열 스트레스 하에서 폴리좀 프로파일을 사용한 translation efficiency test

요약

여기에 제시된 프로토콜은 리보솜과 관련된 mRNA인 translatome을 자당 밀도 구배 원심분리 를 통해 애기장대 에서 비폴리솜 및 폴리솜 RNA로 분리하기 위한 폴리솜 프로파일링을 포함합니다. 이 방법은 열 스트레스 애기장대(heat-stressed Arabidopsis)의 번역 효율성을 보여줍니다.

초록

열 스트레스 하에서 서로 다른 유전자의 번역 제어는 식물이 환경에 적응하는 데 중요한 단계입니다. 다양한 유전자의 번역 활동을 평가하면 식물 회복력의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 지구 기후 변화에 직면하여 스트레스 내성이 향상된 작물 개발에 기여할 수 있습니다. 이 논문은 열 스트레스에 노출된 식물에서 폴리좀 프로파일링을 통해 translation efficiency를 평가하는 자세한 방법론을 제시합니다. 절차는 애기장대에 대한 열 스트레스 처리, 폴리좀 프로파일을 사용한 translation efficiency test, profile을 기반으로 non-polysomal 및 polysomal RNA를 분리하여 translation efficiency 계산의 세 부분으로 나뉩니다. 첫 번째 부분에서, 애기장대(Arabidopsis) 식물은 환경 문제를 모방하기 위해 제어된 열 스트레스 조건에 노출됩니다. 이 처리에는 지정된 기간 동안 식물을 고온에 노출시켜 일관되고 재현 가능한 응력 유도를 보장하는 것이 포함됩니다. 이 단계는 열 스트레스에 대한 식물의 생리학적 및 분자적 반응을 연구하는 데 중요합니다. 두 번째 부분은 폴리솜 프로파일링을 사용한 번역 효율성 테스트입니다. 폴리좀은 리보솜 로딩을 기반으로 mRNA를 분리하는 자당 구배 원심분리를 통해 추출됩니다. 이를 통해 mRNA의 리보솜 점유를 검사할 수 있으며, 스트레스 조건에서 번역 제어 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 세 번째 부분에서, RNA는 폴리솜 및 비폴리솜 분획 모두에서 분리됩니다. Spike-in RNA는 각 분획에서 RNA의 양을 정확하게 측정하는 데 사용됩니다. translation efficiency의 계산은 정상 및 열 스트레스 조건에서 이러한 분획에 걸친 mRNA의 분포를 비교하여 수행됩니다. 특정 유전자의 번역 활성은 리보솜 관련 RNA 및 총 RNA로 정량적 Real-Time PCR(qRT-PCR)을 수행하여 추가로 평가됩니다. 이 방법론은 열 스트레스의 영향에만 전적으로 초점을 맞추며, 식물의 병진 조절을 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

서론

번역은 유기체가 mRNA에서 기능성 단백질을 합성하여 필수 세포 기능과 신진대사 및 신호 전달과 같은 생물학적 과정을 지원하고 스트레스 반응을 가능하게 하는 데 매우 중요합니다. 번역이 없으면 세포는 중요한 단백질을 생산할 수 없어 세포의 구조, 기능 및 조절에 영향을 미쳐 생명 유지에 영향을 미치고 생물 다양성을 육성합니다 ^1,2. 따라서 식물의 번역 효율성을 연구하는 것이 중요합니다. 번역에는 몇 가지 필수 단계가 포함됩니다. 첫째, 개시는 mRNA가 리보솜에 결합할 때 발생하며, 진핵생물의 eIF와 같은 개시 인자에 의해 촉진되며, 이는 일반적으로 AUG의 시작 코돈을 식별합니다. 다음으로, 각각 특정 아미노산을 운반하는 전달 RNA(tRNA) 분자가 리보솜에 순차적으로 결합하면서 신장이 진행됩니다. 펩타이드 결합은 인접한 아미노산 사이에 형성되어 mRNA 염기서열에 따라 폴리펩티드 사슬을 연장합니다. 마지막으로, 종결은 리보솜이 새로 합성된 단백질을 방출하도록 유도하는 방출 인자에 의해 인식되는 정지 코돈(UAA, UAG 또는 UGA)을 만나면 시작됩니다. 번역 전반에 걸쳐 다양한 진핵생물 시작 인자(eIF), 신장 인자 및 리보솜 RNA가 함께 작용하여 정확성과 효율성을 보장합니다 ^3,4.

