섬모 형성의 세포 모델에서 음파 고슴도치 신호 전달을 측정하기 위한 정량적 PCR 기반 분석

요약

이 연구는 섬모 형성의 세포 모델에서 SHH 작용제를 사용하여 1차 섬모 매개 음파 고슴도치(SHH) 신호 경로 활성화에 대한 정량적 PCR 기반 분석을 보여줍니다.

초록

섬모병증(Ciliopathy)은 미세소관 기반 세포 돌출부인 운동성 또는 비운동성(원발성) 섬모의 구조 또는 기능의 이상으로 인해 발생하는 다계통 및 다원성 인간 질병 및 장애의 집합체를 말합니다. 원발성 섬모(primary cilia, PC)는 대부분의 인간 상피 및 내피 조직에 존재하며 음파 고슴도치(SHH) 신호 전달을 포함한 생리적 신호 전달의 허브 역할을 합니다. 다양한 상황에서 PC의 기능을 검토해야 하며, 이는 거의 전적으로 PC에 의해 매개되는 표준 SHH 신호 경로를 측정하여 달성할 수 있습니다. 여기에서는 대부분 PC를 포함하는 정지 hTERT-RPE1(또는 RPE1) 세포에서 SHH 경로 유전자의 전사 수준을 측정하기 위해 정량적 PCR(qPCR) 기반 기술이 개발되었습니다. RPE1 세포의 정지는 48시간 동안 혈청 결핍에 의해 달성되는 반면, SHH 경로의 활성화는 특정 작용제에 의해 촉진됩니다. 이 세포 배양 기반 분석은 따르기 쉽고 민감합니다. 섬모 RPE1 세포에서 이 분석법의 성공적인 입증은 다양한 섬모병증과 관련될 수 있는 하나 또는 여러 유전자의 유전적 또는 후성유전학적 변형에 대한 PC의 적절한 기능을 검사하기 위한 시험관 내 분석으로서의 엄청난 잠재력을 나타냅니다.

서론

섬모는 세포 표면에서 미세소관 기반의 막으로 둘러싸인 돌출부로, 기저체¹에 조립됩니다. 척추동물에서는 두 가지 유형의 섬모, 즉 운동성과 비운동성이 관찰됩니다. 운동성 섬모는 특수 조직에 위치하며 운동성을 부여합니다. 비운동성 원발성 섬모(PC)는 대부분의 척추동물 세포에 존재하며, 감각 기능을 수행하고 세포 외 환경에서 세포 내부로 중요한 신호를 전달합니다². 일단 조립되면 섬모 연신율은 kinesins(전방운동)와 dynein-II motor protein(역행운동)에 의해 구동되는 화물을 운반하는 양방향 운송 시스템인 편모내 수송(IFT) 기계에 의해 도움이 됩니다^3,4. 운동성 또는 원발성 섬모의 구조적 또는 기능적 결함은 집합적으로 섬모병증(ciliopathies)으로 알려진 다량의 다량의 인간 질병을 유발할 수 있다 ^5,6.

PC는 Wnt(Wnt), G-단백질 결합 수용체(GPCR....

프로토콜

1. 세포 배양

1. 원래 배양액을 1:5로 희석하여 RPE1 세포의 거의 융합에 가까운 T-25 세포 배양 플라스크를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신 혼합물(최종 농도 - 100 U/mL 페니실린 G 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)이 보충된 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM) 5mL가 포함된 새로운 T-25 세포 배양 플라스크에 통과시킵니다. 이 매체를 완전한 매체라고 합니다. 5% CO₂ 가 있는 상태에서 37 °C에서 세포를 성장시킵니다.
   참고: RPE1 세포는 세포 배양에서 PC 조립 및 분해의 분자 조절을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 비형질전환된 세포입니다. RPE1 세포의 약 80%는 혈청 결핍 시 PC를 조립하고, 혈청¹⁶을 다시 추가하면 다시 분해됩니다.
2. 12mm 원형 유리 커버슬립을 수조 또는 인큐베이터에서 60°C로 흔들지 않고 덮개가 있는 유리 비커에 1N HCl 50mL로 밤새 배양하여 준비합니다.
3. 다음날 25mL 피펫을 사용하여 산성 용액을 피펫으로 배출하고 화학적 위험 용기에 적절하게 폐기합니다. 다음으로, 10....

