생쥐에서 자가면역 근육 특이적 키나아제(MuSK) 중증 근무력증 유발을 위한 능동적 면역

요약

이 논문은 질병에 대한 병태생리학 및 잠재적 치료 전략을 조사하는 것을 목표로 하는 자가면역 근육 특이적 키나아제(MuSK) 중증 근무력증의 실험적 마우스 모델에 대한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

초록

중증 근무력증(MG)은 신경근 접합부에 영향을 미치는 자가면역 질환입니다. 대부분의 MG 환자는 아세틸콜린 수용체(AChR)에 대한 자가항체를 생성하지만, 일부 환자는 근육 특이적 키나아제(MuSK)를 표적으로 하는 자가항체를 보입니다. MuSK MG는 심각한 근육 약화, 치료 저항성 임상 증상 및 종종 기계적 환기가 필요한 중증 근무력증 위기가 특징입니다. 결과적으로, 환자들은 면역억제제를 장기간 사용해야 하는 경우가 많으며, 이는 장기적인 부작용과 관련이 있습니다. MuSK-MG의 중증도와 희귀성을 감안할 때, 실험용 동물 모델을 개발하는 것은 새로운 치료 방식을 발전시키고 근본적인 병태생리학적 메커니즘에 대한 심층적인 이해를 위해 매우 중요합니다. 실험적 자가면역 중증 근무력증(EAMG)은 MuSK-MG의 동물 모델 역할을 하며, 인간 MG의 임상 및 면역학적 특징을 효과적이지만 부분적으로 모방합니다. 자가면역 동물 모델의 유도는 능동적 또는 수동적 면역을 통해 달성할 수 있습니다. 본원에 제시된 실험 프로토콜에서, 적극적 면역은 열사된 Mycobacterium tuberculosis와 함께 완전한 Freund's adjuvant에서 유화된 human MuSK의 정제된 세포외 도메인을 피하투여함으로써 채택되었다. 4개 접종소에서 면역 접종을 실시한 후 28일째 되는 날에 MuSK의 부스터 주사를 맞았습니다. M. tuberculosis에 대한 이 보조제는 TLR4를 통해 면역 체계를 활성화하고 투여된 항원의 향상된 식균작용을 가능하게 합니다. 이 기사는 처음부터 결론까지 MuSK-EAMG의 개발 및 특성화에 대해 포괄적으로 자세히 설명합니다.

서론

중증 근무력증(MG)은 T 세포 의존성, 항체 매개 메커니즘을 통해 발생하는 자가면역 질환입니다. 주로 환자의 80%-85%에서 신경근 접합부(NMJ)의 시냅스후 막에 있는 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AChR)에 대한 항체에 의해 발생하며, 약 5%의 환자에서 근육 특이적 키나아제(MuSK)에 대한 항체 및 기타 NMJ 단백질에 의해 발생합니다. MG는 자가면역 질환의 원형이자 시냅스후 기능을 이해하기 위한 모델이 되었습니다¹. 자가면역질환의 동물모델은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데, (1) 동물이 자연적으로 자가면역질환을 발병시키는 자발적 모델(Spontaneous model)과 (2) 자가면역질환을 인위적으로 모방하고 복제하는 유도 모델(Induced model)이다. 중증 근무력증(MG)에 대한 연구는 능동적 면역과 수동적 면역 모두 질병을 유발할 수 있음을 입증했으며, 이는 항체 매개 질환에 대한 이해에 크게 기여했습니다².

수동적 전달은 자가항체 매개 질환의 급성 효과를 평가하는 매우 효과적인 방법이며 MG에서 환자 유래 항체를 연구하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 접근법은 질병의 기저에 있는 면역학적 요인에 대한 이해를 넓히는 데 도움이 되었습니다. 예를 들어, 수동적 전이 연구는 AChR 클러스터 감소에 대한 anti-MuSK IgG4의 병원성 영향을 보여주었습니다³. 그러나 인간과 설치류 IgG 및 면역 체계 간의 기능적 차이, 림프 조직에서 발생하는 항 MuSK 자가면역의 초기 활성화 메커니즘을 모방하기에는 수동 전달 모델의 불충분성과 같은 수동 전달 모델에는 몇 가지 한계가 있습니다.