이전 연구에 따르면 번역 후 수정은 eIF 간의 상호 작용을 조절하는 데 중요한 역할을 하여 번역 효율성에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 시험관 내 연구에 따르면 CASEIN KINASE 2 (CK2) kinase는 eIF3c, eIF5 및 eIF2β를 인산화하여 서로 간의 상호 작용 및 eIF1과의 상호 작용을 증가시킵니다 ^5,6. 어두운 곳에서 E3 리가아제 COP1(CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1)은 S6K-RPS6의 TOR 매개 인산화를 억제하여 번역을 억제합니다. 비인산화된 RPS6는 기능성 리보솜을 형성할 수 없어 번역을 중단시킨다⁷. 반대로, 조명 조건에서 SUPPRESSOR OF PHYA 105(SPA1) 키나아제는 eIF2α를 인산화하여 eIF2 복합체 조립을 촉진하고 번역 시작을 촉진합니다⁸. 이러한 발견은 환경 신호에 대한 반응으로 번역을 조절하는 복잡한 제어 메커니즘을 강조합니다.

적당한 환경 자극은 광형성(photomorphogenesis) ^8,9과 같은 성장을 촉진하기 위한 번역 과정을 효과적으로 촉진할 수 있다. 그러나 환경적 요인이 과도할 경우, 움직이지 않는 식물은 환경적 스트레스로 인한 피해를 완화하기 위해 적절한 조절 메커니즘을 진화시켜야 한다¹⁰. 식물 스트레스 반응과 관련된 이전 연구에서 대다수는 대사, 호르몬 및 전사 수준에서의 조절에 초점을 맞췄습니다 11,12,13,14. 그러나 최근의 연구는 병진 조절이 식물 스트레스 내성에 미치는 영향을 강조하기 시작했다 15,16,17. 식물은 병진 효율을 줄여 응력 내성을 높일 수 있으며, 이를 통해 불필요한 에너지 소비를 최소화할 수 있습니다. 식물 세포에서 비막성 스트레스 과립의 형성으로 인해, 번역되지 않은 mRNA 및 관련 단백질이 그 안에 응집되어 번역 효율을 감소시킨다¹⁸. 식물이 자주 직면하는 일반적인 환경 스트레스 중 하나는 열 스트레스이며, 이는 식물 세포 내에서 스트레스 과립의 형성을 유도하는 것으로 보고되었습니다^19,20. 지구 온난화로 인한 전 세계 평균 기온 상승은 작물 수확량에 심각한 영향을 미친다²¹. 따라서 열 스트레스를 받는 식물의 생리적 조절을 연구하는 것이 중요합니다. 이전 연구에 따르면 밀의 열처리는 폴리솜 결합 mRNA의 감소를 초래했습니다. 그러나, 스트레스 과립에 저장된 mRNA는 방출되어 리보솜에 재결합되어, 회수 후 번역을 용이하게 하였다²². 또한, 이전 연구에서는 수중 식물에서 총 mRNA와 폴리솜 결합 mRNA 사이의 유전자 발현을 비교했습니다¹⁶. 그 결과, 앱시스산(abscisic acid) 및 비생물적 스트레스 반응(abiotic stress response)과 관련된 mRNA의 정상 상태 수준이 침수 후 약간 증가한 것으로 나타났습니다. 또한, 폴리솜 결합 mRNA의 양이 크게 증가했습니다. 이러한 결과는 번역 조절이 식물의 응력 내성을 제어하는 데 더 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 따라서 효과적인 폴리솜 RNA 분리 방법은 스트레스 처리된 샘플의 translatome을 연구하는 데 매우 중요합니다.

이 프로토콜에서는 RNA 분리 방법을 LiCl 침전 방법을 사용한 고위험 및 부피 페놀/클로로포름 추출에서 부피가 적은 소규모 페놀/구아니디늄 티오시아네이트 추출 방법으로 수정했습니다. 전자의 방법은 폴리솜 분획과 직접 혼합하는 것을 포함하며, 이로 인해 더 큰 실험 폐기물이 발생한다 ^9,15,23. 대조적으로, 이 수정된 접근법은 차등 밀도 원칙을 활용합니다: 폴리솜 RNA는 먼저 고염, 무설탕 용액과 혼합된 다음 초원심분리에 의해 침전됩니다. 그 후, RNA 추출은 소량의 페놀/구아니디늄 티오시아네이트 시약을 사용하여 수행됩니다. 이 방법은 유기 폐기물의 생성을 효과적으로 줄여 실험을 보다 환경 친화적으로 만듭니다. 또한 사용되는 유기 용제는 독성이 낮습니다. 이러한 이유로 우리는 그에 따라 실험 절차를 조정하고 개선하게 되었습니다. 또한 이전 방법은 보다 심층적인 translatomic 분석에 필수적인 spike-in normalization을 사용하여 번역 효율성을 계산하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공하지 않았습니다.