결과

PC 매개 SHH 신호 전달 경로의 활성화는 PC⁷의 적절한 기능을 이해하는 방법입니다. 여기서, SHH 경로 표적 유전자의 상대적 발현은 대부분 섬모화된 RPE1 세포에서 SHH 경로의 SAG 매개 활성화 시 RT-qPCR 분석을 사용하여 측정됩니다. SHH 경로의 직접 전사 출력 GLI1 및 PTCH1은 이 경로¹¹의 활성을 측정하기 위해 자주 사용됩니다. 이 프로토콜에는 SHH 경로에 의해 조절되는 HHIP 전사체도 포함됩니다. SMO는 SHH 경로의 직접적인 표적이 아니기 때문에 SMO의 전사체 수준은 SHH 경로 활성화에 따라 변경되지 않아야 하므로 대조군으로 사용됩니다. β-ACTIN은 혈청이 부족한 RPE1 세포에서 SAG 자극에 따라 수치가 변하지 않기 때문에 정상화에 사용되었습니다(데이터는 표시되지 않음).

이 경우, RPE1 세포를 섬모 형성 유도를 위해 혈청이 부족한 배지에서.......

토론

PC의 기능을 검사하는 것은 섬모 및 PC의 기능 장애와 관련된 질병 또는 장애의 역학을 이해하기 위한 중요한 단계입니다. 섬모 마커 또는 형광단이 표지된 섬모 구조 성분에 대한 면역 염색을 통한 섬모를 검사하는 것 외에도, PC의 기능은 일반적으로 형광 현미경을 사용하여 조직 및 세포에서 Smo의 섬모 전좌를 측정하여 표준 SHH 경로 활성화를 분석함으로써 결정됩니다^27,31. 여기에 설명된 RT-qPCR 기반 분석법은 적절한 섬모 기능의 측정으로 SAG 자극에 대한 반응으로 PC 매개 SHH 신호의 변화를 감지합니다. 분명히 이것은 이 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 세포 배양에서 SHH 경로 전사체 수준을 평가하는 유사한 방법은 SHH 경로가 세포 유형에 따라 어떻게 달라지고 NIH3T3 마우스 섬유아세포 및 인간 RPE1 세포 배양에서 강력하게 측정할 수.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMSO, 멸균 여과	Sigma	D2650
Donkey, 마우스 방지 IgG(H+L) Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A21202
당나귀, 토끼 방지 IgG(H+L) Alexa Fluor 568	ThermoFisher Scientific	A10042
Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)	Gibco, ThermoFisher Scientific	41965039
Dulbecco의 인산염 완충 식염수 (DPBS)	Gibco, ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal bovine serum (FBS)	Himedia	RM1112
형광 현미경에 60X 대물렌즈	Carl Zeiss가		Axio observer colibri 5
hTERT-RPE1 세포	ATCC	CRL-4000
iScript cDNA 합성 키트	Bio-Rad Laboratories	1708891
Mouse, monoclonal anti-acetylated tubulin 항체	Milipore Sigma-Aldrich	T7451	최종 희석 1:1000
페니실린-스트렙토마이신, 100X	Gibco, ThermoFisher Scientific	15140122
정량 PCR 기계, CFX 96	Bio-Rad Laboratories
토끼, 다클론 Arl13B 항체	ProteinTech	17711-1-AP	최종 희석 1:250
토끼, 다클론 Cep135 항체	ProteinTech	24428-1-AP	최종 희석 1:500
SlowFade gold Antifade moutant	ThermoFisher Scientific	S36940
Smoothened 아고니스트(SAG)	Abmole	M4865	스톡 솔루션: DMSO, 5 mM
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad Laboratories	1725271
TRIzol 시약	Invitrogen	15596026
TrypLE	Gibco, ThermoFisher Scientific	12605028

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