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방법 논문

하이브리드 스페로이드 생성을 위한 광학 핀셋 사용

1.3K 조회수

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DOI:

10.3791/67422

⸱

2025년 5월 30일

 ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Pathology, Institute of General and Experimental Pathology, Wrocław Medical University, 2Department of Optics and Photonics, Faculty of Fundamental Problems of Technology, Wrocław University of Science and Technology

이 논문에서

요약

본 논문에서는 광학 핀셋을 이용한 하이브리드 스페로이드 제조를 위한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법을 사용하면 다른 방법으로는 달성할 수 없는 스페로이드 형성 과정의 초기 단계를 정밀하게 제어할 수 있습니다.

초록

2차원(2D) 세포 배양은 여전히 전임상 암 연구에서 가장 일반적으로 사용되는 모델 중 하나입니다. 그러나 3차원(3D) 체외 모델은 보다 관련성이 높은 구조적 형태, 미세환경 및 약물에 대한 반응을 포함하여 생체 내 환경을 보다 정확하게 평가하는 것으로 보입니다.

광학 트래핑은 하나 이상의 집중된 레이저 빔을 사용하여 나노 및 마이크로 스케일에서 구조의 위치, 동작, 상호 작용 및 역학을 비침습적으로 조작합니다. 광학 핀셋(OT)은 세포 생물학에서 수많은 응용 분야를 찾았습니다. 그러나 암 연구에서 그들의 잠재력은 여전히 과소평가되고 있습니다. 이 논문에서는 광학 핀셋을 사용하여 림프종 기질 세포 스페로이드 형성을 위한 비침습적 프로토콜을 권장합니다. 이 방법은 하이브리드 스페 로이드 를 새로 구축할 뿐만 아니라 부착된 세포의 수와 접착 형성 시간을 제어할 수 있어 조직 공학에 중요한 정보 소스를 제공합니다. 또한 OT는 표준 벌크 기술로는 달성할 수 없는 하이브리드 스페로이드 형성의 초기 단계에 대한 연구를 가능하게 합니다. 중요한 것은 설명된 모델을 사용하여 항암제에 의해 유도된 접착력의 최소 변화를 연구할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

3차원(3D) 세포 모델은 여러 가지 기능적, 구조적 특성에서 종양 조직과 더 유사하기 때문에 암 연구를 가속화하고 있습니다. 여기에는 무엇보다도 세포 외 기질 생성, 세포 간의 상호 작용, 영양소 및 산소 구배 유지, 치료에 대한 유사한 반응 1,2,3,4 등이 포함됩니다. 최근에는 생체 내 조건을 더 잘 반영하기 위해 다양한 세포 유형을 포함하는 고급 이기종 3D 모델이 개발되었습니다 5,6,7.

B세포 비호지킨 림프종(B-NHL)은 면역 체계의 필수 구성 요소인 B 림프구에서 유래한 이질적인 악성 종양 그룹입니다8. 다양한 임상적 양상과 조직학적 특징을 특징으로 하는 B-NHL은 임상 과정이 장기화되는 나태한 형태부터 빠르게 진행되는 공격적인 변종에 이르기까지 다양한 장애를 포괄합니다 9,10. B-NHL 및 기타 혈액 악성 종양의 발병기전은 종종 종양 미세환경의 영향과 관련이 있습니다11,12. 예를 들어, 림프종 세포는 종종 골수로 퍼져 생명을 위협하는 합병증을 유발할 수 있습니다13. 골수 틈새의 핵심 구성 요소인 중간엽 기질 세포(mesenchymal stromal cell, MSC)는 주로 직접적인 세포-세포 상호 작용을 통해 종양 성장 및 진행에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다14 15,16,17; 따라서 이러한 상호 작용을 연구할 수 있는 모델을 시급히 개발할 필요가 있습니다. 우리는 이전에 MSC가 림프종 세포와 아가로스 하이드로겔에서 공동 배양될 때 다세포 스페로이드로 자가 응집되며, 기질 세포가 코어를 형성하고 림프종 세포로 균일하게 둘러싸여 있음을 확인했습니다18. 이 논문에서는 광학 핀셋을 사용하여 하이브리드 림프종-기질 세포 3D 모델을 제작하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