여기에서는 열 충격 스트레스 하에서 애기장대에서 번역 효율성 및 translatomic 분석을 조사하기 위한 폴리솜 프로파일링 및 폴리솜 RNA 분리 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 정상, 열 충격 및 회복 후 조건에서 Col-0 야생형의 번역 효율성을 평가하기 위해 사용되었습니다. 폴리솜 프로파일링 결과와 폴리솜 RNA의 비율은 애기장대(Arabidopsis) 묘목에서 열 스트레스 처리 후 번역 효율의 변화를 보여주었습니다.

프로토콜

1. 열 스트레스 처리된 애기장대(Arabidopsis) 묘목 시료 전처리

1. 각 복제 및 각 조건에 대해 250 개의 씨앗을 접시에 담고, 여과지에 스포이드를 사용하여 Murashige 및 Skoog (MS) 기저 매체 한천 플레이트에 자당 (pH 5.6)을 첨가하고 1.2 % 식물류가를 보충합니다.
   알림: MS 플레이트에 묘목을 심으려면 멸균 여과지를 플레이트에 올려 묘목 뿌리가 매체 깊숙이 침투하는 것을 방지하여 샘플링을 용이하게 합니다. 그런 다음 여과지 위에 씨앗을 심습니다. 식물 성장 및 실험 결과에 대한 설탕의 영향을 배제하기 위해, 재배를 위해 자당을 포함하지 않는 MS 배지를 사용하는 것이 권장됩니다.
2. 심은 씨앗이 들어있는 MS 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단하고 4 °C에서 2 일 동안 배양하여 vernalization을 유도합니다.
3. vernalized 종자를 100 μmol/m²/s의 광강도로 22 °C에서 16 h: 8 h, light-dark photoperiod 아래에서 성장하기 위해 성장 챔버로 옮깁니다.
4. 열 스트레스 샘플의 경우 5일 된 묘목이 들어 있는 MS 배지 플레이트를 방수 접착 테이프로 밀봉하고 40°C 수조에 1시간 동안 둡니다.
5. 열처리 후 회수되는 샘플의 경우 열처리 직후 플레이트를 냉각하십시오. 그 후, 22 ° C의 성장 챔버에 2 시간 동안 두십시오.
6. 각 복제에 대해 처리되거나 처리되지 않은 250개의 묘목을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 수확하고 샘플을 액체 질소에 즉시 동결합니다.
   참고: 각 조건에 대해 두 그룹의 샘플을 준비했습니다. 하나는 폴리솜 프로파일링 분석을 위한 것이고 다른 하나는 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 추출을 위한 것입니다.

2. 자당 그래디언트 준비

1. 다음 농도의 자당을 포함하는 그래디언트 용액을 준비합니다 : 12.5 %, 24.4 %, 36.3 %, 48.1 % 및 60 %. 용액 조성에는 50mM Tris-HCl, 25mM KCl, 10mM MgCl₂, 100μg/mL 헤파린 및 50μg/mL 시클로헥시미드(CHX)가 포함됩니다.
2. 고농도에서 저농도로 그래디언트 용액을 바닥에서 시작하여 위쪽으로 로드합니다. 각 농도의 그래디언트 용액을 첨가한 후 다음 농도를 첨가하기 전에 용액을 고체 상태로 동결합니다. 자당 그래디언트의 각 농도에 대해 2.2mL를 추가합니다. 이 과정은 불연속적인 자당 밀도 구배를 초래합니다.
3. 준비된 자당 구배를 -80 °C에서 임시로 보관하고 사용하기 전에 4 °C에서 밤새 해동하십시오.

