이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

섬모 형성의 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 측정하기 위한 정량적 PCR 기반 분석

1.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67407

⸱

2025년 1월 31일

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

이 논문에서

요약

이 연구는 섬모 형성의 세포 모델에서 SHH 작용제를 사용하여 1차 섬모 매개 음파 고슴도치(SHH) 신호 경로 활성화에 대한 정량적 PCR 기반 분석을 보여줍니다.

초록

섬모병증(Ciliopathy)은 미세소관 기반 세포 돌출부인 운동성 또는 비운동성(원발성) 섬모의 구조 또는 기능의 이상으로 인해 발생하는 다계통 및 다원성 인간 질병 및 장애의 집합체를 말합니다. 원발성 섬모(primary cilia, PC)는 대부분의 인간 상피 및 내피 조직에 존재하며 음파 고슴도치(SHH) 신호 전달을 포함한 생리적 신호 전달의 허브 역할을 합니다. 다양한 상황에서 PC의 기능을 검토해야 하며, 이는 거의 전적으로 PC에 의해 매개되는 표준 SHH 신호 경로를 측정하여 달성할 수 있습니다. 여기에서는 대부분 PC를 포함하는 정지 hTERT-RPE1(또는 RPE1) 세포에서 SHH 경로 유전자의 전사 수준을 측정하기 위해 정량적 PCR(qPCR) 기반 기술이 개발되었습니다. RPE1 세포의 정지는 48시간 동안 혈청 결핍에 의해 달성되는 반면, SHH 경로의 활성화는 특정 작용제에 의해 촉진됩니다. 이 세포 배양 기반 분석은 따르기 쉽고 민감합니다. 섬모 RPE1 세포에서 이 분석법의 성공적인 입증은 다양한 섬모병증과 관련될 수 있는 하나 또는 여러 유전자의 유전적 또는 후성유전학적 변형에 대한 PC의 적절한 기능을 검사하기 위한 시험관 내 분석으로서의 엄청난 잠재력을 나타냅니다.

서론

섬모는 세포 표면에서 미세소관 기반의 막으로 둘러싸인 돌출부로, 기저체1에 조립됩니다. 척추동물에서는 두 가지 유형의 섬모, 즉 운동성과 비운동성이 관찰됩니다. 운동성 섬모는 특수 조직에 위치하며 운동성을 부여합니다. 비운동성 원발성 섬모(PC)는 대부분의 척추동물 세포에 존재하며, 감각 기능을 수행하고 세포 외 환경에서 세포 내부로 중요한 신호를 전달합니다2. 일단 조립되면 섬모 연신율은 kinesins(전방운동)와 dynein-II motor protein(역행운동)에 의해 구동되는 화물을 운반하는 양방향 운송 시스템인 편모내 수송(IFT) 기계에 의해 도움이 됩니다3,4. 운동성 또는 원발성 섬모의 구조적 또는 기능적 결함은 집합적으로 섬모병증(ciliopathies)으로 알려진 다량의 다량의 인간 질병을 유발할 수 있다 5,6.

PC는 Wnt(Wnt), G-단백질 결합 수용체(GPCR), 수용체-티로신 키나아제(RTK), 형질전환 성장 인자 β(TGFβ) 및 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 신호 7,8과 같은 다양한 발달 신호 전달 과정의 허브 역할을 합니다. 포유류에서 음파 고슴도치(SHH) 신호는 매우 중요하며, 이는 PC 9,10,11을 포함하는 세포에서 PC에 의해 거의 독점적으로 형질전환 됩니다. PC의 비정상적인 구조 또는 기능은 선천성 심장 결함, 다낭성 신장 질환, 두개안면 이상, 망막 이영양증과 같은 질병 및 바르데-비들 증후군(BBS), 주베르 증후군(JBTS), 알스트롬 증후군, Jeune 질식 흉부 이형성증(JATD)과 같은 몇 가지 희귀 질환과 관련된 약화된 신호 전달 경로를 유발합니다.12,13,14,15 . 이들 중 대부분은 상피 또는 내피 조직의 다원성 질환으로, 이러한 질병의 조기 진단 및 치료에 어려움을 겪습니다. 이러한 돌연변이가 세포 배양 모델에서 약독화된 PC 매개 신호전달에 어떻게 기여하는지 결정하는 것은 해당 신호 전달 경로의 분자 복잡성에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 섬모병증의 진단을 용이하게 하고 치료 개입을 제안할 수 있습니다. 이러한 개념으로 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT) 불멸화된 망막 색소 상피 세포(hTERT-RPE1, 여기서는 RPE1이라고 함)에서 PC 매개 SHH 신호 경로의 변화를 결정하기 위해 정량적 PCR(qPCR) 기반 분석법이 개발되었습니다. RPE1 세포는 비동기식으로 성장하는 RPE1 세포 배양에서 15%-18%의 섬모에 비해 약 75%-80%가 24-48시간 동안 혈청 결핍(무혈청 배지에서 세포 배양) 시 PC를 조립하기 때문에 섬실형성을 위한 세포 모델로 널리 사용되는 거의 이배체, 형질전환되지 않은 인간 세포입니다16.