35년 전, Ashkin은 집속 레이저 빔19에 의한 바이러스와 박테리아의 비침습적 광학 포획 현상을 처음으로 보고했습니다. 요즘 광학 핀셋(OT)은 세포 생물학 연구를 포함하여 생물 의학 분야에서 역동적으로 증가하는 영향을 미치고 있습니다 20,21,22,23. OT를 통해 개별 세포의 물리-기계적 특성뿐만 아니라 24,25,26 뿐만 아니라 단일 세포 수준에서의 직접적인 세포-세포 상호 작용, 더 나아가 2D 및 3D 세포 배열 및 구조화 27,28,29를 연구할 수 있었습니다. 광학 트래핑 기술은 전자기 복사(광자)로 가해지는 몇 피코네톤 정도의 광학적 힘을 기반으로 하며, 이는 물질30과 상호 작용할 때 운동량을 변경합니다. 결과적으로, 하나 이상의 레이저 빔을 사용함으로써, 작업자는 마이크로 및 나노 스케일20에서 물체의 위치, 동작 및 역학을 선택적으로 조작할 수 있습니다. 실제로, 광학적 트래핑 기법은 살아있는 세포의 선택적이고 비파괴적인 트래핑을 허용하여 다른 세포 또는 분자의 표면과 접촉하게 하고 접착 과정(31)의 시작을 트리거합니다. 위의 기능을 사용하여 먼저 단일 림프종 세포를 기질 세포의 단층에 광학적으로 배치하여 접착 특성을 조사하려고 시도했습니다. 다음으로, 실시간 모드33에서 다세포 스페로이드를 물리적으로 재현하는 광학 핀셋의 능력을 평가했습니다. 이를 달성하기 위해 개별 림프종 세포를 하나씩 포획하여 미리 준비된 3D 기질 스페로이드에 부착했습니다. 광학 트래핑의 또 다른 적용 가능성은 최소 세포-세포 접착 시간을 측정하고 항암 치료로 인한 접착력의 미세한 변화를 평가하는 것이었습니다34,35. 3D 모델은 암 연구에 널리 사용되지만 스페로이드 형성의 초기 단계를 연구하는 것은 여전히 어렵습니다. 이는 주로 미시세계를 높은 정밀도와 최소한의 침습적 충격으로 동시에 만질 수 있는 방법의 가용성이 제한되어 있기 때문입니다. 반대로, OT의 모든 잠재력은 3D의 세포 배열 및 구조 범위 내에서 아직 달성되지 않았습니다. 따라서 본 논문에서는 광학 핀셋의 표준 3D 기술과 조작을 사용하여 3D 림프종 구축물을 생성하는 결합된 워크플로우를 단계별로 설명합니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 혈액병리학적 악성 종양에서 중요한 다른 세포 유형과 함께 사용하도록 쉽게 조정될 수 있다는 것입니다.

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프로토콜

1. 아가로스 젤 기반 마이크로몰드 제작

참고: 모든 세포 배양을 처리할 때 적절한 무균 기술이 필수적입니다. 이 프로토콜에 사용된 모든 시약은 Table of Materials에 나열되어 있습니다. 그림 1A와 같이 단일 실험을 위해 MSC가 포함된 3개의 겔을 준비합니다.