3. 폴리솜 프로파일링 시료 전처리

1. 열 스트레스 또는 처리되지 않은 250 일 된 Col-0 묘목을 균질기를 사용하여 1 분 동안 30 사이클 / s의 빈도로 분말로 분쇄합니다.
   참고: 동일한 배경을 가진 식물의 수가 같을 때 동일한 RNA 추출 수율을 갖습니다. 그러나 배경이 다른 과발현 형질전환 식물이나 돌연변이 식물을 비교할 때는 식물 상태에 따라 사용되는 식물의 양을 조정해야 합니다.
2. 비폴리솜 및 폴리솜 RNA를 포함하는 추출 용액을 얻으려면 500μL의 폴리솜 추출 완충액(200mM Tris-HCl, pH 8.0, 50mM KCl, 25mM MgCl₂, 50μg/mL 시클로헥시미드, 100μg/mL 헤파린, 2% PTE, 10% DOC, 400U/mL 리보뉴클레아제 억제제)을 각 튜브에 넣고 반전 및 와류로 샘플을 혼합합니다. 공정 전반에 걸쳐 샘플이 4°C로 유지되는지 확인합니다.
3. 추출 용액을 4°C, 12,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 100μm 셀 스트레이너를 통해 상층액을 여과하여 투명하고 입자가 없는 추출 용액을 얻습니다.
   참고: 추출 용액에 존재하는 입자는 초원심분리 중에 침전되어 폴리솜 프로파일링 측정의 정확도에 영향을 줄 수 있는 펠릿을 형성할 수 있습니다.
4. 여과된 상층액을 미리 준비된 자당 구배에 로드하고 평형에 도달하는지 확인합니다.
   알림: 초원심분리기의 높은 회전 속도로 인해 초원심분리기의 안전과 적절한 기능을 모두 보장하는 것이 중요합니다. 이를 위해서는 회전하기 전에 샘플 중량이 동일한지 확인해야 합니다. 따라서 정밀 저울을 사용하여 그라디언트의 가중치가 완전히 균일한지 확인합니다.
5. 초원심분리기 스윙 버켓 로터를 사용하여 4°C, 210,000 x g 에서 3.5시간 동안 시료가 로드된 자당 그래디언트를 원심분리합니다. 가속 및 감속 속도를 최대로 설정합니다. 초원심분리 후, 비-폴리솜 및 폴리솜 RNA는 해당 슈크로스 그래디언트 용액에서 그들의 밀도에 따라 분포됩니다.
   참고: 자당 그래디언트에서 밀도가 낮은 비폴리솜 RNA는 상층에 분포하는 반면, mRNA에서 활성 번역에 관여하는 수많은 리보솜의 존재로 인해 밀도가 높은 폴리솜 RNA는 하층에 분포합니다. 그 후, 폴리좀 프로파일링은 밀도 구배 분획기를 사용하여 측정할 수 있습니다.

4. 폴리솜 프로파일링 분석

참고: 마이크로볼륨 시린지 펌프가 있는 밀도 구배 분획기는 폴리솜 프로파일링을 측정하는 데 사용됩니다.

1. 마이크로볼륨 주사기 펌프용 체이스 용액(70% 자당, 10% 글리세롤 및 0.02% 브로모페놀 블루)을 준비합니다.
2. 소프트웨어를 사용하여 밀도 구배 분별기를 제어할 수 있습니다. 탈이온수를 사용하여 기계를 보정합니다. 보정 후 폴리솜 프로파일링을 수행하는 데 사용합니다.
   1. 기준선 조정을 수행하려면 라이트가 빨간색에서 녹색으로 바뀔 때까지 UV/VISDetector 를 켭니다. 레코더 오프셋 노브를 조정하여 마커 선을 정렬한 다음 Baseline Adjust 노브를 최소 열림 위치로 돌립니다. UV/VISDETECTOR의 감도 노브를 레벨 2.0으로 설정하고 Auto Baseline 버튼을 누릅니다. 마지막으로 레코더 오프셋 노브를 사용하여 원하는 기준선을 20으로 조정합니다. 보정된 과정은 메커니즘의 브랜드와 다른 샘플에 따라 달라집니다.
3. 초원심분리 후 튜브 피어싱 시스템을 사용하여 샘플이 있는 튜브를 밀도 구배 분획기에 놓아 튜브를 추격 용액 및 UV 검출기가 있는 주사기 펌프에 연결할 수 있습니다.
4. 밀도 그래디언트 분획기를 소프트웨어 제어 모드(REMOTE)로 전환하고 마이크로볼륨 시린지 펌프의 주입 유속을 3mL/분으로 설정합니다.
5. 소프트웨어 설정을 시작하여 OD₂₅₄를 측정하여 분별기를 사용하여 폴리솜 프로파일 그래프를 얻고 시작합니다.

5. non-polysomal 및 polysomal RNA의 분리

참고: 프로토콜의 이 부분에서는 앞에서 설명한 것과 동일한 단계에 따라 초원심분리를 수행한 후 동일한 배치의 다른 샘플 그룹을 사용했습니다.

