THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

요약

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

초록

인간 급성 단핵구 백혈병(AML) THP-1 세포주는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 중요한 인간 병원체와의 상호 작용을 포함하여 인간 단핵구 유래 대식세포의 기능을 연구하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 골수성 기원의 다른 불멸 세포주와 비교했을 때, THP-1 세포는 많은 온전한 염증 신호 경로를 유지하고 있으며, phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA)로 처리했을 때 대식세포로 분화하는 능력을 포함하여 일차 단핵구와 더 유사한 표현형 특성을 나타냅니다. CRISPR-Cas9 기술을 사용하여 표적 유전자 녹아웃(KO)을 통해 THP-1 세포를 엔지니어링하면 바이러스-숙주 상호 작용을 포함한 면역 관련 메커니즘을 더 잘 특성화할 수 있는 강력한 접근 방식을 얻을 수 있습니다. 이 논문은 사전 조립된 Cas9:sgRNA 리보핵단백질을 세포핵으로 전달하기 위해 전기천공법을 사용하는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 약간 다른 위치에서 동일한 유전자 자리를 표적으로 하는 여러 sgRNA를 사용하면 큰 DNA 단편이 삭제되어 편집 효율성이 증가하며, 이는 T7 엔도뉴클레아제 I 분석법으로 평가됩니다. 유전자 수준에서의 CRISPR-Cas9 매개 편집은 Sanger 염기서열분석에 이어 ICE(Inference of CRISPR Edits) 분석으로 검증되었습니다. 단백질 고갈은 기능 분석법과 결합된 면역 블로팅에 의해 확인되었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 표적 유전자 자리에서 최대 100% indels와 단백질 발현을 95% 이상 감소시켰습니다. 높은 편집 효율은 희석을 제한하여 단일 세포 클론을 편리하게 분리할 수 있습니다.

서론

THP-1은 급성 백혈병(AML)을 앓고 있는 환자로부터 분리된 인간 단핵구 유래 세포주로, 일차 단핵구¹과 매우 유사한 표현형 특징을 나타냅니다. 표현형에서 제한된 수명과 공여체 간/공여자 간 변동성을 모두 분열하지 않고 나타내지 않는 1차 단핵구 유래 대식세포와 비교했을 때, THP-1 세포는 사실상 영원히 배양될 수 있으며 결과 재현성에 유리한 보다 균일한 행동을 할 수 있습니다 ^2,3,4,5,6. 특히, THP-1 세포는 phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA)를 가진 대식세포와 같은 표현형으로 분화될 수 있으며, 이는 염증 신호 7,8,9,10,11,12,13 또는 HIV

프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. CRISPOR를 사용한 가이드 설계(그림 1.1)

참고: SnapGene Viewer 소프트웨어는 4, 7 및 10단계에서 사용하여 편집 대상 부위와 관심 유전자 내 PCR 프라이머 혼성화 위치에 주석을 달 수 있습니다.

1. Ensembl 웹 사이트(www.ensembl.org)로 이동합니다. 검색 상자에서 종을 선택하고 관심 있는 유전자의 이름을 입력합니다. 이동을 클릭합니다. 유전자에 해당하는 결과를 선택합니다(전사체 아님).
2. Show transcript table을 클릭한 다음 Biotype 열에서 금색 라벨이 붙은 Protein coding에 해당하는 Transcript ID를 선택합니다. 성적 증명서 페이지에서 왼쪽 ....

결과

GFP 리포터 단백질(THP-1_GFP)을 안정적으로 발현하는 THP-1 세포주를 생성하고(그림 2A), 효율적인 CRISPR-Cas9 매개 유전자 에디션을 위한 프로토콜을 확립하기 위한 도구로 사용되었습니다. 이를 위해 EGFP 유전자를 표적으로 하는 3개의 sgRNA를 CRISPOR 웹 도구²⁹(그림 2B)로 설계했으며, 이는 9:1의 몰비로 Cas9와 동시에 복합체를 형성하여 RNP를 형성한 후 다른 설정을 사용하여 전기천공법을 통해 세포로 전달되었습니다. 다음으로, 세포를 20% FBS 함유 RPMI 배지 단독(그림 2C, 상단 패널)에서 성장시키거나 컨디셔닝 배지(그림 2C, 하단 패널)로 1:1로 희석했습니다. EGFP KO 효율의 .......