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그림 1: 중간엽 기질 세포(MSC) 스페로이드의 준비. (A) 아가로스 마이크로몰드를 제조하는 단계를 묘사한 그림. (B) 중간엽 기질 세포(MSC)의 파종 및 중간엽 스페로이드의 배양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 먼저 아가로스 마이크로몰드를 준비합니다. 마이크로몰드 3D 페트리 접시( 재료 표 참조)를 탈이온수(3x)로 헹구고 UV 램프 아래에 놓고 30분 동안 살균을 수행합니다.
  2. 먼저 2% 아가로스 용액을 준비합니다. 고품질 순수 멸균 아가로스 분말 1g( 재료 표 참조)을 측정하고 멸균 50mL 원추형 튜브에 넣습니다. 멸균 0.9% 염화나트륨 용액 50mL( 재료 표 참조)를 아가로스에 넣고 잘 섞습니다. 원뿔형 튜브의 덮개가 고정되지만 여전히 느슨해질 때까지 나사를 조입니다.
  3. 전자 레인지를 사용하여 아가로 스 가루를 끓여 완전히 녹입니다. 10초마다 전자레인지를 돌리지 말고 원뿔형 튜브를 조심스럽게 휘저어 아가로스가 녹도록 합니다. 아가로스를 혼합하거나 피펫팅하는 동안 기포가 생기지 않도록 하십시오. 약 70 °C로 시원한 아가로스.
    알림: 반투명하고 용해되지 않은 분말의 잔여물이 없는지 확인하십시오.
    주의 : 용융된 아가로스는 매우 뜨거워 심각한 피부 화상을 유발할 수 있습니다.
  4. 무균 기술을 사용하여 층류 캐비닛에서 작업하십시오. 이전에 멸균된 마이크로 몰드에 500μL의 아가로스를 채워 하이드로겔을 준비합니다. 피펫을 사용하여 마이크로 몰드의 작은 특징에 갇힐 수 있는 기포를 흡입합니다.
  5. 실온에서 15분 동안 배양한 후 아가로스가 응고되면 마이크로몰드의 겔을 조심스럽게 제거하여 멸균 6웰 플레이트에 넣습니다. 젤 구조를 손상시키지 마십시오. 다음 단계로 진행하기 전에 현미경으로 마이크로 몰드가 올바르게 준비되었는지 확인하고 가장자리가 손상되지 않았는지 확인하십시오. 매체가 누출될 수 있는 틈이 있는지 확인하십시오.
  6. 마이크로몰드를 완전히 덮을 수 있도록 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 충분히 추가한 후 플레이트를 UV 램프 아래에 놓고 살균을 위해 30분 동안 기다립니다.
    참고: 아가로스 마이크로몰드는 냉장고 조건(4°C)에서 1x PBS로 덮인 원뿔형 튜브에 최대 2주 동안 사용하기 전에 보관할 수 있습니다.
  7. 마이크로몰드를 사용하여 스페로이드를 생산하기 전에 RPMI 배지(6웰 플레이트의 경우 4.0mL/웰)로 겔을 완전히 덮어 평형을 이루고 최소 15분 동안 배양합니다.

2. 중간엽 기질 세포(MSC) 스페로이드의 제조

  1. 10% 열 불활성화 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(재료 표 참조)이 보충된 RPMI 1640 배양 배지에서 인간 중간엽 기질 세포주인 HS-5 세포주(Table of Materials 참조)를 표준 상태로 배양하여 48시간마다 배지를 교체합니다.
  2. HS-5 세포가 약 90% 밀집되면 다음과 같이 세포 계대를 수행합니다.
    1. 혈청학 피펫을 사용하여 배양 배지를 제거합니다.
    2. 1x PBS를 추가하고 소용돌이치고 흡입하여 남아 있는 매체를 제거하여 세포를 세척합니다.
    3. 세포 배양 플라스크에 트립신-EDTA 용액 2mL( 재료 표 참조)를 추가하고 세포 분리를 용이하게 하기 위해 37°C에서 배양하여 배양 플라스크 바닥에서 세포를 분리합니다.
    4. 2mL의 완전 배양 배지를 추가하여 트립신화를 중지합니다.
    5. 5mL 피펫을 사용하여 세포를 부드럽게 현탁시키고 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다.
    6. 세포 현탁액을 300 x g 에서 7분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 1mL의 신선한 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.
    7. 세포 펠릿 10μL를 취하여 0.5mL 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 10μL의 0.4% Trypan blue 용액( 재료 표 참조)을 추가하고 자동 세포 카운터에서 세포를 계수합니다( 재료 표 참조).
    8. 위에서 얻은 세포 밀도를 기반으로 세포를 2 x 105 cells/mL의 배지로 희석합니다.
  3. 아가로스 마이크로몰드에서 세포 배양 배지를 제거합니다.
  4. 위에서 언급한 190μL의 세포 현탁액(단계 2.2.8)을 아가로스 마이크로몰드의 세포 시딩 챔버에 조심스럽게 시딩합니다. 단일 웰에는 약 150개의 세포(38.000 세포/겔)가 포함됩니다.
  5. 세포가 겔 바닥에 정착할 때까지 30분 동안 인큐베이터(5% CO2, 37 °C, 습한 분위기)에서 아가로스 마이크로몰드의 세포를 배양합니다. 30분 후 인큐베이터에서 마이크로몰드가 포함된 플레이트를 제거하고 겔 외부에 추가 배지를 천천히 추가하여 완전히 덮습니다(예: 6웰 플레이트의 경우 4.0mL/웰).
    참고: 배지를 젤 아가로스 마이크로몰드에 직접 첨가하지 말고 배양 접시에 첨가하여 갓 형성된 스페로이드가 손상되지 않도록 하십시오.
  6. 균일한 스페로이드가 형성될 때까지 72시간 동안 5% CO2 의 습한 분위기에서 37°C의 인큐베이터에 겔을 놓습니다. (그림 1B).
    알림: 도립 현미경으로 다음 3일 동안 스페로이드 형성을 관찰하는 것이 좋습니다. 일반적으로 중간엽 기질 세포는 24시간 이내에 스페로이드를 형성하기 시작하지만, 이 과정은 세포 계대와 밀도에 따라 더 빠르거나 느릴 수 있습니다. 아가로스 미세곰팡이에서 72시간 배양 후, 중간엽 기질 세포는 비교적 균일한 스페로이드를 형성합니다. 그러나 동일한 조건에서 배양되더라도 크기와 모양이 다를 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 매체가 자주색-빨간색에서 노란색으로 변할 때 교체해야 합니다.