반면에, 면역 연구의 잠재적인 한계는 서로 다른 마우스 균주 간의 면역유전학적 다양성입니다⁴. 예를 들어, C57BL/6 (B6) 마우스는 AChR에 의한 적극적 면역에 취약한 반면, AKR/J 마우스는 내성이 있습니다. 따라서 EAMG 동물모델을 만들 때 질병을 정확하게 반영하기 위해 동물 종, 면역 방법 및 프로토콜 내용을 올바르게 선택하는 것이 중요합니다⁵.

또한 표적 항원을 전체 단백질로 사용하면 종종 높은 항체 역가가 생성됩니다. 그러나 모든 항체가 마우스 항원과 교차 반응하거나 질병을 유발하는 항원결정기를 생성할 수 있는 것은 아닙니다. 따라서 적극적 면역 모델이 항상 인간 병리학을 정확하게 반영하는 것은 아닙니다. 그럼에도 불구하고 적절한 임상 및 생리학적 표현형을 성공적으로 생성하면 이러한 모델은 실험 요법을 테스트하기 위한 장기적인 플랫폼을 제공합니다.

임상 연구는 MuSK-MG에 대한 다양한 질병 메커니즘 및 치료 요구 사항을 나타내며, 이 MG 아형 ^4,5,6의 특정 병원성 특징에 대한 추가 식별의 필요성을 강조합니다. 이전의 능동 면역 기반 MuSK EAMG 연구는 MuSK 자가면역에서 Th2 유형 면역 및 항 마우스 IgG1의 우세한 관여를 보여주었으며 인간 MuSK MG ^7,8,9에 대한 여러 가지 잠재적 치료 방식(예: 테리플루노마이드, 중간엽 줄기세포, FCRLB shRNA)을 확인했습니다. 이는 새로운 치료 표적을 테스트하고 MuSK MG 병태생리학을 조사하는 데 있어 MuSK EAMG 모델의 중요성을 입증했습니다.

이 기사에서는 동물 모델 유도, 질병 진행 모니터링 및 EAMG 유도 검증 절차에 대해 자세히 설명했습니다. 임상 평가에는 관찰자에 의한 체중, 자세, 악력 및 임상 점수 모니터링이 포함되었습니다. 2차 면역 접종 후 28일 후에 생쥐를 안락사시켰고, 혈액, 뒷다리 근육, 비장, 겨드랑이 및 서혜부 림프절 등 다양한 조직을 채취하여 질병 발병을 확인했습니다. anti-MuSK 항체는 ELISA 방법을 사용하여 혈청에서 정량화되었습니다. 또한, 신경근 접합부의 침전물을 시각화하기 위해 근육 조직에 면역형광 염색을 수행했습니다. MuSK EAMG 감수성이 다른 마우스 그룹의 임상 및 면역 반응을 입증하고 비교하기 위해 KCNS3 shRNA로 처리된 마우스는 전염증 작용(미발표)을 보였고 FCRLB shRNA는 이전 연구에서 확인된 바와 같이 항염증 작용⁹을 보였습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 이스탄불 대학교 동물 실험을 위한 지역 윤리 위원회(HADYEK)의 승인을 받았으며 결정 번호는 2020/29입니다. 이전^{연구에서 7,8,9}, EAMG 모델은 MuSK 단백질을 사용한 적극적인 면역을 통해 8-10주 된 BALB/c 또는 B6 마우스에서 유도되었습니다. 이 기사는 MuSK 면역 BALB/C 마우스(그룹당 4-8 마우스)를 사용한 다양한 실험에서 얻은 예시적인 데이터를 제공합니다. 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 면역을 위한 인간 MuSK의 생산 및 준비