1. 폴리솜 프로파일 측정 결과에 따라 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 분획을 별도로 수집합니다. non-polysomal 및 polysomal fractions 모두에 대한 용액의 부피를 계산하고 non-polysomal fraction(상단 부분)을 수집합니다.
   참고: 프로필에 따르면 두 개 이상의 리보솜이 있는 분획은 폴리솜 분획으로 정의되는 반면, 40S, 60S 및 80S rRNA 피크가 있는 분획은 비폴리솜 분획으로 정의됩니다.
2. RNA의 표적 분획을 사전 저온 2x 고염 용액(400mM Tris-HCl, pH 8.0, 100mM KCl, 50mM MgCl₂)과 철저히 혼합합니다.
3. 키트에서 희석된 진핵생물 Poly-A RNA Control 8μL를 추가합니다.
   참고: 일곱 번째 단계에 필요한 스파이크인 정규화의 경우. 진핵생물 Poly-A RNA Control Kit에는 식물에 존재하지 않는 DAP 유전자와 같은 B. subtilis 유전자가 참조 유전자로 포함되어 있습니다. 추출 후 반응 중 기준 유전자 손실의 비율을 측정하려면 추출 전에 DAP 유전자의 RNA 샘플이 포함된 시약을 비폴리솜 또는 폴리솜 RNA가 있는 다른 튜브에 동일한 양으로 첨가하십시오. 이를 통해 추출 후 반응 중 기준 유전자 손실의 비율을 결정할 수 있으며 정규화 목적으로 사용할 수 있습니다.
4. 초원심분리기 스윙 버킷 로터를 사용하여 고염 용액 혼합 RNA를 4°C, 450,000 x g에서 5시간 동안 원심분리합니다.
5. 초원심분리 후 RNA는 원심분리기 튜브 바닥에 침전됩니다. 바닥의 RNA 펠릿을 보존하기 위해 위에서 상층액을 조심스럽게 붓습니다.
6. RNA 펠릿을 500μL의 사전 냉각된 디에틸피로카보네이트(DEPC) 처리수로 빠르게 세척하고 이 단계를 3회 반복합니다.
   참고: DEPC 처리된 물이 세척 과정에서 RNA를 다시 용해시키는 것을 방지하려면 DEPC 처리된 물을 사용하기 전에 사전 냉각하여 용해도를 줄여야 합니다. 또한 세척 중 DEPC 처리수와 RNA 펠릿 사이의 접촉 시간을 최소화해야 합니다.

6. 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 추출

1. 500μL의 RNA 추출 시약을 추가하고 추출할 RNA 샘플과 혼합합니다. 10분 동안 배양합니다.
2. 클로로포름 100μL를 넣고 잘 섞은 후 상 분리를 위해 10분 동안 배양합니다.
3. 반응 혼합물을 4°C, 12,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. RNA를 함유하고 있는 상부의 투명한 수성층을 새 튜브로 옮기고 동일한 부피의 이소프로판올과 부드럽게 혼합한 다음 RNA 침전을 위해 -20°C에서 2시간 동안 배양합니다.
4. 침전 후 4°C, 12,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 버리고 RNA 펠릿을 바닥에 유지합니다.
5. RNA 펠릿을 1mL의 예냉 75% 에탄올로 세척합니다. 4°C, 12,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버리고 RNA 펠릿을 자연 건조합니다.
6. RNA 펠릿이 건조되면 RNA 펠릿을 DEPC 처리된 물 30μL에 재현탁시키고 전체 스펙트럼(_220nm-750nm) 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도(OD 260)를 측정합니다.

7. 스파이크인 정규화

1. 제조업체의 지침에 따라 qPCR 키트를 사용하여 수행한 역전사를 위해 추출된 RNA 1000ng를 사용합니다. 비폴리솜 RNA와 폴리솜 RNA는 모두 cDNA로 역전사되어야 합니다.
2. 1μL의 cDNA를 DAP 유전자 프라이머와 혼합하고 SYBR 완충액을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 표적 유전자의 발현 수준을 측정합니다. 다음으로, Real-Time PCR을 사용하여 DAP 유전자 발현을 검출합니다.
   참고: DAP 유전자의 프라이머 염기서열은 다음과 같습니다.
   포워드 프라이머 = 5'-ATA, AAA, GAA, TTC, AGC, TAA, CGC, TTC, C-3'
   리버스 프라이머 = 5'-TTG, TTT, CTT, TGC, CTC, TAT, TGT, ATC, C-3'
3. 측정된 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 그룹에서 DAP 유전자의 발현 수준을 비교하고 비례 손실 조건에서 RNA 함량을 추정합니다. 정규화된 RNA 함량을 사용하여 폴리솜의 RNA 비율을 계산합니다.

결과

애기장대(Arabidopsis)의 야생형인 Col-0은 16시간:8시간의 광주기 미만의 MS 배지에서 성장했습니다. 제어를 위해 열 스트레스 처리 없이 5일 된 묘목을 사용했습니다. 열 스트레스 그룹은 예열된 수조에서 40°C에서 1시간 동안 열처리를 거친 반면, 회수 그룹은 열처리 직후 22°C에서 2시간 동안 배치했습니다. 다양한 열처리 조건과 회수 조건을 사용함으로써 후속 단계를 활용하여 병진 효율을 측정할 수 있습니다.