3. 림프종 세포의 배양 및 광학 포획을 위한 준비

참고: 림프종 세포를 포함한 혈액 세포주는 배양 플레이트나 용기에 부착하지 않고 현탁 배양을 위해 설계된 플라스크의 배양 배지에서 자유롭게 성장합니다. 최적의 세포 특성을 유지하려면 광학 핀셋을 사용하여 하이브리드 스페로이드를 조립하는 절차 30분 전에 샘플 준비를 시작하는 것이 좋습니다. 중요한 것은 이 섹션에서 설명하는 프로토콜은 Ri-1 인간 림프종 세포주에 대한 것이지만 유사한 프로토콜이 다른 혈액암 세포주에도 적용된다는 것입니다.

  1. 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 Ri-1 림프종 세포주( 재료 표 참조)를 배양합니다.
  2. 인큐베이터의 림프종 세포를 37°C 및 5% CO2로 가습된 공기를 포함한 표준 배양 조건에서 유지합니다. 2-3일마다 통과하여 로그 단계에서 3-5 x 105 cells/mL 사이의 배양을 유지합니다.
  3. 세포를 수집하고 현탁액을 15mL 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 실온에서 300 x g 에서 7분 동안 셀을 원심분리하여 셀 펠릿을 얻습니다. 상층액을 제거하고 10mL의 새 배지를 추가하고 균일한 현탁액이 얻어질 때까지 부드럽게 피펫팅합니다.
  4. 10μL의 세포 현탁액을 새 원심분리 튜브에 흡입하고 10μL의 Trypan blue를 추가합니다. 10μL를 계수 챔버로 옮기기 훨씬 전에 현탁액을 피펫팅하여 세포 밀도와 생존율(일반적으로 95% 이상)을 측정합니다.
  5. 세포 현탁액을 희석하여 최종 밀도 1 x 104 cells/mL에 도달합니다. 광학 조작이 있을 때까지 림프종 세포를 37°C로 유지하십시오.

4. 광학 핀셋 시스템 설정

참고: 아래 프로토콜은 맞춤형 광학 핀셋36 (그림 2A)을 위해 특별히 개발되었습니다. 그러나 이 분석은 상업적으로 이용 가능한 다른 포획 시스템과 함께 사용할 수 있습니다. 사용 가능한 장비 유형에 관계없이 시스템 준비를 위한 기본 단계(예: 레이저 및 컴퓨터 소프트웨어 시작, 샘플 장착, 광학 트랩에서 셀 이동 가능성 테스트)는 동일하게 유지됩니다. 모든 실험은 실온, 즉 25°C에서 수행되었습니다.

