방법 논문

골격근 간질성 세포외 소포체의 효소 분리

DOI:

10.3791/67439

⸱

2025년 2월 7일

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center, Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Science, University of Georgia

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 기계적 분리, 효소 해리, 여과 및 차등 초원심분리를 통해 설치류 근육 조직에서 골격근 간질성 세포외 소포체(SkM-EV)를 분리하고 정제하는 것을 목표로 합니다. 일관성과 신뢰성을 보여줍니다. 분리된 SkM-EV는 근육 항상성 및 질병에 대한 통찰력을 제공하며, 진단 바이오마커 또는 치료 수단으로 응용될 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포외 소포체(EV)는 세포 간 통신을 위해 단백질, RNA 및 DNA와 같은 생체 활성 화물을 운반하기 위해 세포에서 방출되는 지질 이중층으로 둘러싸인 나노 입자입니다. 근육 항상성 및 질병에서 세포 간의 EV 매개 누화를 조사하는 것은 근육 발달, 재생 및 위축에 대한 이해를 높일 수 있는 상당한 잠재력을 제공합니다. 그러나 골격근 유래 EV(SkM-EV)를 분리하기 위한 현재 프로토콜은 주로 세포막을 손상시키지 않고 근육 조직에서 EV를 방출하는 데 어려움이 있기 때문에 높은 순도와 수율을 달성하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 이 기사에서는 기계적 분리, 효소 분리, 여과 및 초원심분리로 구성된 SkM-EV 분리를 위한 효율적인 프로토콜을 제시합니다. 이러한 단계는 근육 조직에서 EV 방출을 향상시키도록 최적화되어 고순도 SkM-EV를 생성합니다. 그 후, 나노 유세포 분석, BCA 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 분리된 SkM-EV의 양과 품질을 특성화합니다. 이 프로토콜은 기초 연구, 질병 진단 및 약물 전달을 발전시키기 위한 조직 유래 EV를 얻을 수 있는 신뢰할 수 있는 플랫폼을 구축할 수 있는 가능성을 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포외 소포체(EV)는 세포가 세포외 환경으로 방출하는 나노 크기의 막 결합 입자입니다. 이 EV는 핵산, 단백질 및 지질을 전달하여 수용 세포의 흡수 시 여러 신호 전달 경로를 조절합니다. 구체적으로, 골격근(SkM-EV)에서 분리된 EV는 근육 조절 microRNA 또는 전사 인자 1,2,3,4를 전달하여 근육 퇴행, 재생 및 성장에 관여했습니다. SkM-EV 하위집단 및 특성에 대한 이해가 계속 발전함에 따라 이러한 소포는 조기 진단을 위한 바이오마커 5,6 및 신경근 질환의 치료 표적으로서 가능성을 보여주고 있습니다. 이 확장 분야는 병리학 연구와 임상 응용 분야 모두에 흥미로운 기회를 제공합니다.

SkM-EV에 대한 현재 연구는 주로 체외 배양 2,7,8 후 세포 배양 상층액에서 얻은 것에 초점을 맞추고 있으며, 이는 연속적인 통과 후 표적 세포주의 충실도와 인공 환경에서의 변화에 대한 EV 특성의 민감성에 대한 우려를 제기합니다. 이는 생체 외 배양 영향을 피하고 생체 내 조건을 더 잘 표현하기 위해 SkM-EV를 근육 조직에서 직접 분리해야 할 필요성을 강조합니다. 근육 조직에서 EV를 분리하기 위한 여러 접근법이 개발되었지만9,10, 연구는 여전히 프로토콜 세부 사항에서 크게 달라 일관성과 비교 가능성에 영향을 미칩니다. 관련 연구 전반에 걸쳐 신뢰성을 보장하기 위해 SkM-EV 분리 및 특성화를 위한 표준화된 프로토콜이 시급히 필요합니다.