1. human MuSK 세포외 도메인 아미노산 24-495(NCBI Reference Sequence: NP_005583.1)를 pPIC9 벡터에 클로닝합니다.
2. 효모 Pichia pastoris (균주 GS115) 시스템에서 발현을 분비합니다.
3. 성장 배지에 메탄올(2.5% v/v)을 첨가하여 발현을 유도합니다.
4. 정화를 위해 C-terminal 6xHIS 태그를 추가합니다.
5. 단백질을 분비된 글리코실화 단백질로 발현하고 native 조건에서 정제합니다. 50mM 인산염 완충액 pH 8.0, 300mM NaCl에 대해 배양 배지를 투석합니다.
6. Ni²⁺/니트릴로트리아세테이트 아가로스(Ni-NTA)를 사용하여 니켈 이온 친화성 크로마토그래피를 계속합니다. 정제된 단백질을 -80°C에서 10% 글리세롤을 첨가한 후 보관하면 최소 2년 동안 안정적이다¹⁰.
   참고: Ni-NTA 정제 후 추정된 발현 수준은 약 0.4mg/L 배양입니다. SDS-PAGE로 분석한 샘플에서 다른 단백질 불순물은 검출되지 않았습니다.
7. 면역 전에 겔 전기영동을 통해 MuSK 단백질의 분리된 세포외 도메인의 순도를 확인합니다(보충 그림 1).
8. 각 마우스에 대해 45μg/100μL PBS의 농도로 MuSK를 준비합니다.
9. Mycobacterium tuberculosis H37Ra(10 mg/10 mL)를 함유한 PBS(100 μL) 및 Complete Freund's Adjuvant(CFA-100 μL)와 1:1 비율로 MuSK를 균질화(유화)합니다(에멀젼의 총 부피는 마우스당 200 μL).

2. 마취 및 예방접종 절차

1. 면역 전에 프로포폴을 PBS(1:5 비율)로 희석합니다.
2. 마우스당 50mg/kg으로 복강내로 투여합니다.
   참고: Isoflurane은 흡입을 통한 마취에도 사용할 수 있습니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 초기 농도는 일반적으로 산소 유속이 1-2L/min일 때 3%-5%로 설정되는 반면, 유지 농도는 일반적으로 산소 유속이 0.5-1L/min일 때 1%-3%입니다.
3. 1차 예방접종: CFA로 준비한 MuSK 총 45μg/200μL를 어깨와 뒷발 안쪽에 피하주사(각 부위당 약 11.25μg/50μL)합니다.
4. 2차 면역 : CFA로 제조된 MuSK 총 45 μg/200 μL를 어깨와 엉덩이에 피하주사(각 부위당 약 11.25 μg/50 μL)합니다.
   참고: 모델을 확립하기 위해 28일 간격으로 주사를 두 번 투여합니다. 근육 투여는 근육통과 관련이 있으며, 이는 임상적 약화 평가를 방해할 수 있습니다. EAMG는 근육 질환이기 때문에 근육 주사를 사용하면 통증과 관련된 비중증 근무력증 약화를 유발하여 교란으로 작용할 수 있습니다. CFA만 접종한 대조군(MuSK 제외)을 권장합니다.