고슴도치 신호(Hedgehog signaling, HH)는 배아 발달을 위해 척추동물에서 보존된다17. 포유류에서는 음파(SHH), 인도(IHH), 사막(DHH)의 세 가지 다른 유형의 고슴도치 신호가 관찰되며, 그 중 SHH와 IHH는 조직 수준11에서 중첩 기능을 보여줍니다. SHH 신호전달은 신경계에서 팔다리의 패턴화와 세포 유형 지정을 조절하고 성체 조직의 항상성을 유지함으로써 배아 발달 과정에서 중요한 역할을 합니다 10,11,18. SHH 신호전달은 복잡하지만, 표준 SHH 신호전달이 Gli 전사 인자(Gli1, Gli2 및 Gli3)의 집합적 기능에 의해 매개되는 PC 7,11,19에 의존한다는 것을 시사하는 증거가 증가하고 있습니다. HH 신호전달과 PC는 낮은 리간드 비율에 대한 효과적인 반응을 가능하게 하기 위해 섬모의 끝에 있는 작은 부피에 집중된 중요한 신호 구성 요소와 함께 공진화하는 것으로 제안되었습니다11.

SHH 리간드가 없는 경우, PC 막에 국한된 Patched1(Ptch1)은 지질 수송을 포함할 가능성이 있는 잘 이해되지 않은 메커니즘을 통해 Smoothened(Smo)의 활성을 억제하여 경로를 억제합니다 7,20. G-결합 단백질 수용체이자 시스템의 음성 조절자인 구성적으로 활성화된 섬모 GPR161은 단백질 키나아제 A(PKA)21의 활성을 증가시키는 높은 수준의 섬모 고리 AMP(cAMP)를 보존하고 PKA7의 섬모 국소화를 유지함으로써 억제가 유지되도록 합니다. PKA 활성은 카제인 키나아제 1(CK1) 및 글리코겐 합성효소 키나아제 3 β(GSK3β)과 함께 PC 내부의 Gli 단백질, Gli2 및 Gli3의 여러 잔기를 인산화합니다. Gli2 및 Gli3는 표적 유전자의 전사를 활성화하고 억제하는 역할을 할 수 있습니다. PKA에 의한 인산화는 Gli2의 활성화 기능을 억제하는 반면, 인산화된 Gli3는 프로테아제에 의해 절단되어 Gli3R 형태의 억제 인자를 생성한다22. 전반적으로, 이러한 조건에서 SHH 표적 유전자의 발현은 억제됩니다.

SHH 리간드가 존재할 때, Ptch1은 그것에 결합하고, GPR161은 PC를 떠나고, G 단백질 결합 수용체 (GPCR) 키나아제 2 (GPRK2) 및 CK1에 의해 인산화 된 Smo는 β-arrestin 및 미세소관 모터 KIF3A23과 함께 PC로 밀매된다. 이와 함께, 섬모단에서 Gli2/3, SUFU(Suppressor of Fused) 및 Kif7의 국소화가 촉진되고 Gli2/3 분열 감소와 연결되어 Gli2/3의 활성화 기능을 증가시킵니다24,25. 일단 활성화되면, Gli2/3은 활성제로서만 기능할 수 있는 Gli1의 발현을 유도하고, 이에 따라 SHH 경로22의 반응을 증폭시킨다. SHH와 Ptch1의 결합은 CAM 관련/종양유전자(CDO), CDO의 형제(BOC), 성장 정지 특이적 1(GAS1) 및 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 2(LRP2)에 의해 하향 조절됩니다. 반대로, 고슴도치 상호 작용 단백질(HHIP)은 SHH와 직접 상호 작용하여 SHH를 격리할 수 있으며 SHH26과 상호 작용하여 Ptch1과 경쟁할 수도 있습니다. 중요한 것은 GLI1, HIP 및 PTCH1은 SHH 경로 활성화 시 전사되는 반면 마지막 두 개는 SHH 경로의 음성 조절에 참여한다는 것입니다.