골격근의 생리학적 특성을 고려하여 기계적 분리, 효소 해리, 여과 및 차등 초원심분리를 사용하여 설치류 골격근 샘플에서 SkM-EV를 분리하고 정제하는 프로토콜을 개발했습니다. 나노 유세포 분석, BCA 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 사용한 포괄적인 분석을 통해 이 프로토콜이 제한된 시간 내에 고순도 및 수량의 SkM-EV를 일관되게 수율한다는 것을 발견했습니다. 급성 및 만성 근육 부상을 포함한 다양한 조건의 골격근 샘플에 적용할 수 있습니다. 또한, 적절한 조정을 통해 이 방법은 인간 환자 또는 다른 동물 모델의 근육 조직에 맞게 조정할 수 있습니다. SkM-EV 분리 공정의 표준화는 SkM-EV 품질의 일관성을 보장하고, 수율, 크기, 화물 구성 및 기능과 같은 EV 특성의 비교를 용이하게 하며, 진단 바이오마커로서의 잠재적 응용 분야를 발전시키고, 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 그들의 역할에 대한 이해를 높이는 데 필수적입니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 기계적 분리, 효소 해리, 여과 및 차등 초원심분리를 사용하여 골격근 조직에서 세포외 소포체(EV)를 분리합니다. 이를 통해 경골 전방(TA), 장신근 신전(EDL), 가자미암(SOL), 비복근(GAS) 및 대퇴사두근(QUA)을 포함한 개별 또는 결합된 설치류 사지 근육 그룹에서 EV를 격리할 수 있습니다. 동물 사용은 조지아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며, 이 연구는 연구에서 동물의 관리 및 사용에 대한 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 지침을 준수했습니다. 동물들은 조지아 대학의 동물 및 유제품 과학과 내의 동물 시설에 수용되었습니다. 이 연구에서는 야생형(C57BL/6J) 성체 수컷 마우스를 사용하였으며, 생후 3개월에 희생된 마우스에서 조직을 채취하였다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나와 있습니다.

1. 마우스에서 근육 그룹의 기계적 분리

  1. CO2로 마우스를 안락사시킨 다음 자궁경부 탈구를 수행합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 양쪽 뒷다리를 면도합니다.
  2. 다리의 앞쪽이 위쪽을 향하도록 하여 마우스 다리를 멸균 플레이트에 고정합니다(그림 1A).
  3. 해부 가위를 사용하여 마우스 발목 측면의 피부를 작게 절개(5mm)합니다.
  4. 가위의 한쪽 날을 절개 부위에 조심스럽게 삽입하여 피부 아래에 위치시키되 밑에 있는 근육 조직에는 놓지 않습니다. 그런 다음 피부를 무릎 쪽으로 위쪽으로 잘라 절개 길이를 늘립니다.
  5. 끝이 거친 핀셋을 사용하여 절개 부위의 피부를 잡고 근육이 보일 때까지 구멍을 확장합니다.
  6. 경골11의 측면에서 무릎에서 발목까지 이어지는 TA 근육을 찾고 날카로운 핀셋을 사용하여 근육을 덮고 있는 결합 조직의 얇은 층을 잡고 벗겨냅니다(그림 1B).
  7. 발목 근처에서 TA 끝에 있는 두 개의 힘줄을 식별하는데, 하나는 TA 근육에 직접 연결되고 다른 하나는 더 작고 측면의 TA 힘줄 옆에 위치한 EDL 힘줄을 식별합니다. 해부 가위를 사용하여 양쪽 힘줄을 절단합니다.
  8. 끝이 거친 핀셋으로 양쪽 힘줄을 잡습니다. 그런 다음 거칠거나 날카로운 핀셋을 다른 한 쌍의 핀셋을 사용하여 힘줄을 분리하여 EDL에서 TA를 분리합니다(그림 1C).
  9. 거친 핀셋으로 갓 절단한 힘줄을 잡고 TA를 들어 올립니다. 그런 다음 절개 가위를 사용하여 무릎 근처의 TA 힘줄을 잘라 근육을 제거합니다. 이 과정을 반복하여 EDL을 제거하고 두 근육을 얼음 위의 PBS에 저장합니다.
  10. 다리를 놓고 마우스를 뒤집어 뒤쪽 면이 위를 향하도록 합니다.
  11. 이제 다리의 피부가 부분적으로 제거된 상태에서 해부 가위를 사용하여 발목 근처의 피부를 자릅니다. 그런 다음 거친 핀셋을 사용하여 무릎 뒤쪽으로 위쪽으로 피부를 잡고 벗겨 가스를 노출시킵니다.
  12. 해부 가위를 사용하여 발목 근처의 가스 힘줄을 절단합니다(그림 1D).
  13. 거친 핀셋으로 GAS 힘줄을 잡고 위로 들어 올려 GAS의 아래쪽을 노출시킵니다.
  14. 무릎에 가까운 GAS 아래쪽에 있는 작은 SOL 힘줄을 찾습니다(GAS가 여전히 연결되어 있는 곳). 절개 가위를 사용하여 SOL 힘줄을 절단하여 SOL이 위쪽으로 수축하도록 합니다(그림 1E).
  15. 끝이 날카로운 핀셋으로 절단된 SOL 힘줄을 잡고 부드럽게 들어 올려 GAS 아래쪽에서 SOL을 분리합니다.
  16. 해부 가위를 사용하여 GAS의 절단된 끝에 부착되는 SOL의 끝을 절단하여 두 근육을 분리합니다. 얼음 위의 PBS에서 SOL을 보존합니다.
  17. 무릎 근처의 GAS 끝을 잘라 얼음 위의 PBS에 놓습니다.
  18. 무릎 아래에 나열된 4개의 근육을 제거한 후 앞쪽 얼굴이 위쪽이 되도록 마우스를 뒤집습니다.
  19. 필요한 경우 거친 핀셋으로 피부를 더 벗겨 QUA를 노출시킵니다. 마우스 다리를 90° 각도로 배치하여 QUA가 구부러지도록 합니다. 해부 가위를 사용하여 무릎에 가장 가까운 힘줄을 절단합니다.
    1. QUA가 근위 힘줄로만 연결될 때까지 근육과 뼈 사이를 절단하여 QUA를 대퇴골에서 분리합니다(그림 1E). 그런 다음 근위 힘줄을 절단하고 QUA를 제거합니다. PBS의 QUA를 얼음 위에 놓습니다.
  20. 근육 박리 후 경골과 비골이 명확하게 노출되어 있는지 확인하십시오(그림 1F).
  21. PBS로 근육을 여러 번 헹구어 털과 혈액과 같은 오염 물질을 제거합니다(그림 1G). 그런 다음 종이 타월로 근육을 부드럽게 말리십시오. 분석 저울을 사용하여 근육량을 측정하고, 나중에 근육 그램당 수집된 EV를 계산하는 데 사용됩니다.

