방법 논문

간세포암(Hepatocellular Carcinoma)의 전신 및 국소 면역 반응에 대한 질량 세포 분석

DOI:

10.3791/67425

⸱

2025년 4월 25일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 간세포 암종(HCC)에서 전신 및 국소 면역 반응을 모두 평가하기 위한 포괄적인 질량 세포 분석(CyTOF(Cytometry by time-of-flight]) 분석 방법을 설명합니다. 이 접근법은 간세포암의 면역 환경에 대한 통찰력을 제공하여 종양 미세환경 및 관련 면역 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 제공하는 것을 목표로 합니다.

초록

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간세포암종(HCC)은 전 세계적으로 가장 흔하고 치명적인 형태의 간암 중 하나입니다. 치료의 발전에도 불구하고 간암 환자의 예후는 유전적, 환경적, 면역학적 요인의 복잡한 상호 작용으로 인해 여전히 좋지 않습니다. 간세포암의 면역 환경을 이해하는 것은 효과적인 치료법을 개발하는 데 중요하며, 특히 면역 요법 분야에서 이는 환자의 결과를 개선할 수 있는 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이 연구는 대량 세포 분석(CyTOF(Cytof)에 의한 세포 분석) 기술을 사용하여 간암 환자의 전신 및 국소 면역 반응을 조사합니다. 이 연구는 말초 혈액 및 종양 샘플을 분석하여 고유한 면역 세포 집단 및 HCC 진행과 관련된 기능 상태를 식별하는 것을 목표로 합니다. 이 연구 결과는 간세포암의 면역 환경에 대한 포괄적인 개요를 제공하여 잠재적인 바이오마커와 치료 표적을 강조합니다. 이 접근법은 간세포의 기저에 있는 면역 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 이 악성 종양에 대한 보다 효과적인 면역 요법을 개발할 수 있는 길을 열어줍니다.

서론

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간세포암종(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 가장 흔한 원발성 간암이며, 높은 발병률과 사망률로 인해 전 세계적으로 중요한 보건 문제를 일으키고 있다1. 세계보건기구(WHO)에 따르면 간암은 전 세계적으로 5번째로 흔한 암이자 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인입니다2. 특히 동아시아와 사하라 사막 이남 아프리카와 같이 만성 B형 및 C형 간염 감염률이 높은 지역에서 널리 퍼져 있습니다3. 주요 위험 요인으로는 바이러스성 간염, 간경변, 대사 증후군4 등이 있다. 간세포암은 장기적인 치료를 필요로 하며, 상당한 신체적, 재정적 부담을 수반하며, 효과적인 예방, 조기 발견 및 혁신적인 치료 전략의 필요성을 강조한다5.

면역 체계는 간세포의 발병에 중요한 역할을 합니다. 간은 면역학적으로 활동하는 기관으로, 간에 상주하는 대식세포, 자연살해세포(NK) 세포, T세포 등 비정상 세포를 모니터링하고 제거하는 데 필수적인 면역세포가 풍부합니다6. 그러나 간세포암은 면역억제 분자를 발현하고, 면역억제 세포를 모집하고, 종양 미세환경을 변경함으로써 면역 감시를 회피할 수 있다 7,8. 이러한 면역 회피는 종양의 성장과 전이를 촉진할 뿐만 아니라 면역요법에 대한 반응에도 영향을 미친다 9,10.

종양 미세환경에서의 전신 및 국소 면역 반응은 암 진행과 치료 결과에 영향을 미치는 핵심 요인입니다. 전신 면역 반응은 말초 T 세포, NK 세포 및 전신의 종양 세포를 표적으로 할 수 있는 단핵구와 같은 멀리 있는 종양 세포를 인식하고 공격할 수 있는 순환 면역 세포를 포함합니다. 국소 면역 반응은 종양 침투 림프구(TIL), 종양 관련 대식세포(TAM) 및 조절 T 세포(Tregs)를 포함한 종양 미세환경 내의 면역 세포 활성에 중점을 둡니다. TIL은 종종 종양 세포에 세포독성 효과를 발휘하지만, TAM과 Tregs는 일반적으로 종양 성장을 지원하는 면역 억제 환경에 기여합니다11,12. 종양 세포와 기질 세포는 면역 억제를 촉진하고 면역 감시를 회피하기 위해 종양 미세환경을 재형성할 수 있습니다. 전신 면역 반응과 국소 면역 반응 간의 상호작용은 항종양 면역의 전반적인 효과를 결정한다11. 이러한 상호작용을 이해하면 보다 효과적인 면역요법 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.