RNA 추출 전에 먼저 자당 그래디언트를 준비해야 합니다. 밀도 차이에 따라 비폴리솜 RNA와 폴리솜 RNA를 분리하기 위해 12.5%, 24.4%, 36.3%, 48.1% 및 60%의 자당 농도를 가진 그래디언트 용액을 준비했습니다. 그런 다음 아래쪽에서 시작하여 고농도에서 저농도로 그래디언트 용액을 로드했습니다(그림 1A). 그 후, 이 그래디언트를 활용하여 상층에서 저밀도 비폴리솜 RNA를 분리할 수 있으며, 고밀도 폴리솜 RNA는 더 높은 자당 농도로 하층에 분포됩니다. 비-폴리솜 및 폴리솜 RNA는 처리되거나 처리되지 않은 Col-0로부터 추출하였다. 용액의 입자가 폴리솜 프로파일링 분석 결과에 영향을 미치지 않도록 하려면 RNA 함유 용액을 세포 여과기를 통해 여과하여 입자가 없는 추출 용액을 얻어야 합니다. 여과된 상층액을 미리 제조된 슈크로스 그래디언트에 로딩하고 평형화하였다. 슈크로스 그래디언트가 로드된 샘플의 초원심분리 후, 비-폴리솜 및 폴리솜 RNA는 슈크로스 그래디언트 내의 밀도에 따라 분포시켰다. 그 후, 폴리솜 프로파일링은 밀도 구배 분획기를 사용하여 수행되었습니다(그림 1B). 밀도 구배 분획기는 초기에 탈이온수로 보정된 소프트웨어를 사용하여 제어됩니다. 보정 후, 샘플은 초원심분리 후 분획기에 로드됩니다. 소프트웨어 제어 모드에서 작동하는 마이크로볼륨 시린지 펌프는 자당 그래디언트보다 높은 농도의 슈크로스 용액을 그래디언트에 주입하여 샘플을 밀어 넣습니다. 이를 통해 밀도가 더 낮은 자당 그래디언트의 상단에서 시작하여 밀도가 더 높은 하단으로 측정을 진행할 수 있습니다. 그 후, 소프트웨어 설정이 활성화되어 데이터 수집을 시작하고 OD₂₅₄ 측정을 통해 폴리솜 프로파일 그래프를 생성합니다(그림 1B). 폴리솜 분획에서 더 높은 신호 강도를 관찰하면 샘플이 더 높은 translation efficiency를 나타낸다는 것을 나타냅니다.

다양한 처리에서 5일된 Col-0 묘목에 대한 폴리솜 프로파일링 플롯이 그림 2에 나와 있습니다. 대조군의 결과는 비폴리솜 분획과 폴리솜 분획 사이의 명확한 분리를 보여줍니다(그림 2A). 그러나 40°C에서 1시간의 열 응력 후 폴리솜 분획의 신호 강도가 크게 감소했습니다(그림 2B). 열처리된 묘목을 22°C에서 2시간 동안 회복시키면 폴리솜 분획의 신호 강도가 대조군과 유사한 수준으로 회복되었습니다(그림 2C). 그 결과 1시간의 열스트레스 처리가 애기장대(Arabidopsis) 묘목의 번역 효율을 크게 감소시킨다는 것을 보여주었습니다. 그러나 식물은 열 스트레스를 받지 않는 묘목과 비슷한 수준으로 번역 효율을 복원하기 위해 2시간의 회복이 필요했습니다.

다양한 처리 조건에서 Col-0 묘목의 번역 효율을 비교하는 추가 증거를 수집하기 위해 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 분획을 분리하고 추출했습니다. 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 분획의 수집은 폴리솜 프로파일 측정 결과에 따라 안내되었습니다. 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 추출의 경우 페놀/구아니디늄 티오시아네이트 시약을 사용하여 분리된 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 샘플을 추출합니다. 우리가 사용한 RNA 추출 방법을 사용하면 다음과 같은 분석을 위한 안정적이고 고품질의 RNA를 얻을 수 있습니다(표 1). 그 후, GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit로 추출된 RNA를 정규화하여 다양한 추출 손실로 인한 오류를 완화합니다. 다음으로, 키트에 추가된 B. subtilis 유전자에 포함된 DAP 유전자의 발현을 정량화하기 위해 Real-Time PCR을 사용하였다. 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 그룹 간의 DAP 유전자 발현 수준의 비교 분석을 수행하여 비례 손실 조건에서 RNA 함량을 추정했습니다(그림 3A). 우리는 그들 사이의 번역 효율성을 명확히하기 위해 총 RNA에 대한 정규화 된 폴리솜 RNA의 비율을 계산했습니다 (그림 3B). 마지막으로, 폴리솜의 RNA 비율은 정규화된 RNA 함량을 사용하여 계산되었습니다(그림 3C). Col-0의 상이한 처리 하에서 폴리솜의 RNA 비율 결과는 그림 2A에 나타난 폴리솜 프로파일 결과와 일치하는 패턴을 나타냈습니다. 두 결과 모두 열 스트레스가 폴리솜 분획의 RNA 비율을 크게 감소시킨다는 것을 나타내며, 이 효과는 22°C에서 2시간 회복 후에 역전될 수 있습니다(표 1).