3. 임상 채점

1. 쥐가 스트레스를 유발하기 위해 그리드를 잡으려고 할 때 케이지의 상단 그리드를 가로질러 40번 부드럽게 드래그하여 쥐를 운동시키는데, 이는 쥐의 중증 근무력증 증상이 운동과 피로 후에 더 두드러지기 때문입니다.
2. 운동 후에는 생쥐의 활동량, 체중 및 근력의 변화를 주의 깊게 관찰합니다. 평가 기준을 안내하기 위해 이러한 관찰을 기반으로 적절한 점수를 할당합니다.
   참고: 점수 0: 생쥐는 활동적인 상태를 유지하고 주변 환경을 계속 탐색합니다. 점수 1: 운동 후 구부정한 자세가 관찰되지만 생쥐는 정상적인 활동과 사교성으로 돌아갑니다. 모피 손질은 일반적으로 유지됩니다. 점수 2: 구부정한 자세는 운동 전에도 볼 수 있으며 운동 후에는 더 두드러집니다. 자기 그루밍과 활동의 감소가 관찰됩니다. 점수 3: 운동 전후에 극적으로 구부정한 자세를 관찰합니다. 움직임, 사교성 및 근력이 크게 감소하고 2-3일마다 1-2g의 체중 감소가 수반됩니다. 탈수가 발생하여 쥐가 물과 음식에 접근하기 어렵게 만듭니다. 탈수는 피부가 꼬인 후 빨리 돌아오지 않고 대변의 변화로 식별됩니다. 통증이 있는 쥐는 눈을 가늘게 뜨고 구부정한 자세를 취하는 것이 특징입니다. 심한 통증의 징후와 20%를 초과하는 체중 감소의 징후를 보이는 마우스는 희생됩니다. 점수 4: 쥐가 새장에서 죽은 채로 발견되었습니다. 죽은 쥐는 즉시 제거하고 케이지를 교체해야 합니다⁵.
3. 두 번째 예방 접종 후 약 10일 후에 증상이 빠르게 진행되므로 매일 마우스를 확인하십시오. 처음 28일 동안은 매주 임상 채점 및 측정을 수행하고 그 후에는 일주일에 두 번 수행합니다.
4. 체중 측정을 수행합니다.
   참고: 체중 측정은 질병 진행을 추적하기 위한 중요한 매개변수를 제공합니다. 생쥐의 높은 신진대사율로 인해 체중이 크게 달라질 수 있습니다. 모든 측정에 동일한 스케일을 사용하고 일관성을 위해 하루 중 같은 시간에 이러한 측정을 수행하는 것이 중요합니다.
5. 근력 측정을 수행합니다. 그리드 와이어가 있는 수평 동력계를 사용하여 근력을 측정합니다.
   1. 임상적 채점을 위해 생쥐를 케이지 위로 부드럽게 40회 드래그하여 피로를 유발하는 운동을 합니다.
   2. 즉시 각 마우스를 동력계의 그리드에 놓고 꼬리를 부드럽게 당겨 모든 발이 그리드를 단단히 잡고 있는지 확인합니다. 생쥐가 네 발로 그리드를 잡는 측정만 고려하십시오.
      알림: 각 측정 중에 동일한 양의 힘을 가하도록 노력하고, 신뢰성을 유지하고 변동성을 줄이기 위해 동일한 연구원이 모든 측정을 수행하는 것이 좋습니다. 피로가 MG 약점의 특징이기 때문에 그립 강도를 측정하지 않고 일련의 그립 강도 테스트를 수행해야 합니다. 그 후, 각 마우스에 대해 7번의 측정을 수행했으며 최대값과 최소값을 버렸습니다. 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 나머지 5개 측정의 평균을 계산합니다.

4. 조직 샘플 준비

참고: 기관적으로 승인된 프로토콜에 따라 두 번째 예방 접종 후 28일이 지나면 마우스를 희생시킵니다. 희생된 쥐에서 혈액, 근육, 비장 및 림프절을 수집하는 것은 추가 조사에 도움이 될 것입니다.