토론

여기에서는 THP-1 세포주의 성공적인 CRISPR 매개 편집을 얻기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 이 접근 방식은 전기천공법/핵 절편에 의한 사전 조립된 sgRNA/Cas9 RNP의 전달에 의존합니다. 이 전략은 sgRNA/Cas9 카세트의 렌티바이러스 매개 통합으로 인해 잠재적으로 발생하는 off-target 효과를 제한하여 nuclease의 지속적인 발현을 생성하기 위해 선택되었습니다. 신뢰할 수 있고 효율적인 편집을 달성하기 위해 관심 유전자를 표적으로 하는 여러 sgRNA를 선택했으며, 이는 게놈 인델 생성 가능성을 증가시켜 단백질 발현 및 기능적 KO³²의 손실로 이어집니다. 세포막의 최적 투과화를 달성하기 위해 전기천공법 설정에 특별한 주의를 기울였으며, 이는 과도한 세포 사멸을 방지하면서 sgRNA/Cas9 RNP의 효율적인 전달을 보장하는 데 필요했습니다³³. 이와 관련.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 & 마이크로; m 주사기 필터	ClearLine	146560	_
0.4 % trypan blue	Beckman Coulter	383200	_
1.5 mL 튜브	Eppendorf	3810X	_
24-웰 플레이트	Corning	353047	_
6x TriTrack DNA 로딩 염료	Thermo scientific	R1161	_
75 cm² 배양 플라스크 벤티드 캡	코닝	353136	_
8-Strip PCR Tubes with Caps	Life 기술	AM12230	_
96웰 플레이트 플랫 바	Corning	353072	_
96웰 플레이트 라운드 바텀	코닝	353077	_
Agarose	Euromedex	D5	_
ATGpr	_	_	https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc 이미징 시스템	BIO-RAD	12003153	_
카운팅 슬라이드	NanoEntek	DHC-N04	_
CRISPOR	_		_
http://crispor.gi.ucsc.edu/ DPBS	Gibco	14190094	_
Ensembl	EMBL-EBI	_	https://www.ensembl.org/index.html
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524	_
FlowJo	BD Life Sciences	v10.10	_
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo scientific	SM0323	_
게놈 데이터 뷰어	NCBI	_	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad Prism	Dotmatics	_	Version 9.3.1
Herculase II Fusion DNA Polymerases	Agilent	600679	_
ICE CRISPR 분석 도구	Synthego	_	https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab Touch	BIO-RAD	_	Version 2.4.0.03
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µ에 포함됨; L	팁, 튜브, 버퍼 R 및 E	Invitrogen	MPK1025K
Kit	Invitrogen	MPK5000	_
NetStart 1.0	_		_
https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/ Nuclease-free Water	Synthego	_	_
PCR primer (EGFP)	Eurofins	_	Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; 개정판 : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR 프라이머 (SAMHD1)	Eurofins	_	Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; 개정판 : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)	Gibco	15140122	_
PFA	전자 현미경 과학	15714	_
PMA	Sigma-Aldrich	P8139	_
PrimerQuest	IDT	_	https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR 정제 키트	Qiagen	28104	_
QuickExtract DNA 추출 솔루션	Biosearch Technologies	QE09050	_
RPMI 1640, GlutaMAX	Gibco	61870010	_
SnapGene Viewer	Dotmatics	_	Version 7
SpCas9 2NLS Nuclease	Synthego	_
_SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	_
Synthetic sgRNA (EGFP)	Synthego	_	#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Synthetic sgRNA (SAMHD1)	Synthego	_	#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
주사기 Plastipak Luer Lock	BD	301229	_
T100 Thermal Cycler	BIO-RAD	1861096	_
T7 endonuclease I	New England Biolabs	M0302S	_
TAE 버퍼 UltraPure, 10x	Invitrogen	15558026	400 mM Tris-Acetate, 10 mM EDTA
THP-1 세포	ATCC	TIB-202	_
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Gibco	25300054	_
ZE5 세포 분석기	BIO-RAD	12014135	_

텀 Neon Transfection System이 포함된 Electroporation