이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca2+ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca2+ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.
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방법 논문
칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
단일 세포 Ca2+ 이미징은 온도, 전압, 천연 화합물 및 화학 물질 등과 같은 다양한 자극에 의해 활성화되는 Ca2+ 채널 연구에 필수적입니다. 주로 현미경 이미징 기술과 관련 Ca2+ 지시자 Fura-2/AM(AM은 Acetoxymethyl ester의 약자)에 의존합니다. 세포 내부에서 Fura-2/AM은 에스테라아제에 의해 Fura-2로 가수분해되며, 이는 유리 세포질 Ca2+와 가역적으로 결합할 수 있습니다. 결합 시 최대 여기 파장은 380nm에서 340nm(Ca2+로 포화된 경우)로 이동합니다. 방출된 형광 강도는 결합된 Ca2+의 농도와 정량적으로 관련됩니다. 340/380 비율을 측정하여 세포질의 Ca2+ 농도를 측정할 수 있으며, 서로 다른 시료 간의 형광 프로브의 로딩 효율 차이로 인한 오류를 제거할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 여러 세포에서 Ca2+ 변화를 실시간으로 정량적으로 동시에 모니터링할 수 있습니다. 결과는 "에 저장됩니다. 후속 분석을 위한 XLSX" 형식으로 빠르고 직관적인 변화 곡선을 생성하여 검출 효율성을 크게 향상시킵니다. 다양한 실험적 관점에서 이 논문은 내인성 또는 과발현 채널 단백질이 있는 세포에서 Ca2+ 신호를 검출하기 위해 이 기술을 사용하는 방법을 나열합니다. 한편, 세포를 활성화하는 다양한 방법도 제시하고 비교했습니다. 목표는 독자에게 단일 세포 Ca2+ 이미징의 사용 및 응용 분야에 대한 보다 명확한 이해를 제공하는 것입니다.
서론
Ca2+ 는 근육 수축1, 신경 전도2, 분비3 및 유전자 발현4과 같은 다양한 세포 기능을 조절하여 세포 신호 전달에 중요한 역할을 하여 여러 생리적 과정에 영향을 미칩니다. 비정상적인 Ca2+ 농도는 부정맥5, 응고 장애6, 호르몬 불균형7과 같은 질병을 유발할 수있다. 따라서 세포 내 Ca2+ 농도 변화의 메커니즘을 연구하는 것이 가장 중요합니다.
세포의 Ca2+ 농도 조절에는 Ca2+-선택성 칼슘 방출 활성화 칼슘(CRAC) 채널8 및 TRP계열의 비선택적 양이온 채널9을 포함한 다양한 이온 채널이 관여합니다. 이러한 이온 채널은 온도10, 화합물 및 중국 ....
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프로토콜
실험 방법은 칭화대학교(Tsinghua University)와 베이징 중의과대학(Beijing University of Chinese Medicine)의 IACUC 지침에 의해 승인되었으며 이를 따랐습니다. 이 프로토콜은 여러 신생아 마우스의 피부에서 분리된 1차 각질세포를 포함하여 다양한 세포 유형에 대한 단일 세포 Ca2+ 이미징 방법을 소개합니다(출생 후 3일 이내, 성별 무작위 암컷 C57BL/6 마우스). 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 세포 준비
메모: 일차 세포, 내인성 표적 유전자가 있는 세포주 또는 과발현 플라스미드로 transfection된 세포주는 모두 단일 세포 Ca2+ 이미징에 적합합니다. 이 연구에 사용된 플라스미드는 칭화대학교의 Xiao Bailong 교수 실험실에서 얻은 것입니다. 이러한 플라스미드는 GFP 형광 단백질과 human STIM1, DsRed 형광 단백질과 human Orai1, mRuby 형광 단백질과 rabb....
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결과
온도 반응 감지
원발성 각질세포
1차 각질세포는 신생아에서 분리하고 확립된 프로토콜10에 따라 준비되었습니다. 이 세포는 유리 슬라이드를 포함하는 24웰 플레이트에 파종되었습니다. Fura-2 프로브를 로드한 후 그림 2A와 같이 세포 형태를 명확하게 시각화하기 위해 380nm 파장에서 현미경으로 초점을 조정했습니다. 프로세스 중에 프로브가 성공적으로 로드되지 않으면 셀이 표시되지 않습니다. 챔버 내의 세포외 완충액은 관류 시스템을 통해 지속적으로 교체되어 세포를 위한 최적의 조건을 보장했습니다. 온도 제어 시스템은 관류 시스템에 연결되어 세포 외 완충액의 온도 변화를 제어하여 세포 열 반응을 감지할 수 있었습니다. 이 과정에는 세포 외 완충액을 점차적으로 가열한 다음 점차적으로 냉각하는 작업이 포함되었습니다.
단일 세포 Ca.......
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토론
단일 세포 Ca2+ 이미징 시스템의 적용은 광범위하여 각질 세포, 줄기 세포16, 간 세포, 심장 세포17, 포도사이트18, 면역 세포 및 표적 단백질10,19를 과발현하는 세포주를 포함한 다양한 세포 유형에서 Ca2+ 신호를 연구할 수 있습니다. 이 기술은 세포 Ca2+ 농도의 변화 및 절대 값을 측정하고 Ca2+ 관련 이온 채널을 조사하는 데 중요한 역할을 하여 이온 채널 연구 실험실에서 필수적인 기기 중 하나입니다.
연구가 진행됨에 따라 Ca2+ 신호 관련 이온 채널의 중요성은 중국 전통.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없다고 선언합니다.
감사의 글
칭화대학교(Tsinghua University)의 Bailong Xiao(Bailong Xiao)는 단일 셀 Ca2+ 이미징 시스템과 온도 제어 운영 체제를 공유하고 이 프로젝트에 대한 지원과 도움에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(32000705), 중국한의학회(China Association of Chinese Medicine)의 젊은 엘리트 과학자 후원 프로그램(CACM-(2021–QNRC2–B11)), 중앙대학기초연구기금(2020–JYB–XJSJJ–026), (2024-JYB-KYPT-06)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 카메라 | 니콘 | ||
| Capsaicine | 시그마 | 211275 | |
| CL-100 온도 컨트롤러 | 워너 인스트루먼트 | ||
| 사이클로피아존산 (CPA) | 시그마 | C1530 | |
| DG-4 라이트 | 셔터 인스트루먼트 컴퍼니 디 | ||
| 메틸 설폭사이드 (DMSO) | Amresco | 231 | |
| DPBS | Thermofisher 14190144 | ||
| 형광 이미징 소프트웨어(MetaFluor, 유료 소프트웨어) | 분자 장치 | ||
| 형광 현미경 | Nikon | ||
| Fura-2/AM | Invitrogen | F1201 | |
| HBSS 버퍼 | Gibco | 14175103 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| Pluronic F-127 | Beyotime | ST501 | |
| 폴리-D-라이신 | Beyotime | ST508 | |
| SC-20 액체 순환 가열/냉각 장치 | 하버드 장치 | ||
| 백색광 소스 | Nikon |
참고문헌
- Murthy, K. S. Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut. Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--eeg, ecog, lfp and spikes. Nat Rev Neurosc....
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