접근법을 제공한다11.
현재 정형소 방광암 모델은 실험 목적에 따라 크게 두 가지 유형으로 분류할 수 있는데, 하나는 환자 유래 이종이식(PDX) 모델1 및 세포주 유래 이종이식(CDX) 모델5과 같이 면역결핍 마우스를 활용하는 모델이고, 다른 하나는 공생착 모델12과 같은 면역 능력이 있는 마우스를 사용하는 모델이다.
PDX 모델은 환자 유래 종양 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하여 화학 요법 약물에 대한 종양의 반응을 개인화하여 평가할 수 있도록 합니다. 그러나 이 쥐에서 온전한 면역 체계가 없다는 것은 면역 관련 메커니즘을 연구하는 데 상당한 한계를 나타냅니다. 마찬가지로, 인간 유래 종양 세포주를 사용하는 CDX 모델은 종양 형성률이 높지만 면역 미세환경이 없다는 단점이 있습니다5.
면역 능력이 있는 마우스의 경우, 정소성 방광 종양을 구성하는 주요 방법은 쥐 유래 MB49 세포주를 방광 벽에 주입하여 상피내 방광 종양을 형성하는 것입니다12. 이 시술에는 종양 세포의 개복술 및 방광 내 주입이 필요하며, 이는 잠재적인 종양 세포 누출 및 바늘관 파종과 같은 문제를 야기합니다. 결과적으로, 표재성 방광 종양을 생성하기가 어려우며, 이는 인간 방광암이 비근육 침습 단계에서 근육 침습 단계로 진행되는 과정을 정확하게 재현하는 데 방해가 됩니다13.
표재성 정소성 방광 종양을 확립하기 위해 전통적인 모델링 기법은 일반적으로 산-염기 용액 또는 전기 소작술과 같은 약물을 사용하여 점막 손상을 유도한 다음 2시간 이상의 보존 시간으로 종양 세포 현탁액을 방광 내 점안하는 것을 포함합니다 8,14. 그러나 이러한 방법론에는 몇 가지 중요한 제한 사항이 있습니다. 첫째, 방광 내 종양 임플란트의 수와 위치의 균일성을 보장하지 못하여 모델의 재현성을 손상시킵니다. 또한 이러한 기술은 종종 심각한 방광 손상을 일으켜 높은 사망률로 이어집니다. 그 결과 발생하는 방광 흉터와 용량 감소는 반복적인 방광 내 점안을 필요로 하는 새로운 치료제에 대한 연구에 상당한 장애물이 됩니다. 이는 실험 결과의 신뢰성을 떨어뜨릴 뿐만 아니라 동물 복지에 대한 윤리적 우려를 야기합니다.
따라서 표재성 인간 방광암을 정확하게 시뮬레이션할 수 있는 동물 모델을 개발하면 종양의 증식과 진행을 이해하기 위한 더 나은 실험 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 이러한 모델은 새로운 방광 내 치료제를 연구하고 방광암 생물학에 대한 지식을 발전시키는 데 매우 유용할 것입니다.
이 연구는 끝이 뭉툭한 디스펜싱 바늘을 사용하여 압력을 받아 종양 세포를 점막하 주입하는 현장 이식 방법을 설명합니다(그림 6). 이 연구는 제 자리 종양 모델을 구축하기 위해 MB49 세포주와 암컷 C57BL/6J 마우스를 활용합니다.
이 모델을 구축하는 동안, 정상 방광 점막 표면의 보호층은 직접적인 종양 세포 주입에 상당한 문제를 제기하며, 종종 효과적인 종양 형성을 방해합니다8. 따라서 종양 세포 이식에 적합한 "토양"을 만들기 위해 34G의 뭉툭한 바늘을 사용하여 방광 돔에서 국소 손상을 유도해야 합니다.
이 연구에 사용된 34G 및 30G 디스펜싱 바늘은 부분적으로 수정되었습니다. 34G 바늘의 끝은 약간 불규칙한 끝을 만들기 위해 고정되어 점막 손상을 유발할 수 있는 능력을 향상시켰습니다. 34G 및 30G 바늘의 연결 지점은 24G 카테터의 노출된 부분이 각각 0.3mm - 0.5mm(그림 7A) 및 1mm - 1.5mm(그림 7B)가 되도록 트리밍되었습니다.
이 전체 절차는 10분 이내에 완료할 수 있으므로 개복술이나 방광 내 점안을 위한 장기간의 요도 결찰술이 필요하지 않습니다. 그러나 이 방법에는 한계도 있습니다. 이 모델링 방법에는 요도를 통해 내주 카테터를 삽입하고 방광 벽을 천공하지 않고 적절한 정도의 점막 손상을 얻기 위해 34G의 뭉툭한 바늘을 회전시키는 것과 같은 여러 기술적 단계가 포함되어 있기 때문에 실험자는 종양 이식의 성공률을 높이기 위해 연습해야 합니다. 또한 점막 손상이나 종양 세포 주입 시 과도한 힘을 가하면 방광 천공이나 근육층에 종양 이식이 발생할 수 있습니다.
결론적으로, 이 기술은 침습적 절차나 장기간의 방광 내 유지가 필요 없이 시술 시간 단축, 사망률 감소, 종양 국소화 및 성장의 일관성 향상 등 기존 방법에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 이러한 이점으로 인해 방광암에 대한 새로운 치료제를 평가하는 것을 목표로 하는 전임상 연구에 유용한 도구가 됩니다.
공개 사항
저자들은 자신들이 서로 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.
감사의 글
이 연구는 Tianjin Municipal Health Industry Key Project 기금(보조금 번호)의 지원을 받았습니다. TJWJ2022XK014), 톈진시 교육위원회의 과학 연구 프로젝트 기금(보조금 번호 2022ZD069), 톈진 비뇨기과 연구소 재능 기금 프로그램(보조금 번호. MYSRC202310), 천진의과대학교 제2병원 임상의학 연구 프로젝트 기금(보조금 번호 2023LC03), 톈진 의과대학 제2병원 청년 기금(보조금 번호 2022ydey15), 천진의과대학교 제2병원 비뇨기과 인재 양성 프로젝트(보조금 번호. MNRC202313). 의뢰자는 원고의 준비, 검토 및 승인에 중요한 역할을 했습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 34G 디스펜싱 니들 | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., Suzhou, China | SGL-362 | |
| 30G 디스펜싱 니들 | Suzhou Haorun Fluid Technology Co., Ltd., 쑤저우, 중국 | SGL-362 | |
| Avertin | Sigma-Aldrich LLC | T48402 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich LLC | 302643 |
참고문헌
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