중국 전통 의학(TCM)은 자연 치료 옵션의 풍부한 보고이며 전 세계적으로 다양한 건강 요구 사항을 해결하는 데 중요한 역할을 합니다. 이 연구는 Flos sophorae immaturus의 핵심 활성 성분인 루틴의 추출, 분리 및 물리화학적 특성에 대한 포괄적인 실험적 조사를 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
중국 전통 의학(TCM)은 오랫동안 자연 치료 솔루션의 풍부한 저장소 역할을 해왔으며 전 세계적으로 다양한 의료 요구 사항을 해결하는 데 중추적인 역할을 해왔습니다. 한의학에 사용되는 다양한 허브 중에서 Sophora flavescens 는 광범위한 약효로 유명합니다. 그 적용은 수세기 전으로 거슬러 올라가며 특히 심혈관 질환 치료의 치료적 이점으로 인해 현대 의학에서 계속해서 높은 평가를 받고 있습니다. 생리 활성 플라보노이드 화합물인 루틴은 식물계 전체에 널리 분포되어 있으며 Flos sophorae immaturus에서 가장 높은 농도가 발견됩니다. 루틴은 비정상적인 모세혈관 투과성과 취약성을 감소시키는 것으로 보고되었으며 심혈관 및 뇌혈관 보호제 역할을 합니다. 이 연구는 Flos sophorae immaturus에서 파생된 루틴의 물리화학적 특성의 추출, 분리 및 특성화를 위한 상세한 실험 프로토콜을 제시합니다. 또한, 알칼리 추출 및 산 침전 방법을 사용하여 TCM에서 플라보노이드를 추출하기 위한 프로토콜을 소개하고 설명합니다.
서론
Sophora japonica L.의 말린 꽃봉오리인 Flos sophorae immaturus(FSI)는 수세기 동안 중국 전통 의학(TCM)의 초석이었습니다. 주요 활성 성분에는 루틴, 이소케르시트린, Sophorae Flos 및 기타 플라보노이드와 사포닌이 포함됩니다. 이러한 성분은 열을 내리고 해독하는 작용, 혈액을 식히고 지혈하는 작용, 혈압을 낮추는 등 다양한 약리학적 효과를 종합적으로 부여한다. 임상 실습에서 FSI는 주로 모세혈관 투과성 보호1, 심혈관계 기능 유지2, 혈액 냉각, 출혈 억제 및 간 화재 조절 능력3으로 평가됩니다. 그 치료 특성은 건조 중량의 최대 20%-30%를 구성하는 생리 활성 플라보노이드인 고농도의 루틴(케르세틴-3-루티노사이드)에 기인합니다4.
루틴은 식물에 널리 분포하는 플라보노이드입니다. 화학명은 Que-3-O-루틴(C27H30O16)입니다(그림 1). 실온에서 루틴은 연한 노란색에서 황록색의 결정성 분말로 나타납니다. 녹는점은 결정 형태와 순도에 따라 다르며 일반적으로 125°C에서 195°C 사이입니다. 루틴은 뚜렷한 극성 특성을 나타냅니다: 냉수에 약간 용해되고, 에탄올 및 메탄올과 같은 극성 유기 용매에 매우 용해되며, 에테르 및 클로로포름과 같은 비극성 용매에는 거의 용해되지 않습니다. 또한, 용해도는 pH에 민감하며 나트륨 또는 칼륨염을 형성하는 페놀 수산기의 해리로 인해 알칼리성 조건에서 크게 증가합니다. 이러한 물리적 특성은 분자 구조5의 폴리하이드록실 및 배당체 그룹과 밀접하게 연관되어 있으며, 추출 공정 및 의약, 식품 및 기타 산업에서의 응용에 직접적인 영향을미칩니다6. 루틴은 식물에 널리 존재하지만 FSI에 가장 풍부하며 모세혈관 안정화7, 항염증제, 항산화제8, 항균제9 및 대사 조절 효과10를 포함한 다양한 약리학적 활성을 나타냅니다.
임상적 잠재력에도 불구하고11, 루틴의 열악한 수용성 및 안정성은 추출 및 제형에 어려움을 야기합니다5. 이러한 한계를 해결하기 위해 알칼리 추출-산 침전(AEAP) 방법은 페놀 수산기의 pH 의존적 거동을 활용하여 효과적인 대안으로 등장했습니다.