2. 분리된 근육 덩어리의 효소 해리

  1. 끝이 뾰족한 핀셋, 파편 핀셋, 메스 또는 가위를 사용하여 근육 샘플에서 근육 힘줄을 부드럽게 제거합니다(그림 2A).
  2. 힘줄을 제거한 후 가위나 메스를 사용하여 근육 섬유(힘줄에서 힘줄까지)를 따라 세로로 근육을 1mm 두께의 근육 덩어리로 잘라 표면적 대 부피 비율을 높입니다(그림 2B, C).
    알림: 절단 중 근섬유 손상을 제한하십시오. TA, GAS 및 QUA와 같은 큰 근육의 경우 EDL 및 SOL과 같은 작은 근육에 비해 추가 절단을 수행하여 모든 근육 샘플에서 거의 동일한 표면적 대 부피 비율을 보장합니다(그림 2D).
  3. 각 마우스에 대해 10mL의 신선한 소화 효소 완충액(DEB)을 준비하고 사용할 때까지 얼음에 보관합니다.
    1. DEB를 준비하려면 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 1mL당 콜라겐분해효소 II 효소 2mg을 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액과 혼합합니다. 혼합 후 0.2μm 필터를 통해 용액을 여과합니다.
    2. DEB가 250단위 이상의 효소 활성을 갖도록 합니다. 용액이 완전히 혼합되고 콜라겐 분해 효소 II 효소 분말이 더 이상 보이지 않을 때까지 DEB를 소용돌이칩니다.
  4. 근육 조직을 각각 20mg의 근육 조직을 함유하는 부분 표본으로 분리합니다. 그런 다음 효소 해리를 위해 각 부분 표본에 1mL의 DEB를 추가합니다.
  5. DEB와 근육 혼합물을 인큐베이터의 셰이커에서 37°C에서 12시간 동안 분당 100회전(rpm)의 진탕 속도로 배양합니다(그림 2E).

