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방법 논문

Click Chemistry and Expansion Microscopy를 사용한 세포 내 사이알릴화 시각화

1.4K 조회수

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DOI:

10.3791/67479

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2025년 2월 7일

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1Univ. Lille, CNRS, UMR 8576 - UGSF - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, 2Univ. Lille, CNRS, UMR 8520 - IEMN – Institut d’Electronique, de Microelectronique et de Nanotechnologie, 3Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, US 41 - UAR 2014 - PLBS

이 논문에서

요약

여기에서는 대사 올리고당 엔지니어링, 클릭 화학 및 확장 현미경 검사를 결합한 간단한 프로토콜을 제안하며, 이를 통해 일상적인 현미경 장비를 사용하여 향상된 해상도로 세포 내 시알릴화된 N-당단백질의 바이오이미징을 가능하게 합니다.

초록

대사 라벨링 기술을 통해 생체 직교 리포터를 글라이칸에 통합할 수 있으며, 클릭 및 생체 직교 화학을 통해 세포 내 분자 염료의 표적 생체 접합을 가능하게 합니다. 대사 올리고당 공학(MOE)은 분자 인식과 관련된 수많은 생물학적 과정에서 글리코실화의 필수적인 역할과 암에서 유전 질환, 바이러스 및 박테리아 감염에 이르는 병리학에 미치는 영향으로 인해 상당한 관심을 끌었습니다.

MOE는 세포 표면 당접합체(glycoconjugates)의 검출로 더 잘 알려져 있지만, 생리학적 및 병리학적 맥락에서 세포 내 글라이칸 연구를 위한 매우 중요한 방법론이기도 합니다. 이러한 연구는 높은 공간 해상도의 이점을 크게 활용할 수 있습니다. 그러나 초고해상도 현미경 검사는 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수 없으며 일상적인 구현에 어려움을 겪고 있습니다. 확장 현미경 검사는 형광 마커로 표지된 생물학적 표본을 물리적으로 확대하여 현미경 검사의 해상도를 향상시키는 최신 대안입니다. 샘플을 팽창 가능한 겔에 삽입하고 화학적 처리를 통해 등방성으로 팽창하게 함으로써 초고해상도 기술 없이도 향상된 정밀도와 해상도로 세포 내 구조를 시각화할 수 있습니다.

이 연구에서는 MOE와 클릭 화학의 조합을 통해 세포 내 시알릴화 글라이칸을 시각화하는 확장 현미경의 능력을 설명합니다. 구체적으로, 우리는 공동 국소화 연구를 위한 면역형광과 관련될 수 있는 시알릴화를 표적으로 하는 리포터를 고용하는 생체 직교 라벨링 및 확장 현미경 검사 절차를 제안합니다. 이 프로토콜은 sialoconjugate 생합성, 세포 내 교통 및 재활용에 대한 국소화 연구를 가능하게 합니다.

서론

형광 현미경 검사는 세포 내의 특정 분자를 라벨링하고 시각화하는 데 널리 사용되지만, 약 200-250nm보다 가까운 물체를 구별하는 능력을 제한하는 Abbe의 빛 회절 한계1에 의해 본질적으로 해상도가 제한됩니다. 이러한 제한은 빛의 파동 특성과 현미경 대물 렌즈의 개구수로 인해 발생하며, 세포 내 구조를 이미징할 때 문제가 발생합니다. 이러한 한계를 극복하면 나노미터 규모에서 특정 생물학적 과정에 대한 더 나은 통찰력을 얻을 수 있습니다.

빛의 회절 한계를 능가하기 위해 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 및 STED(Stimulated Emission Depletion)와 같은 초고해상도 현미경 기술이 개발되었습니다 2,3. STORM은 형광단의 확률적 활성화에 의존하여 주어진 시간에 희박한 하위 집합만 이미지화할 수 있습니다. 이를 통해 개별 형광단의 정확한 위치 파악이 가능하여 고해상도 이미지를 재구성할 수 있습니다. 반면에 STED는 공핍 레이저를 사용하여 여기 지점 주변 주변의 형광을 선택적으로 소멸시켜 점 확산 기능을 효과적으로 좁힘으로써 해상도를 향상시킵니다.

이러한 접근 방식은 모든 형광단이 동시에 검출되는 광시야 또는 컨포칼 현미경과 대조를 이루며, 그 결과 모든 회절 패턴을 결합하고 가까운 개별 형광단을 구분하지 못해 해상도가 손실되는 이미지를 얻을 수 있습니다. 그러나 이러한 초해상도 방법에는 매우 특정한 광원, 장비, 시료 전처리 및/또는 형광단이 필요하기 때문에 비용이 많이 들고 대부분의 실험실에서 이러한 기술에 접근하기 어려우며 일상적인 실험에서 구현하기가 어렵습니다. 이러한 제약으로 인해 과학계는 쉽게 구할 수 있는 현미경 장비 및 일상적인 염색 프로토콜과 호환되는 더 높은 해상도를 달성하기 위한 대체 솔루션을 찾게 되었습니다. 2015년, 샘플을 물리적으로 확장하여 광학 현미경의 한계를 우회하는 방법은 Boyden과 동료들에 의해 확장 현미경(ExM)4이라고 불리는 개발되었습니다.