루틴의 물리적 특성을 기반으로 AEAP 방법은 알칼리성 용액에 대한 용해도와 산성 조건에서 결정화를 활용하여 FSI에서 루틴을 분리하는 표준화된 기술이 되었습니다12. AEAP는 페놀 수산기의 pH 전환 가능한 이온화를 활용하여 수율을 개선하고 FSI에서 고순도 루틴 추출을 달성합니다. 알칼리성 조건(pH >10)에서 페놀 -OH 그룹은 탈양성자화되어 친수성 -O- 이온을 형성하여 산화 분해를 최소화하면서 식물 조직에서 완전한 가용화를 가능하게 합니다. pH 2-3으로 산성화하면 이러한 이온화가 역전되어 극성 불순물의 동시 침전을 최소화하면서 표적 페놀을 침전시킵니다. pH 의존적 용해도를 갖는 폴리페놀인 루틴은 알칼리성 용액(예: 수산화나트륨)에 쉽게 용해되지만 수산기 양성자화로 인해 산성 조건에서 침전됩니다. AEAP는 독성 용매를 피함으로써 녹색 화학 원칙에 부합하는 비용 효율적이고 확장 가능하며 환경 친화적인 대안을 제공합니다13. 이는 pH 기반 분리 기술을 선호하는 천연 제품 화학의 광범위한 추세를 반영합니다14. 비교 가능한 방법을 사용하여 커큐민(강황에서)과 베르베린( Coptis chinensis에서)을 분리하여 선택적 추출을 위해 특정 pH 값에서 용해도 변화를 활용합니다. AEAP 방법은 FSI와 같은 플라보노이드가 풍부한 공급원에서 고수율 루틴 생산에 이상적이며 기본 실험실 장비(예: pH 측정기, 원심분리기)만 필요합니다. 루틴 함량이 낮거나 복잡한 간섭 화합물을 가진 식물 매트릭스의 경우 추출 효율을 높이기 위해 향후 효소 가수분해 전처리를 고려할 수 있습니다.
결론적으로 AEAP는 루틴 추출을 위한 편리한 접근 방식을 나타내며 효능, 안전성 및 확장성의 균형을 맞춥니다. TCM 현대화에서의 역할은 전통적인 관행과 현대 제약 표준을 연결할 수 있는 잠재력을 강조합니다.
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프로토콜
루틴은 여러 페놀 수산기를 포함하는 플라보노이드이며 뜨거운 알칼리성 용액에 용해된 후 산성화 및 침전됩니다. 알칼리 추출-산 침전 공정을 사용하여 추출할 수 있습니다. 본 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 실험 준비
- 다음 재료를 얻으십시오: Flos sophorae immaturus (20g), 붕사 (0.8g), 비커 여러 개, 석회 분말 (1.5g), 진한 염산, 온도계 및 pH 테스트 스트립. 이 이미지의 더 큰 버전은 그림 2 를 참조하십시오.
2. 루틴 추출
참고: 붕사 대 물 비율을 붕사 0.8g과 물 200mL로 사용합니다. 라임 파우더 1.5g과 물 10mL의 라임 우유 비율을 사용하십시오. pH를 빠르고 정확하게 조정하십시오. 필요에 따라 손실된 물을 보충하십시오.
- 알칼리 추출
알림: 6cm 원형 여과지를 사용하여 여과합니다.- 500mL 비커에 물 250mL와 붕사 0.8g을 넣습니다. 끓을 때까지 가열한 다음 Flos sophorae immaturus 20g을 넣습니다. 2-3분 동안 계속 끓입니다.
- 끓인 후 저어주면서 라임 우유로 pH를 8-9로 조절합니다. 20분 동안 계속 가열합니다. 뜨거울 때 거즈를 통해 여과하여 황갈색 여과액을 얻습니다.
- 산성 침전 추출
- 진한 염산을 사용하여 추출물을 pH 2-3으로 조정하고 가라앉히십시오. 투명한 황갈색 용액에서 탁한 용액으로 변하고 용기 바닥에 주황색-노란색 응집성 침전물이 점진적으로 형성되면 효과적인 루틴 분리를 나타냅니다.
- 6시간 동안 그대로 둔 후 침전물을 대기압 흡입 여과에 노출시킵니다. 조루틴을 얻기 위해 수집하고 건조시킵니다.
알림: 사용된 브리넬 깔때기 크기(직경 150mm)에 따라 필터 필름을 절단합니다. - 대기압 흡입 여과 중에 중성이 될 때까지 침전물을 물로 세척하십시오.
3. 루틴 정제
- 거친 계량 후 뜨거운 물을 사용하여 1:200의 용해도로 루틴을 재결정화합니다. 수용액을 30분 동안 끓이고 뜨거울 때 걸러냅니다. 루틴 용액의 최종 부피가 210mL인지 확인하십시오.
- 잔여물을 걸러냅니다. 여과액을 방해받지 않고 그대로 두었다가 다시 여과하고 60-70°C의 오븐에서 진공 상태에서 건조하여 정제된 루틴을 얻습니다(그림 3).