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그림 2: 광학 핀셋에 의한 하이브리드 스페로이드 생성의 작동 메커니즘을 보여주는 개략도. (A) 맞춤형으로 설계된 광학 핀셋 설정. (B) 개별 림프종 세포를 MSC 스페로이드 표면에 부착하는 과정. 단일 림프종 세포를 광학적으로 포획하여 안정적인 연결이 형성될 때까지 기질 스페로이드의 표면에 부착했습니다. 이 과정은 기질 스페로이드의 전체 표면이 림프종 세포로 덮일 때까지 계속되었습니다. (C) CD20에 대한 단클론 마우스 항-CD20 항체를 사용하여 하이브리드 스페로이드 절편의 면역조직화학적 염색의 대표적인 이미지를 얻었습니다. 면역염색은 제조사의 지침에 따라 오토염색기( Table of Materials) 상에서 CD20에 대한 단클론 마우스 항-인간 항체를 사용하여 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 현미경 광원을 켭니다.
  2. 레이저에 안전한 보호 유리를 착용하십시오.
  3. 레이저를 켜고 광학 핀셋 시스템에서 약 50pN/μm의 트랩 강성을 얻을 수 있도록 전원을 설정합니다. 계속하기 전에 레이저 빔이 안정화될 때까지 10분 동안 기다립니다.
    참고: 맞춤형 시스템에서는 3μm 폴리스티렌 비드에 대해 측정된 현미경 대물렌즈 입구에서 100mW의 레이저 출력에 대해 트랩 강성이 달성됩니다. 림프종 세포에 대한 최소한의 침습성은 이전에 확인되었으며,32,33, 살아있는 세포를 조작하는 능력을 유지한다.
  4. 그 동안 컴퓨터 소프트웨어를 시작하십시오. 소프트웨어 창에 현미경 샘플의 이미지가 나타납니다. 화면에 표시되는 마커를 사용하여 광학 트랩을 원하는 방향으로 이동합니다.
  5. 시스템이 준비되면 하단 대물렌즈 중앙에 30μL의 탈이온수를 추가합니다.
    참고: 맞춤형 시스템은 침수 목표를 사용합니다. 그러나 이멀젼 미디어는 사용자의 설정에 따라 다를 수 있습니다.
  6. 바닥이 유리인 35mm 세포 배양 접시( 재료 표 참조)를 현미경 스테이지에 놓습니다. 홀더로 접시를 고정하십시오.
  7. 물 구슬이 접시의 유리 바닥에 닿을 때까지 마이크로 미터 현미경 나사를 사용하여 대물렌즈를 들어 올립니다.
  8. 마이크로미터 나사를 사용하여 미세한 s를 부드럽게 조정하십시오.tage 레이저 빔이 화면의 한 개의 밝은 지점에 날카롭게 초점을 맞추는 것을 볼 수 있을 때까지. 현미경 샘플의 이미지가 소프트웨어 창에 표시됩니다. 화면에 표시되는 마커를 사용하여 광학 트랩을 원하는 방향으로 이동합니다.
  9. 미리 준비한 림프종 세포 현탁액 100μL(포인트 3.5 참조)를 유리 바닥 접시의 중앙에 추가합니다. 약 5분 동안 접시 바닥에 가라앉히십시오.
  10. 현미경 스테이지의 움직임을 사용하여 떠다니는 림프종 세포를 찾습니다. 광학 트랩이 화면에 있는 트랩 커서를 클릭하여 샘플에 부딪히도록 합니다. 셀을 원하는 위치로 이동해 보십시오. 셀이 조작에 유용하려면 주어진 방향으로 쉽게 이동할 수 있어야 합니다.
    참고: 우리의 관찰에 따르면, 유리 접시에 첨가된 림프종 세포의 5-10%는 잠복기가 끝난 후 바닥에 영구적으로 부착됩니다. 이 비율은 조작 기간에 따라 증가하며 60분 후에 30%에 도달할 수 있습니다. 그러나 이러한 손실에도 불구하고 초기에 접시에 추가된 세포의 수는 효과적인 시스템 보정과 림프종 세포로 스페로이드를 덮을 수 있습니다.