1. 심장 혈액 채취
   참고: 심장 혈액을 채취하려면 윤리 위원회에서 승인한 적절한 마취제(예: 프로포폴)를 사용하여 마우스를 마취합니다. 심장 천자는 마취가 필요하며 말기 절차이므로 동물을 즉시 안락사시켜야 합니다.
   1. 쥐를 깊이 마취 한 후 등을 대고 복부를 열고 가장 낮은 갈비뼈에서 약 1cm, 약간 오른쪽으로 심장을 찾습니다.
   2. 25-35G의 주삿바늘을 사용하여 합병증을 피하기 위해 주사기를 움직이지 않고 45도 각도로 좌심실에서 조심스럽게 혈액을 채취한다¹¹.
   3. 혈청 분리를 위해 혈액 샘플을 건조 튜브로 옮기거나 RNA 분리를 위해 EDTA 튜브로 옮깁니다(계획된 경우).
   4. 원심분리로 혈청을 분리하고 혈청 샘플을 사용할 때까지 -20°C에서 유지합니다.
2. 근육 샘플 보존 및 준비
   1. 전방 경골 근육^수집 11,12,13. 얼음처럼 차가운 PBS로 헹굽니다.
   2. 샘플을 cryotube에 넣고 즉시 -20°C에서 액체 질소 냉각 이소펜탄에 넣고 -80°C 냉동고에 보관합니다.
      참고: 실험에서 보다 정확한 결과를 얻으려면 샘플을 스냅 동결해야 합니다.
   3. 티슈를 단면 마운트에 수직으로 놓습니다. 코르크를 사용할 수 있습니다. 면역형광 염색을 위한 샘플을 OCT(Optimal Cutting Temperature compound)에 삽입합니다.
   4. 조직이 액체 질소 냉각 이소펜탄에 떠오르도록 합니다. 저온 유지 장치로 절단할 때까지 -80°C 냉동고에 보관하십시오.

5. 면역형광 라벨링을 통한 신경근 접합부 평가

1. 저온 유지 장치 절편 및 고정
   1. -24°C에서 OCT에 박혀 있는 동결 조직을 저온 유지 장치를 사용하여 7μm 두께로 절단합니다.
   2. -20 °C로 냉각된 아세톤으로 섹션을 고정합니다. PBS로 5분 동안 세척합니다.
   3. 0.4% 트리톤 X(PBS-T)가 함유된 PBS를 10분 동안 다시 세척합니다.
      참고: 투과화 단계를 수행하여 고정의 영향을 받는 분자의 형태를 수정하여 보다 정확한 결합을 보장할 수 있습니다. 투과화는 10분 동안 1% FBS를 함유한 PBS를 사용한 치료와 10분 동안 PBS-T를 포함하는 처리였습니다.
   4. 비특이적 결합을 방지하기 위해 10% FBS를 함유한 PBS-T로 절편을 30분 동안 차단합니다.
2. 면역형광 염색
   참고: 염색을 위해 C3, IgG, 아세틸콜린 수용체 마커 α-bungarotoxin과 같은 항체를 사용할 수 있습니다.
   1. 선택된 항체를 1% FBS를 함유한 PBS-T에 희석합니다.
   2. 실온에서 2.5시간 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
   3. 1% FBS가 함유된 PBS-T로 섹션을 세척합니다.
   4. DAPI로 반염색합니다.
   5. 형광 현미경으로 검사할 때까지 4°C의 어둡고 습한 환경에서 절편을 보관하십시오.
   6. 이미징 및 분석을 수행합니다.
      참고: 각 섹션의 Bungarotoxin(BTX) 양성 신경근 연접은 형광 현미경을 사용하여 계수해야 합니다. 20배 배율로 이미지를 캡처합니다. 분석을 위해 BTX 및 C3 또는 IgG 양성 신경근 접합부를 현미경으로 수동으로 계수했습니다. 직렬 섹션에서 총 BTX 레이블 접합에 대한 이중 포지티브 접합의 백분율을 분석에 사용해야 합니다.