기존의 유세포 분석 및 면역조직화학은 면역학 연구에 널리 사용되지만 포괄적인 고차원 분석을 수행할 수 없기 때문에 복잡한 면역 환경을 분석하는 데 있어 상당한 한계를 보입니다. 유세포 분석은 단일 세포 수준에서 표면 및 기능 마커를 검출하는 데 매우 효과적입니다. 그러나 동시 다중 마커 분석을 위한 능력은 제한되어 있으며, 종종 스펙트럼 중복과 사용할 수 있는 형광 태그의 수에 대한 실질적인 제약으로 인해 제한됩니다13,14. 반면, 면역조직화학(Immunohistochemistry)은 특정 마커의 조직 맥락에 대한 귀중한 통찰력을 제공하지만, 분석 가능한 마커의 수가 제한되어 있고 견고하고 정량적이며 고차원적인 평가를 달성하는 데 내재된 어려움으로 인해 유사한 어려움을 겪고 있습니다15.

복잡한 면역 환경을 효과적으로 특성화하기 위해서는 질량 세포 분석(CyTOF[Time-of-Flight]에 의한 세포 분석)과 같은 고차원 기술이 필수적입니다. 질량 세포 분석은 질량 분석법을 사용하여 단일 세포의 여러 단백질 마커를 분석하는 고급 기술입니다. 이를 통해 기존 유세포분석법(flow cytometry16)에서 볼 수 있는 스펙트럼 중첩 문제 없이 개별 세포에 대한 다중 파라미터 분석이 가능합니다. 금속 태그가 부착된 항체를 사용하여 수십 개의 마커를 동시에 측정할 수 있어 세포 표현형 및 기능에 대한 포괄적이고 편견 없는 관점을 제공합니다17. 예를 들어, Gadalla 등은 말초혈액 단핵세포(PBMC) 및 종양 조직 분석을 위해 40개 이상의 매개변수가 있는 CyTOF 패널을 개발하여 고차원 면역표현형 분석에서 이점을 입증했습니다18. 검출 가능한 파라미터의 수가 제한된 기존의 유세포 분석은 고유한 표현형을 나타내는 이러한 희귀 세포 집단을 식별할 수 없었습니다. 대조적으로, 질량 세포 분석은 이러한 세포의 기능 상태에 대한 포괄적인 평가를 가능하게 하여 보다 상세하고 강력한 특성 분석을 제공했습니다. Behbehani 등은 질량 세포 분석을 활용하여 골수이형성 증후군(MDS) 환자의 골수 샘플을 분석하여 희귀한 비정상적인 조혈전구세포를 성공적으로 식별하고 특성화했습니다18. 40개 이상의 표면 및 세포 내 마커를 동시에 검출할 수 있는 질량 세포 분석의 능력은 이러한 저주파 세포 subset의 검출을 크게 향상시켰습니다19. 이러한 역량은 기존의 한계를 극복하고 면역 환경에 대한 심층적인 통찰력을 제공하여 면역학 및 치료 개발의 발전을 주도합니다. 단세포 수준에서 세포 표현형과 기능을 종합적으로 프로파일링할 수 있는 능력은 면역학적 과정에 대한 이해를 크게 향상시키고 표적 치료법 개발에 도움이 됩니다.

질량 세포 분석은 여러 단백질 마커를 동시에 검출하여 HCC의 전신 및 국소 면역 세포 집단에 대한 포괄적인 통찰력을 제공합니다. 이 기술은 종양 미세환경 내에서 effector T cell, regulatory T cell(Tregs), exhausted T cell과 같은 다양한 유형의 T 세포를 구별하여 종양 진행에 대한 특정 역할을 설명할 수 있습니다. 연구자들은 집단 세포 분석을 활용하여 HCC 예후와 관련된 면역 마커를 확인할 수 있다20. 예를 들어, PD-1(Programmed Cell Death Protein 1) 발현이 높은 T 세포 하위 집합은 면역 관문 억제제에 대한 환자의 반응을 예측하는 변수 역할을 할 수 있습니다21. 또한 특정 면역억제 분자를 식별하여 새로운 치료 표적의 발견을 촉진하여 개인화된 치료 전략의 기반을 제공합니다. 여러 마커를 검출할 수 있는 기술의 능력과 단일 세포 해상도는 새로운 치료 표적을 발견하고 조합 면역 요법을 설계하는 데 특히 유리합니다. 이 고급 접근법은 면역 환경에 대한 자세한 이해를 제공하고 맞춤형 치료 개입의 개발을 가능하게 함으로써 HCC 환자의 치료 결과를 개선할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.