5. 광학 핀셋을 이용한 하이브리드 스페로이드 생성

  1. 피펫 팁(100-1000 μL)으로 아가로스 곰팡이의 웰에서 단일 기질 스페로이드를 조심스럽게 제거하고 35mm 현미경 유리 바닥 접시에 놓습니다.
  2. RPMI 배양 배지 2mL를 추가하고 표준 조건에서 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 이 시간 동안 스페로이드는 유리에 부드럽게 달라붙어 조작 중 움직임을 방지합니다.
  3. 스페로이드가 들어있는 접시를 현미경 스테이지에 놓고 홀더로 현미경 스테이지에서 접시를 안정화합니다.
  4. 1 x 104 cells/mL의 최종 밀도에서 100 μL의 림프종 세포 용액을 조심스럽게 첨가합니다(3.5단계). 약 5분 동안 접시 바닥에 가라앉히십시오.
  5. 현미경 스테이지의 움직임을 이용하여 떠다니는 림프종 세포를 찾습니다. 광학 트랩이 화면에서 트랩 커서를 클릭하여 선택한 셀에 도달하도록 합니다. 세포가 갇혀 움직일 수 있게 되면 현미경 스테이지를 움직여 세포가 기질 스페로이드 표면과 접촉하도록 전달합니다.
  6. 먼저 림프종 세포를 기질 스페로이드 표면에 10초 동안 부착합니다. 다음으로, 광학 핀셋을 사용하여 림프종 세포를 분리하는 세 번의 반복 시도를 통해 세포가 영구적으로 부착되어 있는지 확인합니다.
  7. 세포 접촉이 끊어진 경우, 광학 트랩을 사용하여 림프종 세포를 스페로이드 표면에 한 번 더 부착합니다. 그러나 이번에는 약 20초로 더 오랜 기간 동안 사용됩니다.
    참고: 각 세포주에 대한 단일 세포 포획을 위한 특정 시간 간격을 개별적으로 결정하는 것이 중요합니다. 예비 조작에서, Ri-1 세포주의 림프종 세포는 기질 스페로이드에 대해 강한 접착 특성을 나타내며, 주로 표면에 10-20초 이내에 부착하는 것으로 확인되었습니다. 따라서, 단일 Ri-1 세포 포획을 위한 특정 접촉 시간 간격은 10, 20 및 30초였습니다. 시간이 많이 소요되는 절차의 특성으로 인해 광학 핀셋을 사용한 스페로이드 형성을 위해 최소 접착 시간이 30초 이하인 세포주를 사용하는 것이 좋습니다.
  8. 기질 스페로이드의 전체 표면이 림프종 세포로 덮일 때까지 후속 림프종 세포에 대해 절차를 반복합니다.
  9. 기질 스페로이드의 사용 가능한 표면을 림프종 세포로 균일하게 덮으려면 현미경 샘플의 부피에서 광학 트랩의 위치를 변경해야 합니다. 마이크로 미터 현미경 나사를 사용하여 이미징 평면을 변경하면 광학 트랩의 위치를 변경할 수 있으며, 이를 통해 샘플에 갇힌 물체를 보다 심오하게 움직일 수 있습니다.
  10. 자발적으로 형성된 스페로이드를 더 잘 나타내려면 기질 세포의 코어를 2-3개의 림프종 세포층으로 덮습니다.
  11. 스페로이드가 들어있는 유리 바닥 접시를 표준 조건에서 1시간 동안 배양하는 동안 인큐베이터로 옮깁니다.
    참고: 하이브리드 스페로이드는 행잉 드롭에서 20μL의 RPMI 배지에서 장기간 배양할 수 있습니다.

6. 스페로이드 생존 능력의 결정

  1. Live/dead staining kit를 사용하여 세포 스페로이드의 생존력을 평가합니다( Table of Materials(재료표 참조). 배양 배지를 부드럽게 제거하고 100μL의 1x PBS로 스페로이드를 직접 세척합니다.
  2. 100μL의 1x PBS 용액에 1μM의 칼세인-AM 및 2μM의 에티듐 호모다이머-1을 함유한 17°C에서 20분 동안 스페로이드를 배양합니다.
  3. 형광 현미경을 사용하여 스페로이드를 관찰하고( Table of Materials(재료 표 참조) 이미지를 캡처합니다( Table of Materials(재료 표 참조).
    알림: 염색 후 스페로이드를 세척할 필요가 없습니다. 이 분석에서는 배경 형광 수준이 본질적으로 낮은데, 이는 염료가 세포와 상호 작용하기 전에 사실상 형광이 아니기 때문입니다.
  4. ImageJ 프로그램( 재료 표 참조)을 사용하여 빨간색(죽은 세포) 및 녹색으로 염색된 전체 영역(죽은 세포)에 대해 녹색으로 염색된 영역(살아있는 세포)의 비율을 계산하여 스페로이드 생존 가능성을 결정합니다.