6. 웨스턴 블롯

1. 단백질 분리 및 정량화
   1. 스냅 냉동된 근육 샘플을 사용하십시오.
   2. 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제(phosphatase inhibitor)로 용해 완충액을 준비합니다.
   3. 시료 중량과 동일한 0.5mm 산화지르코늄 비드를 추가하고 용해 완충액 부피의 2배를 추가합니다.
   4. 균질화기를 사용하여 샘플을 균질화합니다.
   5. 12,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리기 용해물.
   6. 단백질 용해물을 포함하는 상등액을 수집합니다.
   7. BCA 분석 키트 또는 Bradford 시약을 사용하여 단백질 농도를 정량화합니다.
   8. 용해 완충액을 사용하여 단백질 샘플을 원하는 농도로 준비합니다. 웰당 25μg의 단백질은 AChR을 표시하는 데 효율적입니다.
2. SDS-PAGE 겔 전기영동
   1. 단백질 시료를 4x Laemmli 완충액과 혼합합니다.
   2. 샘플을 95°C에서 5분 동안 가열하여 변성시킵니다.
   3. 동일한 양의 단백질과 단백질 래더를 SDS-PAGE 겔의 웰에 로드합니다.
   4. 젤을 200V에서 30분 동안 실행합니다(시간은 전원 공급 장치에 따라 다를 수 있음).
3. 단백질 전달
   1. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 사용한 반건조 전사의 경우, 모든 구성 요소를 냉간 전달 버퍼로 적십니다.
   2. 전사 샌드위치 설정: 스폰지, 여과지, 젤, 멤브레인, 여과지, 스폰지.
      알림: 레이어 사이에 기포가 없는지 확인하십시오. 전송 프로그램은 제조업체의 지침에 따라 선택해야 합니다( 재료 표 참조).
4. 차단 및 항체 배양
   1. 5% 무지방 분유 또는 TBST의 BSA에 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 막습니다.
   2. 2.5% 차단 완충액으로 희석된 1차 항체(anti-AChR)가 있는 멤브레인을 4°C에서 부드러운 흔들림으로 밤새 배양합니다.
   3. TBST에서 각각 10분 동안 멤브레인을 3회 세척합니다.
   4. 2.5% 차단 버퍼에 희석된 HRP 접합 2차 항체(IgG HRP)가 있는 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
   5. TBST에서 각각 10분 동안 멤브레인을 3회 세척합니다.
5. 감지 및 이미징
   1. 제조업체의 지침에 따라 멤브레인에 ECL 기질을 도포합니다.
   2. 이미징 시스템을 사용하여 화학발광 신호를 캡처합니다.
   3. 이미징 소프트웨어를 사용하여 밴드를 분석합니다.
      참고: 분해를 방지하기 위해 단백질과 시약을 항상 얼음 위에 보관하십시오. 하우스키핑 단백질(예: 베타-액틴, 알파-튜불린 또는 GAPDH)을 대조군으로 실행하여 균등 부하를 보장합니다. 최상의 결과를 위해 항체 농도와 배양 시간을 최적화합니다. AChR 단백질이 MuSK 면역 마우스에서 덜 발현된다는 것을 보여주는 것은 매우 중요합니다.

7. 수제 Anti-MuSK IgG ELISA

1. 100μL의 탄산염 중탄산염 완충액에서 웰당 0.5μg의 농도로 MuSK 항원을 준비합니다(플레이트 코팅).
2. 항원 용액 100μL를 면역분석 플레이트의 각 웰에 분주합니다.
3. 플레이트를 4 ° C에서 밤새 배양하십시오.
4. 0.5% Tween 20(세척액)이 함유된 PBS로 플레이트를 세척합니다.
5. 5% FBS(차단 용액)가 포함된 PBS로 플레이트를 4°C에서 90분 동안 배양하여 비특이적 결합 부위를 차단합니다(차단).
6. 최적화 연구에서 높은 수준의 MuSK-IgG가 나타났으므로 혈청 샘플을 차단 용액에 1/50,000 희석합니다.
7. 차단 후 세척하지 않고 희석된 혈청 샘플을 웰에 추가합니다.
8. 플레이트를 37°C에서 90분 동안 배양합니다.
9. 세척액으로 접시를 세 번 씻으십시오.
10. 차단 용액에 묽은 HRP 복합 항마우스 IgG 2차 항체(ab97023) 1/5000을 희석합니다.
11. 희석된 2차 항체 100μL를 각 웰에 추가합니다.
12. 플레이트를 37°C에서 90분 동안 배양합니다.
13. 세척액으로 접시를 세 번 씻으십시오.
14. 각 웰에 100μL의 TMB 기질을 추가하고 색상 변화를 관찰합니다.
15. 2 M H₂SO 4를 사용하여 적절한 시간에 반응을 정지시킨다_.
16. 분광 광도계를 사용하여 450nm에서 광학 밀도를 측정합니다.
17. 일관성을 위해 모든 샘플을 중복하여 동일한 플레이트에서 수행합니다.
    참고: 표준 샘플 희석을 사용할 수 없으므로 광학 밀도 값을 분석에 사용해야 합니다. 네거티브 컨트롤 웰(비어 있음)에 색상 변화가 없어야 합니다. 급격한 색상 변화가 예상되므로 웰에서 반응을 즉시 중단하기 위해 정지 용액을 근처에 유지해야 합니다.