이 방법으로부터, 우리는 RNA를 추가적인 분획으로 분리하는 대신 고품질의 전체 비-폴리솜 또는 폴리솜 RNA 분획을 얻을 수 있다²³. 우리의 결과는 또한 폴리솜 프로파일과 폴리솜의 RNA 비율이 서로 다른 처리 조건을 가진 애기장대에서 번역 효율성을 효과적으로 반영할 수 있음을 보여줍니다.

그림 1: 폴리솜 프로파일링 워크플로우 다이어그램. (A) 13mL 원심분리 튜브에서 자당 그래디언트를 준비하는 개략도. (B) 순서도는 폴리솜 프로파일링의 실험 과정을 보여줍니다. 먼저 translatome을 추출합니다. 이어서, 비-폴리솜 및 폴리솜 RNA는 다양한 밀도의 슈크로스 그래디언트에서 초원심분리를 사용하여 밀도 차이에 기초하여 분리됩니다. OD(₂₅₄ )는 아래의 폴리좀 프로파일링 결과 그래프를 얻기 위해 밀도 구배 분작성기를 사용하여 측정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 다양한 조건에서 Col-0의 폴리솜 프로파일링. (ᅡ, ᄂ, ᄃ) (A) 무열처리(대조), (B) 40°C에서 1시간 동안 열처리, (C) 열처리 후 1시간 동안 22°C에서 회수 조건에서 Col-0의 폴리솜 프로파일링 결과. 비-폴리솜 및 폴리솜 RNA는 12.5%-60% 슈크로스 그래디언트를 사용하여 분획하였다. 비폴리솜(NP) 및 폴리솜(PL) RNA의 위치는 프로파일에 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 추출 워크플로우 다이어그램. (A) 스파이크인에 의한 RNA 정규화의 그림. (B) 비폴리솜 및 폴리솜 RNA의 분리 및 폴리솜 RNA의 백분율 계산에 대한 그림. (C) 다른 조건으로 치료된 Col-0의 폴리솜 RNA의 비율. 오차 막대는 SD± 평균을 나타냅니다(n=3 생물학적 반복). *p-값 < 0.01, 스튜던트 t 테스트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

		내용 (ng)	260/280	260/230
제어	RNA엔피	758.3	2.19	2.16
	RNAPL (영문)	302.3	2.21	2.13
열 스트레스	RNA엔피	821.5	2.2	2.15
	RNAPL (영문)	174.3	2.19	2.21
복구	RNA엔피	797.2	2.17	2.16
	RNAPL (영문)	300.9	2.19	2.18

표 1: 비폴리솜 및 폴리솜 RNA 함량 및 품질. 이 표는 RNA 함량과 품질을 분석한 것입니다. RNA 함량은 수정된 방법을 사용하여 추출 후 정규화되었습니다.

토론

이 프로토콜은 애기장대(Arabidopsis) 묘목의 번역 효율성을 측정하기 위한 간단하고 표준화된 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계는 2차 원심분리 및 RNA 추출 시약 추출을 통해 RNA 안정성을 보장하고 자당 그래디언트의 세심한 준비를 하는 것입니다. 또한, spike-in normalization method를 사용하여 non-polysomal 및 polysomal RNA를 정규화하고 정량화하기 위한 중요한 단계를 제공합니다. 모든 절차는 RNase-free 완충액과 도구를 사용하여 얼음 위에서 수행해야 하는 것이 매우 중요합니다. 또한 자당 농도의 정확한 준비를 보장하고 흔들림을 최소화하여 그래디언트에 미치는 영향을 줄입니다. 선행 연구들 24,25,26에서, 스트레스 반응에 대한 연구는 주로 전사 및 표현형 분석에 초점을 맞추었다. 폴리솜 프로파일 분석을 통해 스트레스 또는 기타 환경 자극을 받는 식물의 병진 과정 조절을 추가로 조사할 수 있습니다.