이 연구는 대량 세포 분석을 활용하여 간암 환자의 전신 및 국소 면역 세포 프로파일을 분석하는 것을 목표로 합니다. 목표는 면역 세포 집단을 특성화하고, 이러한 특성을 임상 결과 및 치료 반응과 연관시키며, HCC 예후와 관련된 특정 면역 마커 및 세포 하위 집합을 식별하는 것입니다. 본 연구는 치료 반응에서 다양한 면역세포의 역할을 규명함으로써 개인 맞춤형 치료 전략의 기초를 제공하고자 한다. 이번 연구 결과는 기존 면역요법을 최적화하고 새로운 치료법 개발에 귀중한 통찰력을 제공할 것으로 기대되며, 궁극적으로 간암 환자의 전반적인 생존과 삶의 질을 향상시키는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

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혈액 및 HCC 샘플 수집, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 분리, 단일 세포 해리 및 염색 단계는 다음 계획에 요약되어 있습니다. 실험용 시약과 재료는 모두 재료 표에 나열되어 있습니다. 모든 실험은 저장대학교 의과대학 제1부속병원 윤리위원회의 승인 하에 수행되었으며, 종양 샘플 채취가 병리학적 진단을 방해하지 않도록 했습니다. 모든 피험자로부터 서면 동의서를 받았습니다.

1. PBMC의 절연

  1. 간암 환자의 정맥에서 혈액 샘플을 채취하고 항응고제로 채워진 튜브를 사용하여 혈액 응고를 방지합니다. 혈액 샘플은 평균 연령이 55세인 50-60세의 환자 4명(남성 2명, 여성 2명)으로부터 채취했습니다. 각 환자에 대해 10-20mL의 말초 혈액을 수집하여 환자의 불편함을 최소화하면서 후속 PBMC 분리를 위한 충분한 부피를 확보합니다.
  2. 특정 부피의 혈액(예: 6mL)을 추출하고 동일한 부피의 말초 혈액 림프구 분리 액체(Ficol-paque 또는 Lymphoprep)를 15mL 원심분리 튜브에 추가합니다.
    알림: 총 부피는 적절한 혼합을 위한 공간을 확보하고 오버플로를 방지하기 위해 이상적으로는 12mL를 초과하지 않아야 합니다. 15mL 원심분리 튜브의 최대 권장 용량은 14mL입니다.
  3. 원심분리기 튜브를 45°로 기울이고 튜브 벽을 따라 혈액을 천천히 첨가하고 두 층이 섞이지 않도록 말초 혈액 림프구 분리 액체 위에 혈액을 천천히 올려놓습니다.
    알림: 피펫을 사용하여 튜브 벽을 따라 천천히 혈액을 추가할 수 있습니다.
  4. 원심분리기 튜브를 원심분리기에 놓고 가속도를 8로, 감속을 3으로 설정합니다. 450 x g, 4°C에서 30분 동안 원심분리기 원심분리 후 시험관에는 플라즈마층, PBMC(백색막층), 피콜파크층, 적혈구 및 과립구층의 위에서 아래로 4개의 층이 형성됩니다.
  5. 피펫을 사용하여 PBMC 층을 새 멸균 원심분리 튜브에 조심스럽게 모읍니다. PBS 부피의 3배를 넣고 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 합니다. 원심분리 후 튜브 바닥에 펠릿이 형성됩니다.
  6. 피펫을 사용하여 상등액을 버리고 2% FBS-PBS(Fetal Bovine Serum-Phosphate Buffered Saline) 1mL를 첨가하여 세포를 재현탁한 다음 적혈구(RBC) 용해 완충액 3mL를 추가합니다. 500 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기.
  7. 튜브 바닥에 적혈구가 없는지 확인하여 적혈구가 완전히 용해되었음을 나타냅니다. 세포를 2% FBS-PBS에 재현탁시키고 후속 실험을 직접 진행하거나 세포 동결보존 용액을 첨가하고 -80°C에서 2-3개월 동안 보관합니다.
    참고: 일반적인 지침으로, 재부유의 경우 1 x 106 세포당 0.5mL의 2% FBS-PBS를 사용합니다. 세포 수는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 트리판 블루 염색 후 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 측정됩니다. 이 비율은 후속 절차에서 최적의 세포 회수와 생존력을 보장하는 데 도움이 됩니다.