결과

MuSK 실험적 자가면역 중증 근무력증(EAMG) 모델을 평가하고 검증할 때 몇 가지 주요 매개변수와 실험 결과는 질병 모델의 성공적인 유도 및 특성화를 입증하는 데 중요합니다. 아래는 MuSK EAMG 모델의 확립을 확정한 대표적인 결과입니다.

임상 점수 매기기
마우스는 표준화된 임상 채점 시스템을 사용하여 중증 근무력증의 임상 증상에 대해 모니터링하고 점수를 매깁니다. 이 점수에는 근력, 자세 및 일반적인 신체 상태 평가가 포함됩니다. 기준선 및 대조군 마우스와 비교하여 시간이 지남에 따라 임상 점수가 증가하면 실험 그룹에서 질병의 진행과 중증도를 확인할 수 있습니다. 임상 점수 데이터는 명확하고 점진적인 증가를 보여야 하며, 이는 인간 MuSK 중증 근무력증을 모방하는 모델의 효과를 강조해야 합니다(그림 1).

악력 및 체...

토론

Murine MuSK-EAMG는 근육 약화, 구근 약화로 인한 체중 감소, 순환 항 MuSK 항체 및 근육 AChR 감소 측면에서 임상 및 면역 병원성 측면에서 인간 MuSK-MG를 모방합니다. 이 MuSK-EAMG 모델의 이정표 및 예상 일정에 관해서는 두 번째 면역 접종 후 첫 주 이내에 근육 약화의 임상 징후가 나타나야 합니다. 약 5%의 생쥐에서 첫 번째 면역 후 질병의 징후가 나타날 수 있습니다. 두 번의 예방 접종 후 >70%의 EAMG(최소 1등급) 유병률이 예상됩니다. 질병의 발병률이 낮으면 세 번째 예방 접종을 실시할 수 있습니다 ^7,14,15. 두 번의 면역 모두에서 CFA의 MuSK 단백질을 투여받은 MuSK 면역 마우스는 두 번의 연속 면역에서 CFA와 IFA로 MuSK를 투여받은 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
125I-&알파;-방가로톡신	Invitrogen	BTX T1175
2-메틸부탄	시그마-알드리치	M32631
40μ m 세포 스트레이너	NEST	258369
96웰 Maxisorp 플레이트	Sigma-Aldrich	M9410
보조제 불완전한	Becton Dickinson & Co.	263910
항-AChR 알파1	Alomone	ANC-001
안티 마우스 IgG HRP	Abcam	ab97023
총알 블렌더 스톰	넥스트 어드밴스		티슈 균질화기
C3	Novus	NB200-540G
탄산염-중탄산염 완충제	머크	C3041
극저온 스타	라이카	CM1860
동력계 Imada DST-50N	무로마치	MK380Si
형광 현미경	라이카	DM4M
유리 주사기	ISOLAB	094.92.005
IgG	Abcam	ab96871
마이크로플레이트 광도계, Multiskan FC	Thermo Scientific	51119000
마우스 수술 키트	Kent Scientific Corparation	INSMOUSEKIT
핵균 H37Ra	Becton Dickinson & Co.& nbsp;	231141
OCT 복합	한천 과학	AGR1180
주사기, 1mL	Becton Dickinson & Co.	309625
주사기, 2mL	B. Braun	7389
범용 동물 구속기	Merck	Z756911-1EA
WesternBright Sirius-Western 블로팅 검출 키트	Advansta	K-12043-D10	ECL