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결과

이전 연구 결과에서는 림프종 세포와 함께 배양된 중간엽 기질 세포가 암세포가 균일하게 부착하는 균질한 기질 코어를 구성한다는 것을 보여주었습니다18. 이 연구에서는 맞춤형 광학 핀셋을 사용하여 중간엽 기질 세포와 림프종 세포로 구성된 인간 하이브리드 스페로이드를 성공적으로 설계했습니다. 그림 2B 는 광학 핀셋 시스템의 필수 부분인 명시야 현미경의 대표적인 스페로이드를 보여줍니다. 차례로, 그림 2C 는 항-CD20 항체37을 사용한 하이브리드 스페로이드의 면역조직화학적 염색을 보여줍니다. CD20은 이러한 세포의 대다수에 존재하는 B 세포의 일반적인 마커입니다. 하이브리드 스페로이드 구성에 사용되는 모든 림프종 세포는 CD20 항원을 발현하고 갈색으로 염색되는 반면, 기질 세포는 CD20 음성입니다.

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토론

이 연구에서는 중간엽 기질 코어와 림프종 세포의 하이브리드 스페로이드를 광학 핀셋을 사용하여 실시간으로 엔지니어링했습니다. 트래핑 시스템을 포함한 새로운 레이저 기반 기술이 현재 상용화되고 있으며 점점 더 인기를 얻고 있습니다. 그러나 현재까지 대부분의 광학 핀셋은 계속해서 맞춤형 기기입니다. 따라서, 교정, 작동 절차 및 실험 형상은 실험실마다 다를 수 있다38,39. 이 프로토콜은 하이브리드 스페로이드를 실시간으로 제작하기 위해 상용 및 맞춤형 광학 핀셋 시스템을 설정하는 데 필요한 기본 정보를 설명합니다. 광학 핀셋은 숙련된 직원과 함께 첨단 연구 실험실에서 수행되는 실험에 필요한 유연성을 갖추고 있지만, 살아있는 세포를 비침습적으로 "만질" 수 있는 이 방법의 큰 잠재력을 보고 암 연구 분야에 이를 전파하기를 희망했습니다. 특히, OT는 표준 벌크 3D 기술...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 신중한 편집으로 연구의 명확성을 크게 향상 시킨 Nicholas Czarnik에게 진심으로 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
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&마이크로;-접시 35mm, 높은 유리 바닥IBIDI81158
12-256 mico-mold 3D PetriDish Microtissues Inc., RI, USA12-256TR
3 &마이크로; m 폴리스티렌 마이크로스피어Polysciences17134-15
anti CD20 항체 (클론 L26)DakoIS604
자동 세포 카운터, EVENanoEntekEVE/ EVE-MC
Autostainer Link 48DakoD09634
카메라 올림푸스U-TV0.63XC
CelCulture CO2 인큐베이터Esco Technologies, Inc.CCL
세포 계수 슬라이드, EVENanoEntekNE-EVS
세포주 HS-5ATCCCRL-3611
세포주 Ri-1 디에스엠즈 ACC 585
태아 소 혈청GibcoA5256701
형광 현미경 OlympusBX43
ImageJ 프로그램National Institutes of Health, MD, USA
반전 현미경OlympusIX73
Live/Dead 시약 키트 Thermo Fisher ScientificL3224
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)Gibco15140122
인산염 완충 식염수, pH 7.4Gibco10010023
RPMI 1640 배지Gibco11875093
염화나트륨 용액Sigma-Aldrich7647-14-5
염화나트륨 용액 0.9 %, 멸균ITW ReITW 시약, S.R.L.agents, S.R.L.A1671
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
TrypLE Express Enzyme(1X), 페놀 레드없음 Gibco12604013
Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드Gibco25300096
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500
광학 핀셋 설정
Dichroic 미러ThorlabsDMSP805R
디지털 카메라Mikrotron GmbHMC1362
Galvano-mirror XY 스캐닝 시스템ThorlabsGVS002
도립 현미경 올림푸스IX71
렌즈 1ThorlabsAC254-050-B-ML
렌즈 2ThorlabsAC508-200-B-ML
Nd:YAG 1064 nm 레이저레이저 QuantumVentus

참고문헌

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