translational process를 이해하려면 폴리좀 프로파일링 실험을 수행하는 것뿐만 아니라 아지도호모알라닌(AHA) 라벨링 실험으로 이를 보완해야 합니다. AHA 라벨링은 단백질 합성 및 번역 활성을 조사하기 위해 사용됩니다²⁷. 이 방법은 새로 합성된 단백질의 메티오닌 잔기를 아지드기를 포함하는 메티오닌 유사체인 AHA로 대체합니다. 세포는 번역 중에 AHA를 새로 합성된 단백질에 통합합니다. 그 후, 클릭 케미스트리(click chemistry)와 같은 아지드 화학(azide-chemistry) 기반 기법을 사용하여 AHA를 함유한 단백질을 선택적으로 표지하고 검출할 수 있으며, 이를 통해 능동적으로 번역되는 단백질의 정량 분석 및 시각화를 가능하게 할 수 있다²⁸. AHA 라벨링과 폴리좀 프로파일링을 결합함으로써 연구자들은 식물 세포 내 단백질 합성의 역학에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있습니다⁸.

이 폴리솜 RNA 분리 및 스파이크인 정규화 방법을 통해 추출된 RNA를 RNA 염기서열 분석에도 사용할 수 있습니다. polysome-bound mRNA를 분석하면 어떤 mRNA가 활발하게 번역되고 있는지 확인할 수 있습니다. 또한 정상 상태 mRNA와 폴리솜 결합 mRNA를 비교하면 번역 또는 전사 수준에서 과발현된 유전자를 식별할 수 있습니다. 정상 상태 mRNA의 발현 수준은 전사 활성을 반영하는 반면, 폴리솜 결합 mRNA는 유전자가 활발하게 번역되고 있음을 나타냅니다. 번역 효율성은 환경적 자극과 번역 후 수정(post-translational modifications)에 의해 영향을 받는다 7,8,9,16. 따라서 이 방법은 관심 대상 단백질이 효과적으로 번역되는지 여부에 대한 포괄적인 이해를 제공합니다. 그러나 이 방법의 한계는 추출 절차 중에 여전히 RNA의 손실이 있다는 것입니다. qRT-PCR을 통해 얻은 spike-in RNA의 상대적 발현으로 인해 약간의 측정 오류가 발생할 수도 있습니다. 표적 단백질의 기능적 측면을 조사하기 위해서는 단백질체학 또는 웨스턴 블롯을 사용한 추가 연구 및 검증이 필요합니다.

요약하자면, 이 프로토콜은 번역 효율성을 평가하기 위한 명확한 결과와 함께 간단한 접근 방식을 제공하는 간단한 방법을 나타냅니다. 중요한 것은 그 적용 가능성이 열 스트레스 처리된 묘목을 넘어 다양한 다른 환경 자극에 노출된 묘목을 포함하도록 확장된다는 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5mL 에펜도르프 튜브	Labcon	3012-870-000-9	RNA 추출
13.2mL 원심분리 튜브	Beckman Coulter	331372	초원심분리
브로모페놀 블루	Honeywell	32712	폴리솜 프로파일
클로로포름	Honeywell	32211	RNA 추출
시클로헥시미드(CHX)	시그마-알드리치	SI-C7698	폴리솜 프로파일
디에틸 피로카보네이트(DEPC)	시그마-알드리치	D5758	RNA 추출
에탄올	시그마-알드리치	32221	RNA 추출
유전자칩 진핵생물 폴리-A RNA 제어 키트	인비트로겐	900433	정규화
글리세롤	하니웰	15523
정규화 헤파린	시그마-알드리치	SI-H3149	폴리솜 프로필
HiScript III RT SuperMix for qPCR 키트	Vazyme	R323-01	정규화
KCl	J.T.Baker	3040-01	폴리솜 프로파일
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	폴리솜 프로파일
MS 기초 매체	Phyto	M524	식물 배양
피크 차트 주사기 펌프	Brandel	SYN4007LS	폴리솜 프로파일
폴리옥시에틸렌-10-트리데실-에테르(PTE)	시그마-알드리치	P2393	폴리솜 프로파일
RNasin	Promega	N251B	폴리솜 프로파일
소듐데옥시콜레이트(DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	폴리솜 프로필
설탕	Sigma-Aldrich	S5391	폴리솜 프로필
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	정규화
TRI 시약	MRC	TR118	RNA 추출
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	폴리솜 프로파일
초원심분리기	Beckman Coulter	Optima L-100K	초원심분리
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	폴리솜 프로파일