이전 연구에서는 SHH 표적 유전자의 전사체 수준을 측정하여 SHH 경로를 평가할 수 있음을 입증했지만, 세포 유형에 따라 크게 다를 수 있습니다27,28. SHH 경로 반응의 이러한 변화는 PC가 없는 경우 세포막에 의해 매개되는 PC 매개 SHH 신호와 SHH 신호의 상이한 조합에 기인할 수 있습니다. SAG는 주로 섬모가 있는 혈청이 부족한 RPE1 세포에서 SHH 신호 활성화를 모방하기 위해 이 방법에 사용되는 Smo 작용제입니다. HHIP, GLI1 및 PTCH1과 같은 SHH 표적 유전자 및 비표적 유전자 SMO의 전사체 수준을 대조군 및 SAG 처리한 세포에서 qPCR을 사용하여 측정하고 SHH 경로의 활성화를 결정하기 위해 비교했습니다. PC 매개 SHH 신호전달을 측정하기 위한 이 세포 배양 기반 민감도 분석법의 성공적인 입증은 일차 섬모 기능과 관련된 생물 의학 연구에서 유망한 응용 분야를 시사합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 세포 배양

  1. 원래 배양액을 1:5로 희석하여 RPE1 세포의 거의 융합에 가까운 T-25 세포 배양 플라스크를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신 혼합물(최종 농도 - 100 U/mL 페니실린 G 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 5mL가 포함된 새로운 T-25 세포 배양 플라스크에 통과시킵니다. 이 매체를 완전한 매체라고 합니다. 5% CO2 가 있는 상태에서 37 °C에서 세포를 성장시킵니다.
    참고: RPE1 세포는 세포 배양에서 PC 조립 및 분해의 분자 조절을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 비형질전환된 세포입니다. RPE1 세포의 약 80%는 혈청 결핍 시 PC를 조립하고, 혈청16을 다시 추가하면 다시 분해됩니다.
  2. 12mm 원형 유리 커버슬립을 수조 또는 인큐베이터에서 60°C로 흔들지 않고 덮개가 있는 유리 비커에 1N HCl 50mL로 밤새 배양하여 준비합니다.
  3. 다음날 25mL 피펫을 사용하여 산성 용액을 피펫으로 배출하고 화학적 위험 용기에 적절하게 폐기합니다. 다음으로, 100mL의 증류수에 커버슬립을 3회 세척하여 가끔 흔들면서 15분 동안 배양한 다음 피펫팅합니다.
  4. 70% 에탄올과 95% 에탄올로 세척 단계를 반복합니다. 커버 슬립을 생물 안전 캐비닛의 실험실 압지에 개별적으로 올려 놓아 건조시킵니다. 건조되면 자외선으로 60분 동안 살균합니다.

2. 세포 성장, 혈청 결핍 및 SAG 치료

  1. 예열된 0.25% 트립신-EDTA 용액의 효소 활성으로 세포를 제거한 후 T-25 플라스크의 세포를 예열된 완전한 배지에 재현탁시킵니다. 혈구계(hemocyometer)를 사용하여 세포를 계수하여 현탁액의 세포 밀도를 측정합니다.
  2. 35mm 세포 배양 접시 2개를 준비하고 각 접시에 멸균 12mm 커버슬립 2개를 놓습니다. 계대: 2 x 10,5 , 커버슬립을 포함하는 각 35mm 접시에서 RPE1 세포를 비동기식으로 성장시키고 24시간 동안 2mL의 완전한 배지에서 세포를 성장시킵니다.
  3. 24시간 후, 성장하는 RPE1 세포의 배지를 제거하고 예열된 1mL의 DPBS 완충액으로 세포를 1x 세척합니다. 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하지만 FBS(무혈청 배지)가 없는 예열 DMEM 배지 2mL를 각 접시에 추가하고 5% CO2가 있는 상태에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
  4. 24시간 후, 배지를 최종 농도 250nM의 SAG 또는 대조 용매로 DMSO를 함유하는 무혈청 배지로 교체하고 또 다른 24시간 동안 세포를 배양합니다. 세포 배양 프로토콜의 만화 다이어그램이 그림 1A에 나와 있습니다.