알림: 사용된 브리넬 깔때기 크기(직경 150mm)에 따라 필터 필름을 절단합니다.
4. 루틴의 물리화학적 식별
- 염산염-마그네슘염 반응 - 플라보노이드 모핵 식별
- 샘플 1-2mL를 메탄올에 녹이고 마그네슘 분말 50mg을 첨가합니다.
- 진한 염산 몇 방울을 추가합니다. 부드럽게 흔들어 주세요. 용액이 빨간색으로 바뀌어야 합니다(그림 4).
- Molisch 반응 - 당 화합물의 식별
- α-나프톨의 10% 에탄올 용액을 넣고 흔듭니다. 시험관을 기울이고 농축 황산을 내벽을 따라 조심스럽게 적방 첨가합니다.
- 인터페이스에서 갈색 링이 형성되는 것을 관찰합니다(그림 5).
- 지르코니아-구연산 반응 녹화
- 샘플의 에탄올 용액에 1-2mL의 10% α-나프톨 용액을 첨가합니다. 잘 흔들어주세요. 농축된 H10SO2 를 흔들지 않고 튜브 벽을 따라 4방울을 천천히 첨가합니다.
- 2% 구연산 메탄올 용액을 첨가합니다. 용액 색상이 밝아져야 합니다(그림 6).
- 얇은 레이어 판별
- 정제된 루틴과 루틴 표준을 모두 사용하십시오.
- 클로로포름:메탄올:포름산(15:5:1)을 현상제로 사용하고 AlCl3 의 1% 에탄올 용액을 발색제로 사용합니다. 365nm의 UV 램프 아래에서 형광을 관찰합니다.
5. 루틴의 TLC 검사
참고: 루틴의 순도를 평가하기 위해 박층 크로마토그래피(TLC) 방법을 사용했습니다. 실리카겔 플레이트를 고정상으로 사용했습니다.
- 정제된 루틴 샘플과 루틴 표준물질(메탄올 1mg/mL)을 플레이트에 놓습니다. 에틸 아세테이트:포름산:물(8:1:1, v/v/v)으로 구성된 이동상에서 플레이트를 현상합니다.
- 건조 후 254nm의 UV 광선 아래에서 플레이트를 시각화합니다.
- 샘플 스폿의 머무름 계수(Rf)를 계산하고 표준과 비교합니다.
알림: 동일한 Rf 값(이 조건에서 약 0.35-0.50)을 가진 단일 스폿은 고순도를 나타내는 반면 추가 스폿은 불순물의 존재를 나타냅니다.
6. HPLC에 의한 루틴 순도 측정
참고: 루틴의 순도는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정량적으로 분석되었습니다. 분석 조건은 다음과 같았다: 크로마토그래피 컬럼-(250mm × 4.6mm, 5μm); 이동상-아세토니트릴(A) 및 0.2% 아세트산 수용액(B). 선형 구배 용출 프로그램: 0-15분, 20%-30% A; 15-30분, 30%-60% A. 유속-1mL/min. 주입량-10μL. 검출 파장-355nm. 컬럼 온도-40°C.
- 루틴 시료 분말 0.1g의 무게를 정확하게 측정하여 10mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 60% 에탄올 용액 5.0mL를 넣고 완전히 흔듭니다.
- 항온 수조 또는 컬럼 오븐을 30 °C로 설정하고 샘플을 30 분 동안 초음파 처리합니다.
- 샘플을 실온에서 10분 동안 55,900× g 에서 원심분리합니다. 상층액을 HPLC 분석을 위한 테스트 용액으로 사용하십시오.
7. LC-MS에 의한 루틴 측정
참고: 분리된 화합물은 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)에 의해 확인되었습니다. LC 조건은 HPLC 분석법과 일치했습니다. 질량 분석법은 모세관 전압이 3.5kV인 음이온 모드에서 전기분무 이온화(ESI)를 사용하여 수행되었습니다. 탈용매화 온도-350°C; 대량 스캔 범위-m/z 100-1000.
- 정제된 루틴 샘플 10mg의 무게를 측정하고 2mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 샘플이 완전히 용해될 때까지 피펫을 사용하여 0.6mL의 중수소화 DMSO를 추가합니다. 동일한 절차를 사용하여 루틴 표준 용액을 준비합니다.
- 양성자 핵 자기 공명(1H NMR) 분광법을 사용하여 처리된 샘플 및 표준물질을 분석합니다.
- 호환 가능한 소프트웨어15를 사용하여 스펙트럼 데이터를 처리합니다.
- 검증을 위해 스펙트럼 데이터를 NIST 또는 PubChem과 같은 문헌 또는 데이터베이스 참조와 비교합니다.