3. SkM-EV를 풍부하게 하는 여과 및 저속 원심분리

알림: 냉장 원심분리기를 4°C로 설정하고 설정 온도에 도달할 때까지 작동하십시오. 사용할 준비가 될 때까지 필요한 모든 튜브와 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

  1. 효소 분해 절차에 따라 식별할 수 있는 근육 덩어리가 보이지 않는지 확인합니다(그림 3A). 냉장 원심분리 전에 DEB-근육 혼합물에서 10μL의 용액을 추출하고 필요한 경우 세포 생존도 테스트를 위해 0.2mL 튜브에 옮깁니다.
  2. 비어 있는 새 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하고 라벨을 부착합니다. 플런저를 제거하고(버리지 않음) 허브를 0.45μm 필터의 상단 끝에 나사로 고정하여 0.45μm 필터와 5mL 주사기를 설정합니다. 아래쪽 끝이 새로 라벨이 붙은 빈 튜브에 놓이도록 필터를 배치합니다(그림 3D). 0.2μm 필터를 통해 1x PBS를 필터링합니다.
  3. 혼합물을 1,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 파편을 펠릿화합니다(그림 3B). P200 마이크로 피펫을 사용하여 상층액(약 1mL)을 주사기로 옮깁니다(그림 3C,E).
  4. 주사기 플런저를 다시 삽입하고 상층액을 필터를 통해 천천히 밀어 넣어 상층액이 통과하여 새로 라벨링된 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 모이도록 합니다(그림 3F).
  5. 플런저를 다시 제거하고 약 200μL의 1x PBS를 주사기에 피펫팅합니다.
  6. 플런저를 다시 삽입하고 200μL의 1x PBS를 필터(그림 3G)를 통해 천천히 밀어 필터에 남아 있는 상층액을 제거하고 라벨이 부착된 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 넣습니다.
  7. 각 조직 샘플에 대해 새 필터를 사용하여 다른 튜브에 대해 여과 과정을 반복합니다.
  8. 여과 후에는 용액이 투명하고 잔류 근육 덩어리가 없는지 확인합니다(그림 3H).

4. SkM-EV 정제를 위한 차등 초원심분리

알림: 냉장 원심분리기를 4°C로 설정하고 설정 온도에 도달할 때까지 작동하십시오. 필요한 모든 튜브와 샘플을 얼음 위에 보관하고 사용할 수 있도록 준비하십시오.

  1. 여과된 용액을 새로운 1.5mL 마이크로튜브(최대 200,000 x g에 적합)로 옮깁니다. 마이크로 초원심분리기에 넣기 전에 모든 마이크로튜브를 추가 1x PBS로 균형을 유지하여 동일한 부피를 보장합니다.
  2. 모든 튜브의 부피가 동일한지 확인한 후 튜브를 닫고 균형을 맞출 마이크로 초원심분리기의 로터에 넣습니다(그림 4A).
  3. 마이크로 초원심분리기를 켜고 100,000 x g 및 4°C에서 4시간 동안 작동하도록 설정합니다(그림 4B).
  4. 튜브가 로드된 로터를 마이크로 초원심분리기에 넣고 뚜껑을 닫은 다음 진공을 켭니다(그림 4C).
  5. 진공이 레벨 2에 도달하면 시작 버튼을 누르고 원심분리 프로세스가 완료될 때까지 기다립니다(그림 4D).
  6. 마이크로 초원심분리기 사이클이 완료되면 로터와 튜브를 제거하기 전에 진공 버튼을 클릭하여 챔버를 재가압합니다. 튜브를 얼음 위에 유지하고 펠릿을 방해하지 않도록 똑바로 세웁니다.
  7. 펠릿의 방해를 피하면서 P200 마이크로피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다(그림 4E).
  8. 팁을 배출한 다음 P200 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거한 후 50μL의 1x PBS를 튜브에 추가합니다. GAS 및 QUA 샘플의 경우 용해를 돕기 위해 최대 500μL의 1x PBS를 추가합니다(그림 4F).
  9. P20 마이크로피펫(또는 500μL가 추가된 경우 P200 마이크로피펫)을 사용하여 펠릿이 완전히 파괴되어 더 이상 보이지 않을 때까지 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁합니다.
  10. 튜브를 닫고 단기 보관(1주일 미만)의 경우 4°C, 장기 보관의 경우 -80°C에서 보관하거나, 나노 유세포 분석, 웨스턴 블롯 또는 기타 분석을 사용하여 샘플을 즉시 특성화할 경우 튜브를 다시 얼음 위에 놓습니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에 따라 야생형 마우스의 전경골(TA), 장신근(EDL), 가자미암(SOL), 비복근(GAS) 및 대퇴사두근(QUA)을 포함한 다양한 근육 그룹에서 골격근 세포외 소포체(SkM-EV)를 성공적으로 추출했습니다. 이러한 SkM-EV의 후속 특성 분석은 나노 유세포 분석을 통해 수행되었으며, 표 1에 요약된 바와 같이 고유한 특징을 규명했습니다. 놀랍게도, 단 1g의 근육 조직에서 1.18e14 ± 4.86e13 SkM-EVs의 인상적인 수율을 얻었으며, 평균 입자 크기는 73.93nm ± 2.70nm, 중간 입자 크기는 72.55nm ± 2.42nm였습니다. 크기 분포는 13.28nm ± 1.71nm의 차이를 보였으며(그림 5), 이는 EV12,13의 인식된 정의와 정확하게 일치합니다.