3. 세포 수집

  1. 커버슬립을 각 웰에 하나의 커버슬립이 있는 24웰 플레이트로 옮깁니다. 각 웰에 0.5mL의 냉각된 메탄올을 추가하고 플레이트를 -20°C에서 10분 동안 배양하여 커버슬립에 세포를 고정합니다. 그 직후, 0.5mL의 세척 버퍼(0.5mM MgCl2 및 0.05% Triton-X 100을 함유한 PBS 1개)로 커버슬립을 3번 세척합니다.
  2. 배지를 버리고 각 접시에 0.5mL의 트리졸 시약을 직접 추가합니다. 고르게 분포시키고 5분 동안 보관하십시오. 피펫을 위아래로 몇 차례 반복하여 균일한 혼합물을 만들고 1.5mL 뉴클레아제가 없는 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.

4. 총 RNA 및 cDNA의 준비

  1. 용해된 세포가 들어 있는 각 튜브에 클로로포름 0.1mL를 추가하고 2-3분 동안 배양합니다. 각 시료를 4°C에서 12,000 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다. RNA를 포함하는 수성상을 새로운 마이크로 원심분리 튜브로 전달합니다.
  2. 0.25mL의 이소프로판올을 수성상에 첨가하고 10분 동안 배양합니다. 4°C에서 12,000 x g 에서 10분 동안 원심분리기. RNA 침전물은 흰색 젤 같은 펠릿을 형성합니다. 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.
  3. RNA 펠릿을 갓 희석한 75% 에탄올 0.5mL에 재현탁합니다. 샘플을 간단히 볼렉스한 다음 4°C에서 7500 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 마이크로피펫으로 상층액을 버리십시오.
  4. RNA 펠릿을 10분 동안 자연 건조하고 뉴클레아제가 없는 물 25μL에 재현탁합니다. 미량 분광 광도계를 사용하여 260nm에서 흡광도를 측정하여 전체 RNA의 농도를 측정합니다.
  5. cDNA 합성 키트에 대한 제조업체의 지침에 따라 두 샘플에서 총 RNA 1-3μg을 사용하여 cDNA를 준비합니다. cDNA는 -20°C에서 보관하십시오.

5. 양이 많은 PCR

  1. 각 샘플에서 1:5 희석된 cDNA를 GLI1, PTCH1, HHIP, SMO 및 β-ACTIN(하우스키핑 유전자; 표 2) 적절한 DNA 중합효소, dNTP 및 완충액을 함유한 qPCR 마스터 믹스를 가진 유전자를 적절한 멀티웰, 형광에 민감한 PCR 플레이트에 담았습니다.
  2. 플레이트를 적절한 밀봉기로 덮고 적절한 qPCR 기기에 넣은 다음 40회의 증폭 주기와 프로그램 종료 시 용융 곡선 분석 단계로 표준화된 qPCR 프로그램을 실행합니다. 용융 곡선 분석을 포함한 표준화된 40-사이클 qPCR 프로그램은 그림 1B에 개략적으로 표시되어 있습니다.
  3. qPCR 프로그램이 완료되면 원하는 온도에서 단일 피크에 대한 각 앰플리콘의 용융 곡선을 확인합니다.
    참고: 증폭 주기가 끝나면 관련 용융 곡선 분석은 각 웰의 온도를 65°C에서 95°C로 증가시키고 5초 지속 시간의 단계당 0.5°C 증가하여 앰플리콘의 용융 온도를 측정합니다.
  4. 증폭 데이터를 스프레드시트로 내보내고 각 샘플에 대한 β-ACTIN 유전자에 대해 정규화하여 각 전사체의 상대 발현(2-ΔΔCT 방법)을 계산합니다. 그래프를 플로팅하고 쌍을 이루지 않은 T-검정을 사용하여 각 전사체의 상대적 발현 변화의 통계적 유의성을 계산합니다.