2. 종양 조직 세포의 분리

참고: 종양 조직 세포를 분리하는 방법은 Song et al.22에서 채택되었습니다.

  1. 병리학자의 안내에 따라 간암을 절제한 후 멸균 메스를 사용하여 종양 조직의 일부를 절제합니다. 조직 블록은 약 1cm3 인치 크기여야 합니다. 미리 냉각된 1x PBS로 표면 얼룩을 헹굽니다. 10% FBS가 포함된 약 5mL의 RPMI 1640 배지가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브에 조직을 담그십시오. 튜브를 얼음 위에 놓고 추가 처리를 위해 실험실로 다시 운반합니다.
  2. 혈흔을 철저히 헹구고 집게를 사용하여 지방 결합 조직을 수동으로 제거하여 사전 냉각된 2% FBS-PBS로 조직을 완벽하게 청소합니다. 조직을 소화 용액이 들어 있는 조직 배양 처리된 접시로 옮깁니다. 종양 조직을 집게로 고정하고 메스로1mm3보다 작은 조각으로 자릅니다. 조직 분해 용액을 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 총 부피가 약 15mL가 될 때까지 조직 분해 용액을 더 추가합니다.
  3. 조직 분해 혼합물이 들어 있는 원심분리 튜브를 셰이커에 넣습니다. 기울이거나 평평하게 펴고 150rpm 및 37°C에서 1시간 동안 소화할 수 있도록 고정합니다. 70μm 필터를 통해 분해 용액을 여과합니다.
    1. 이 과정에서 1mL 주사기 플런저를 사용하여 조직 조각을 분쇄합니다. 2% FBS-1640 용액으로 필터를 헹굽니다. 여과액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  4. 여과액을 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 상층액을 버리십시오. 약 10mL의 36% Percoll 용액에 펠릿을 조심스럽게 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.
  5. 피펫으로 1mL의 RBC 용해 완충액을 부드럽게 흡인하여 세포 현탁액을 재현탁합니다. 현탁액을 새로운 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 RBC 용해 완충액을 추가하여 총 부피가 10mL에 도달하도록 합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 그대로 두십시오.
    참고: 새로운 원심분리기 튜브를 사용하여 튜브 벽의 불순물이 세포 현탁액으로 다시 유입되는 것을 방지하여 세포 수율 감소의 위험을 줄입니다.
  6. 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리한 다음 2% FBS-PBS의 적절한 부피로 세포를 재현탁합니다. 일반적인 지침으로, 재부유를 위해 1 x 106 세포당 0.5mL의 2% FBS-PBS를 사용합니다.
    참고: 세포 수는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 트리판 블루 염색 후 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 결정됩니다. 재현탁액은 후속 실험에 필요한 세포 수량에 따라 달라집니다. 이 비율은 후속 절차에서 최적의 세포 회수와 생존력을 보장하는 데 도움이 됩니다.

3. 시스플라틴 염색

  1. 1.7단계에서 얻은 PBMC와 2.6단계에서 분리한 종양 세포에서 각각 3 x 106 세포를 채취합니다. 세포 회복 후 Ca2+ 및 Mg2+ 없이 PBS 1mL에 재현탁합니다. 시스플라틴을 최종 농도 0.5μM까지 첨가하고 잘 섞은 다음 실온에서 2분 동안 배양합니다.
    참고: 시스플라틴 염색은 멤브레인 무결성을 기반으로 죽은 세포와 살아있는 세포를 구별하기 위해 수행됩니다. 세포막이 손상된 죽은 세포는 시스플라틴을 흡수하여 긍정적인 신호를 보내는 반면, 살아있는 세포는 염색되지 않은 상태로 남아 있습니다23. 셀 수는 1 x 106 이상이어야 합니다.
  2. 실온에서 5분 동안 500 x g 의 튜브를 원심분리하고 상층액을 버린 다음 3.1단계에서 준비한 세포 현탁액이 들어 있는 각 튜브에 1mL의 세포 염색 완충액을 추가하여 반응을 중지합니다. 실온에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고, 상층액을 버리고, 원심분리 후 세포 펠릿이 튜브 벽을 따라 선형으로 분포되지 않도록 합니다.