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 마우스에서 뒷다리 근육 그룹을 해부하거나 사용 가능한 프로토콜16에 따라 사후 인간 근육 조직을 획득하는 것으로 시작됩니다. 다음 골격근 세포외 소포체(SkM-EV) 분리 절차는 간질성 SkM-EV를 방출하기 위한 조직의 경미한 효소 소화, 여과 및 저속 원심분리, 초원심분리의 세 가지 주요 섹션으로 구성됩니다. 마지막으로, 분리된 SkM-EV를 프로파일링하기 위해 다양한 기술이 적용됩니다.

사지 근육의 크기, 근섬유 유형 및 외부 자극에 대한 저항성 측면에서 사지 근육 간의 중요한 차이를 고려하여17, 이 프로토콜은 경골 전방(TA), 장신근 신전(EDL), 가자미근(SOL), 비복근(GAS) 및 대퇴사두근(QUA)을 포함한 각 개별 근육에서 SkM-EV를 분리하기 위한 자세한 절차를 제공합니다. 마우스에서 근육 그룹을...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 국방부 W81XWH2210261(Yao Yao에게)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.6 mL 마이크로 원심분리기 튜브ThermoFisher Scientific05-408-120
1.5 mL 마이크로 튜브 (C) Eppendorf5720411009
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브ThermoFisher Scientific3448Clear, graduated, nonsterile
BD 5 mL 주사기Becton Dickinson14-827-52 Luer-Lok 팁
Cell Counting Slides, Cell Counter용 이중 챔버Bio-Rad145-0011
Centrifuge 5430REppendorf22620667
Cleaning solutionNanoFCM Inc.
Collagenase IIWorthington Biochemical CorporationLS004176
DPBS (10x) 액체 (-칼슘,-마그네슘)CytivaSH30378.02최종 사용 희석액은 1x
DPBS/Modified (1x)CytivaSH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Genesee Scientific25-500
E-POD Pure 물 원격 디스펜서Millipore SigmaZRXSP0D01
FA-45-30-11 마이크로 원심분리기 로터Eppendorf05-401-503
Fisher Vortex Genie 2ThermoFisher Scientific12-812
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 일반 프로토콜 오븐ThermoFisher Scientific51028112중력 대류, 2.3 cu.ft. 120 V
MemGlow-488 프로브세포골격 Inc.MG01-02
Millipak Special MilliporeMillipore SigmaTANKMPK02
Penicillin-StreptomycinGibco15070063
Pipet-Lite LTS 피펫 L-1000XLS+Rainin17014382
Pipet-Lite LTS 피펫 L-200XLS+Rainin17014391
Pipet-Lite LTS 피펫 L-20XLS+Rainin17014392
피펫 팁 ER LTS 1000µ L F 768G/8Rainin30808038
피펫 팁 ER LTS 20µ L F 960G/10Rainin30807966
피펫 팁 ER LTS 200µ L F 960G/10Rainin30807967
품질 관리 비드NanoFCM Inc.
S110-AT 고정 각도 로터ThermoFisher Scientific455391,10,000rpm
S16 엑소 65-155nm 비드NanoFCM Inc.
가위SPI, 미국
Sorvall mX 150+ 마이크로 초원심분리기ThermoFisher Scientific50135641
TC 20 자동 세포 계수기Bio-Rad1450102
Trypan Blue SolutionCorning25-900-CI
핀셋SPI, US
VWR 15mL 원심분리기 튜브Avantor89039-668
Whatman Puradisc 13 필터Cytiva6782-13040.45 µ m 기공 크기
와일드 타입 C57BL/6J 마우스잭슨 연구소재고 # 000664

참고문헌

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