6. 형광 현미경을 이용한 면역염색 및 이미지 획득

  1. 커버슬립의 고정 세포를 200μL의 차단 버퍼(1x PBS에서 2% BSA 및 0.1% TritonX-100)에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 차단 완충액(최종 희석은 재료 표 참조)에 희석한 1차 항체(일반적으로 PC 축삭의 아세틸화된 α-튜불린에 대한 항-마우스 및 섬모막 및 센트리올에 대한 항-토끼 항체)를 혼합하여 4°C의 가습된 챔버에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.
    1. 빈 1mL 피펫 팁 상자의 아래쪽 절반에 젖은 종이 타월을 넣어 가습 챔버를 만듭니다. 랙 표면에 투명 필름 스트립을 놓고 필름에 항체 용액의 물방울(20 -25 μL)을 발견하고, 각 커버슬립에 하나씩 배양합니다. 세포가 잠기도록 물방울에 커버슬립을 놓고 팁 박스의 뚜껑을 닫습니다.
  3. 다음날 커버 슬립을 다시 뒤집어 24웰 접시에 다시 넣습니다. 세척 완충액으로 커버슬립을 세척한 다음 사전 표준화된 항체 희석액(여기서는 차단 완충액에 희석된 녹색-형광 염료 접합 항-토끼) 및 핵 DNA 염색 시약과 함께 150μL의 2차 항체 혼합물에 배양합니다. 커버 슬립을 3 번 씻으십시오.
  4. 유리 현미경 슬라이드에서 퇴색 방지 시약이 포함된 장착 용액의 한 방울(약 3-5 μL)을 찾아냅니다. 셀 면이 아래를 향하도록 커버 슬립을 장착 용액에 놓습니다. 깨끗한 물티슈를 부드럽게 눌러 여분의 액체를 닦아냅니다. 커버슬립의 가장자리를 따라 투명한 매니큐어를 바르고 슬라이드에 밀봉합니다.
  5. 전동 스테이지와 디지털 이미징이 가능한 카메라가 부착된 현미경( 재료 표 참조)에 슬라이드를 놓습니다. 60x Plan Apo 오일 이멀젼 대물렌즈(1.4 개구수)를 사용하여 상온에서 혈청이 부족한 RPE1 세포의 이미지를 획득하고 언급된 항체로 표시된 세포 내 PC를 시각화합니다.
  6. 디지털 현미경 이미징 소프트웨어 패키지를 사용하여 Z축을 따라 서로 다른 형광단에 대해 동일한 노출 시간을 사용하여 별도의 커버슬립에서 서로 다른 샘플의 이미지를 획득합니다. 최소 500개의 세포에서 PC 함유 세포의 수를 계산하여 48시간 혈청이 부족한 상태에서의 섬모 비율을 측정합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

PC 매개 SHH 신호 전달 경로의 활성화는 PC7의 적절한 기능을 이해하는 방법입니다. 여기서, SHH 경로 표적 유전자의 상대적 발현은 대부분 섬모화된 RPE1 세포에서 SHH 경로의 SAG 매개 활성화 시 RT-qPCR 분석을 사용하여 측정됩니다. SHH 경로의 직접 전사 출력 GLI1 및 PTCH1은 이 경로11의 활성을 측정하기 위해 자주 사용됩니다. 이 프로토콜에는 SHH 경로에 의해 조절되는 HHIP 전사체도 포함됩니다. SMO는 SHH 경로의 직접적인 표적이 아니기 때문에 SMO의 전사체 수준은 SHH 경로 활성화에 따라 변경되지 않아야 하므로 대조군으로 사용됩니다. β-ACTIN은 혈청이 부족한 RPE1 세포에서 SAG 자극에 따라 수치가 변하지 않기 때문에 정상화에 사용되었습니다(데이터는 표시되지 않음).

이 경우, RPE1 세포를 섬모 형성 유도를 위해 혈청이 부족한 배지에서...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