4. Fc 수용체 차단

  1. 각 샘플에 대해 50μL 블록 혼합물을 미리 준비합니다: 48μL의 세포 염색 완충액을 결합한 다음 2μL의 Fc 차단 용액을 추가합니다(세포 염색 완충액: Fc 차단 용액=9:1).
  2. 위의 혼합물에서 3.2 단계의 세포를 현탁시키고 10 분 동안 실온에 두십시오.

5. 막 단백질 항체의 배양

  1. 4.2단계에서 얻은 각 세포 샘플에 대해 각 항체를 1.1μL 단위로 추가하여 멤브레인 단백질 항체 혼합물을 준비합니다. 그런 다음 세포 염색 완충액을 추가하여 최종 부피인 55μL에 도달합니다. 이 시점에서 총 부피는 약 100μL입니다.
    참고: 혼합물에는 CD163, CCR3, CD141, CD117 및 CD45와 같은 주요 막 단백질을 표적으로 하는 항체가 포함됩니다24,25. 이러한 항체는 막 단백질 마커를 식별할 때 특이성을 고려하여 선택되었으며 상업적으로 이용 가능한 출처에서 얻었습니다(클론 번호, 제조업체 및 카탈로그 번호를 포함한 자세한 내용은 재료 표 참조).
  2. 준비된 항체 혼합물 50μL를 각 튜브 샘플에 추가하고 총 부피를 100μL로 가져옵니다. 샘플을 부드럽게 소용돌이치고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 각 샘플에 2mL의 세포 염색 완충액을 추가하고 실온에서 500 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버립니다. 이 단계를 2회 반복합니다.
  4. 상등액을 버리고 남은 액체를 세포 펠릿과 함께 잠시 와류시켜 세포를 재현탁시키고 완전히 분산시킵니다.

6. 핵 단백질 염색

  1. 세포가 완전히 재현유탁되면 5.4단계의 각 샘플에 500μL의 혼합 용액(고정: 고정/투과화 = 3:1)을 추가합니다. 샘플을 부드럽게 혼합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 투과 완충액(10x)을 탈이온수로 희석합니다. 배양 후 실온에서 500g으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 버린다. 각 튜브에 1000μL의 1x 투과 완충액을 추가하여 세포를 세척합니다. 실온에서 1,000 x g 으로 5분 동안 원심분리기를 한 다음 상층액을 버립니다.
  3. 1x 투과화 완충액에 항체를 재현탁합니다. 상층액을 버리고 항체 혼합물 50μL를 세포의 각 튜브에 첨가합니다. 세포를 부드럽게 피펫으로 넣어 혼합한 다음 실온에서 30-45분 동안 배양합니다.
  4. 각 튜브에 1000μL의 1x 투과화 완충액을 추가하고 실온에서 1,000 x g 로 5분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버립니다.
  5. 각 튜브에 1000μL의 세포 염색 완충액을 추가하여 세포를 다시 현탁시키고 실온에서 1,000 x g 의 실온에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.

7. 세포 정착

  1. PBS에서 1.6% 포름알데히드 용액을 준비하며 샘플당 1mL가 필요합니다.
  2. 6.5단계의 각 샘플에 1.6% 포름알데히드 용액 1mL를 넣고 와류를 일으켜 완전히 혼합한 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    참고: 포름알데히드는 세포 고정에 일반적으로 사용되지만 4% 파라포름알데히드(PFA) 또는 메탄올과 같은 대체 시약도 사용할 수 있습니다. 정착제의 선택은 실험의 특정 요구 사항과 관찰할 세포 특징을 기반으로 해야 합니다.
  3. 실온에서 800 x g 으로 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.

8. 핵 삽입 염색

  1. 세포 삽입 용액 준비: Cell-ID Intercalator-Iridium(Ir)을 Fix 및 투과 완충액으로 최종 농도 125nM로 희석합니다. 샘플당 1mL의 용액을 준비합니다.
  2. 준비된 cell intercalation 용액 1mL를 7.3단계의 각 고정 샘플에 추가합니다. 부드럽게 섞고 즉시 소용돌이치십시오. 이는 세포 응집체의 형성을 최소화하는 데 도움이 됩니다.
  3. 실온에서 1시간 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 실온에서 500g에서 5분간 원심분리기를 하고 상등액을 버립니다.

9. 세포 현탁액의 준비

  1. 8.3단계에서 1000μL의 세포 염색 완충액을 튜브에 추가하고 800 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 이 단계를 2회 반복합니다.
  2. 450 μL에서 900 μL의 탈이온수를 첨가하여 세포를 재현탁시킵니다. 트리판 블루 염색 후 혈구계 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수합니다. 계수 후 질량 세포 분석을 사용하여 데이터 수집 및 분석을 진행합니다.