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결과
루틴의 물리화학적 식별 실험에서 마그네슘 분말과 소량의 진한 염산을 첨가한 후 용액이 붉은색으로 변한 후 흔들어 플라보노이드 모핵이 있음을 나타냅니다. Molisch 반응에서는 계면에 보라색 고리가 형성되어 양성 결과와 분자 구조에 당 부분이 존재함을 나타냅니다. 메탄올에 2% 클로로 산화 시약을 첨가하면 샘플 용액이 밝은 노란색으로 변했는데, 이는 3-OH 또는 5-OH 그룹을 포함하는 플라본 구조의 존재를 시사합니다. 이후 메탄올에 2% 구연산을 첨가하면 용액 색상이 더 밝아져 5-OH만 존재함을 나타냅니다.
루틴 샘플과 루틴 표준물질을 비교하는 TLC 실험에서 표준물질은 특정 스폿 위치와 특징적인 착색을 나타냈습니다16. 크로마토그램을 비교한 결과, 시료 내 반점의 수와 위치가 표준물질과 밀접하게 일치하는 것으로 나타났으며, 이는 알칼리 추출 및 산 침전 방법(17)을 통해...
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토론
루틴 추출은 주로 알칼리 추출-산 침전(AEAP) 방법6을 기반으로 하며, 이는 간단한 장비 요구 사항, 작동 용이성, 고효율 및 저렴한 비용이라는 장점을 제공합니다. 이 기술은 종종 마이크로파 보조 추출(MAE)7 및 초음파 보조 추출(UAE)8로 보완되어 시약 소비를 줄이고 추출 시간을 단축하며 전체 수율을 향상시킵니다.
연구에 따르면 pH는 침전된 고형물의 고체 추출률과 케르세틴 함량 모두에 큰 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 따라서 루틴 수율을 극대화하려면 알칼리성 용액의 농도와 추출 시간을 정밀하게 제어하는 것이 필수적입니다. 과도한 알칼리는 원치 않는 화합물을 용해시켜 추출물의 순도를 손상시킬 수 있습니다18. 마찬가지로, 강전 중에 사...
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공개 사항
이 논문의 저자는 이 연구를 수행하고 이 기사를 작성하는 과정에서 발생할 수 있는 모든 이해 상충을 공개했음을 선언합니다. 우리는 이 작업에서 제시된 결과나 결론에 대한 우리의 해석에 잠재적으로 편향될 수 있는 재정적, 개인적 또는 직업적 관계가 없음을 확인합니다. 특히, 우리는 여기에 보고된 연구 결과로부터 이익을 얻을 수 있는 제약 회사, 연구 기관 또는 기타 기관과 아무런 관련이 없습니다. 마지막으로, 우리는 우리의 연구 결과와 결론이 이 논문에 제시된 데이터와 분석에만 근거한 것이며 외부 요인의 영향을 받지 않음을 확인합니다. 우리는 모든 연구 활동에서 최고 수준의 학문적 성실성과 윤리적 행동을 위해 최선을 다하고 있습니다.
감사의 글
실험 플랫폼을 제공해주신 베이징 중의과대학 제약화학연구소에 깊은 감사를 표하고 싶습니다. 이들의 지원과 자원은 우리의 연구와 실험을 수행하는 데 매우 귀중했습니다. 우리는 과학적 우수성에 대한 그들의 헌신과 젊은 연구자의 발전을 촉진하려는 그들의 헌신에 깊은 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1-나프톨 | 맥클린 | C16245764 | |
| 아세트산 | 맥클린 | C12662811 | |
| 아세토니트릴 | 맥클린 | C16129374 | |
| 염화 알루미늄 | 맥클린 | C16485922 | |
| 구연산 | 맥클린 | C16429480 | |
| DMSO | 푸첸(톈진) 화학 시약 유한회사 | 20230306 | |
| 에탄올 | 푸첸(톈진) 화학 시약 유한회사 | 20250102 | |
| 에틸 아세테이트 | 푸첸(톈진) 화학 시약 유한회사 | 20240318 | |
| Flos sophorae immaturus | 베이징 통인탕 | 10092026329782 | |
| 개미산 | 푸첸(톈진) 화학 시약 유한회사 | 20150402 | |
| 메스트르노바 | 메스트레랩 연구 | / | |
| 메탄올과 nbsp; | 이노켐 | C16365684 | |
| 실리카 젤 60F254 | 스티마 | 20210222 | |
| 엑스칼리버 | 써모피셔 사이언티브 | / | |
| 지르코닐 클로라이드 옥타하이드레이트 | 맥클린 | C15350627 |
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