PC의 기능을 검사하는 것은 섬모 및 PC의 기능 장애와 관련된 질병 또는 장애의 역학을 이해하기 위한 중요한 단계입니다. 섬모 마커 또는 형광단이 표지된 섬모 구조 성분에 대한 면역 염색을 통한 섬모를 검사하는 것 외에도, PC의 기능은 일반적으로 형광 현미경을 사용하여 조직 및 세포에서 Smo의 섬모 전좌를 측정하여 표준 SHH 경로 활성화를 분석함으로써 결정됩니다27,31. 여기에 설명된 RT-qPCR 기반 분석법은 적절한 섬모 기능의 측정으로 SAG 자극에 대한 반응으로 PC 매개 SHH 신호의 변화를 감지합니다. 분명히 이것은 이 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 세포 배양에서 SHH 경로 전사체 수준을 평가하는 유사한 방법은 SHH 경로가 세포 유형에 따라 어떻게 달라지고 NIH3T3 마우스 섬유아세포 및 인간 RPE1 세포 배양에서 강력하게 측정할 수...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 인도 정부 생명공학부(DBT)의 SM에 대한 Ramalingaswami 펠로우십과 인도 정부 과학 및 공학 연구 위원회(SERB)의 SM에 대한 연구 보조금(CRG/2020/004042)의 지원을 받습니다. PH 펠로우십은 인도 정부 UGC(University Grant Commission)의 후원을 받습니다. 저자는 qPCR 기기에 접근하고 기기에 대한 교육을 받은 프레지덴셜 대학교 보건 과학 연구소 RNABio Lab의 Chandrama Mukherjee 박사와 Avik Mukherjee에게 진심으로 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMSO, 멸균 여과SigmaD2650
Donkey, 마우스 방지 IgG(H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
당나귀, 토끼 방지 IgG(H+L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)Gibco, ThermoFisher Scientific41965039
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS)Gibco, ThermoFisher Scientific14190144
Fetal bovine serum (FBS)HimediaRM1112
형광 현미경에 60X 대물렌즈Carl Zeiss가Axio observer colibri 5
hTERT-RPE1 세포ATCCCRL-4000
iScript cDNA 합성 키트Bio-Rad Laboratories1708891
Mouse, monoclonal anti-acetylated tubulin 항체Milipore Sigma-AldrichT7451최종 희석 1:1000
페니실린-스트렙토마이신, 100XGibco, ThermoFisher Scientific15140122
정량 PCR 기계, CFX 96Bio-Rad Laboratories
토끼, 다클론 Arl13B 항체ProteinTech17711-1-AP최종 희석 1:250
토끼, 다클론 Cep135 항체ProteinTech24428-1-AP최종 희석 1:500
SlowFade gold Antifade moutantThermoFisher ScientificS36940
Smoothened 아고니스트(SAG) AbmoleM4865스톡 솔루션: DMSO, 5 mM
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725271
TRIzol 시약Invitrogen15596026
TrypLEGibco, ThermoFisher Scientific12605028
된 장착되어 있습니다.

참고문헌

  1. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  2. Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble. J Biosci. 45, 117(2020).
  3. Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling. Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).
  4. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Intraflagellar transport and ciliary dynamics. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (3), a021998(2017).
  5. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  6. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 533-547 (2017).
  7. Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).
  8. Bansal, R., et al. Hedgehog pathway activation alters ciliary signaling in primary hypothalamic cultures. Front Cell Neurosci. 13, 266(2019).
  9. Gigante, E. D., Caspary, T. Signaling in the primary cilium through the lens of the hedgehog pathway. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (6), e377(2020).
  10. Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).
  11. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian hedgehog signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (5), a028175(2017).
  12. Brown, J. M., Witman, G. B. Cilia and diseases. Bioscience. 64 (12), 1126-1137 (2014).
  13. Hanaki, K., et al. Alstrom syndrome: A review focusing on its diverse clinical manifestations and their etiology as a ciliopathy. Yonago Acta Med. 67 (2), 93-99 (2024).
  14. Merrill, A. E., et al. Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome. Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).
  15. Dagoneau, N., et al. Dync2h1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type iii. Am J Hum Genet. 84 (5), 706-711 (2009).
  16. Majumder, S., Fisk, H. A. Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).
  17. Briscoe, J., Therond, P. P. The mechanisms of hedgehog signalling and its roles in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (7), 416-429 (2013).
  18. Placzek, M., Briscoe, J. Sonic hedgehog in vertebrate neural tube development. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 225-234 (2018).
  19. Wong, S. Y., et al. Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis. Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).
  20. Deshpande, I., et al. Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity. Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  22. Niewiadomski, P., et al. Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling. Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).
  23. Kovacs, J. J., et al. Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium. Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).
  24. He, M., et al. The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment. Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).
  25. Wen, X., et al. Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation. Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).
  26. Griffiths, S. C., et al. Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling. Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).
  27. Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines. PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).
  28. Schmidt, S., et al. Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease. Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).
  29. Dutta, A., et al. Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells. Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).
  30. De, K., et al. Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability. Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).
  31. Yang, S., Zheng, X. The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells. Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).
  32. Wang, W., et al. The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length. Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).
  33. Alanazi, A., et al. Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle. Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).
  34. Bustin, S. A., et al. The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

RPE1SmoothenedRNA
섬모 형성의 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 측정하기 위한 정량적 PCR 기반 분석
문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.