10. 질량 세포 분석 및 데이터 분석

  1. CyTOF 시스템을 사용하여 질량 세포 분석 데이터를 수집하고 이를 FCS(Flow Cytometry Standard) 파일로 저장할 수 있습니다. 제조업체의 지침에 따라 배경 소음과 배치 효과를 줄이기 위해 적절한 기기 교정 및 품질 관리를 보장하십시오.
  2. 관련 소프트웨어를 사용하여 FCS 파일의 CD45+ 세포 집단을 전처리합니다. 세포 크기(전방 산란, FSC) 및 입도(측면 산란, SSC)에 따라 이물질을 제거합니다. FSC-A/FSC-H 또는 SSC-A/SSC-H 플롯의 순차 게이팅을 통해 이중선을 제외합니다. 시스플라틴 배제와 같은 생존력 염색을 사용하여 죽은 세포를 제거합니다. CD45+ 집단을 게이트하여 면역 세포에 집중하고 추가 분석을 위해 게이트 집단을 내보냅니다.
  3. 보조 인자 5로 데이터를 변환하고 클러스터링 소프트웨어를 사용하여 주클러스터를 식별합니다. SPADE(Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events) 알고리즘을 기반으로 클러스터링을 수행하여 유사한 마커 발현 프로파일을 가진 셀을 클러스터26으로 그룹화합니다. HSNE(Hierarchical Stochastic Neighbor Embedding)를 사용하여 차원 축소 및 개별 클러스터식별 26.
  4. 비지도 클러스터링을 위해 R 소프트웨어의 cytofkit 패키지를 사용하여 주요 클러스터의 재클러스터링을 수행합니다. 기본 파라미터를 사용하여 PhenoGraph로 하위 클러스터를 식별합니다.
  5. 차원 축소를 위해 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection)를 적용합니다. P-값 < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하여 Wilcoxon 검정을 사용하여 통계 분석을 수행합니다. ggplot2를 사용하여 결과를 시각화합니다.

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결과

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HCC와 관련된 면역학적 특성을 밝히기 위해 면역 세포 집단에 대한 포괄적인 분석을 수행했습니다. 한 쌍의 PBMC와 HCC 조직 샘플은 4명의 HCC 환자로부터 수집되었습니다. PBMC와 HCC 조직 샘플 모두에 대해 두 개의 항체 패널을 사용하여 단일 세포 단백질체 수준에서 면역 세포 집단을 검사하기 위해 질량 세포 분석 프로파일링을 수행했습니다.

품질 관리 후 45,326개의 세포가 질량 세포 분석 분석에 포함되었습니다. PhenoGraph 클러스터링 알고리즘은 t-SNE와 함께 2차원 그래프를 생성하고 세포를 별개의 표현형으로 분할하는 데 사용되었습니다. 주요 면역 세포 subset은 CD3 (T 세포), CD4 (CD4+ T 세포), CD8 (CD8+ T ...

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토론

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이 연구는 대량 세포 분석 기술을 활용하여 HCC의 전신 및 국소 면역 반응에 대한 심층 분석을 제공합니다. 이러한 맥락에서 질량 세포 분석을 적용하면 단일 세포 수준에서 여러 마커를 동시에 검출할 수 있으며, HCC의 복잡한 면역 환경을 이해하는 데 중요한 상세한 면역 표현형 특성 분석을 제공할 수 있습니다. 질량 세포 분석은 고차원 단일 세포 분석을 용이하게 하여 면역학 연구에 혁명을 일으켰습니다. 이 기술은 항체에 접합된 희귀 금속 동위원소 태그를 사용하여 한 번의 실행으로 40개 이상의 파라미터를 동시에 측정할 수 있습니다. 이 능력은 종양 미세환경(TME)이 높은 수준의 세포 이질성과 복잡한 면역 상호작용을 특징으로 하는 간세포암을 연구하는 데 특히 유리합니다18,29.

기존 유세포 분석에 비해 질량 세포 ...

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국가 핵심 연구 개발 프로그램(J.S.에 보조금 2019YFA0803000), Zhejiang Scientific의 우수한 청년 재단(J.S.에 보조금 R22H1610037), 중국 국립 자연과학재단(J.S.에 82173078 보조금), 저장성 자연과학재단(J.S.에 보조금 2022C03037)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD740415
Cell cryopreservation

참고문헌

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