ExM은 빛의 회절 한계를 초과하지 않으면서 생물학적 시료의 나노 단위 세부 정보를 제공하는 3단계 방법입니다(그림 1). 대신, 기존의 회절 제한 현미경을 사용하여 등방성 방식으로 물리적으로 확대된 샘플을 이미지화합니다. 겔화(gelation)라고 하는 첫 번째 단계는 일반적으로 고정된 세포 또는 조직인 생물학적 샘플을 아크릴레이트 나트륨과 아크릴아미드를 기반으로 하는 팽창성 고분자 전해질 하이드로겔에 삽입하는 것으로 구성됩니다. 그런 다음 생물학적 샘플은 효소 처리를 거쳐 단백질이나 막과 같은 특정 구성 요소를 부분적으로 분해하고 조밀한 세포 구조를 분해하여 세포가 균일하게 증식할 수 있도록 합니다. 분해라고 하는 이 단계는 기계적 특성과 관련하여 샘플의 구조적 구성 요소를 균질화하여 샘플의 왜곡으로 이어질 수 있는 차등 팽창을 방지함으로써 이를 달성하는 데 도움이 됩니다. 마지막으로, 팽창이라고 하는 마지막 단계에서는 하이드로겔이 포매되고 분해된 샘플을 탈이온수에 넣어 팽창시킵니다. 이 기술은 모든 차원에서 약 4-5배의 선형 배율로 샘플이 확장되어 표준 현미경 기술을 사용하여 미세한 세포 세부 사항을 시각화할 수 있습니다. 팽창의 등방성 특성을 감안할 때, 겔 매트릭스 내에서 확대된 생물학적 샘플은 3차원의 기하학적 세부 사항과 다양한 구조 구성 요소 간의 공간적 관계를 유지합니다. 따라서 공간 정보는 팽창 시 보존되는 반면, 겔에 고정된 형광 라벨 또는 생체 분자 사이의 거리는 모든 방향에서 균일하게 증가합니다. 이를 통해 신호를 더 잘 분리할 수 있어 해상도가 향상됩니다.

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그림 1: ExM 프로토콜 개요. (a) 겔화: 생물학적 샘플은 팽창성 고분자 전해질 하이드로겔 내에 고정되고 매립됩니다. (b) 소화: 샘플의 기계적 특성은 효소와 세제를 사용하여 균질화되어 팽창을 제한하고 왜곡을 생성할 수 있는 단백질과 지질막을 분해합니다. (c) 팽창: 하이드로겔이 탈이온수에 잠겨 등방성으로 팽창합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2015년 이후 ExM은 공간 정보 보존 분야에서 상당한 기술적 발전을 이뤘습니다. 특히, 다양한 분자 앵커는 생체 분자를 팽창성 하이드로겔 5,6에 직접 공유 결합하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜에서는 생체 분자(일반적으로 라이신 잔기 또는 단백질의 N-말단 위치)의 유리 아민 그룹과 반응하여 아크릴로일 그룹을 당단백질을 포함한 세포 단백질에 생체 접합하는 N-아크릴록시숙신이미드(NAS)를 사용했습니다. 그런 다음 이 아크릴로일 그룹은 겔화 중 가교 반응을 통해 다른 단량체와 반응하여 이러한 생체 분자를 폴리머에 직접 고정합니다.

ExM은 대사 올리고당 엔지니어링(MOE)을 포함한 광범위한 라벨링 방법과 호환됩니다. MOE는 생체 직교 화학 물질 핸들7이 장착된 대사 전구체의 유사체를 통합하여 글라이칸을 라벨링할 수 있는 강력한 도구입니다. 화학 리포터(chemical reporter)로 알려진 이러한 유사체는 독성을 일으키지 않고 대사 경로에 통합됩니다. MOE 접근법에서 리포터 단당류는 대사를 통해 활성화된 뉴클레오티드 당으로 처리된 다음 초기 당접합체로 전달됩니다. 우리의 주요 초점은 시알릴화, 특히 시알릴화된 N-당단백질의 세포 내 역학 및 이동에 대한 연구이며, 이는 세포-세포 상호 작용, 면역 조절 및 발달에 대한 역할로 인해 건강과 질병의 맥락에서 매우 중요합니다. 비정상적인 시알릴화는 암 8,9,10,11, 감염성 질환12, 유전 질환 13,14,15와 같은 질병과 관련이 있어 치료 개발 및 바이오마커 발견의 핵심 표적이 됩니다. 시알릴화를 이해하면 당생물학 및 질병 메커니즘에 대한 통찰력이 향상됩니다.

시알릴화는 인간에게 가장 풍부한 시알산인 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac)의 유사체 또는 Neu5Ac의 대사 전구체인 N-아세틸만노사민(ManNAc)의 유사체와 MOE를 사용하여 생체 직교 핸들 8,16을 지니고 있습니다. ManNAc는 세포질에서 Neu5Ac로 전환된 다음 핵에서 cytidine-5'-monophospho-N-neuraminic acid(CMP-Neu5Ac)로 활성화됩니다. 일단 뉴클레오티드 당으로 활성화되면, 골지체의 시알릴 전이효소는 Neu5Ac 단위를 성장하는 글라이칸 사슬의 말단 위치로 전달합니다(그림 2). 부자연스러운 ManNAc 유도체의 대사 통합에 따라, 태그가 지정된 시알릴화 글라이칸은 생체 직교 클릭 화학을 통해 리포터 핸들에 상보적인 반응기를 지닌 형광단에 공유 결합할 수 있습니다. 이를 통해 in vivo 또는 ex vivo에서 glycoconjugate를 직접 관찰할 수 있습니다.

대부분의 단당류 기자의 경우, 수동 확산을 통해 원형질막을 통과하기 위해 과아세틸화 형태가 필요합니다. 그러나 과아세틸화 및 보호되지 않은 기자 모두 시알릴화16을 효율적으로 조사하는 것으로 나타났습니다. 보호되지 않은 시알릴화 리포터는 활성 수송 메커니즘, 즉 Neu5Ac 유사체에 대한 음세포증가증과 ManNAc에 대한 아직 확인되지 않은 수송체에 의해 세포에 들어갈 수 있습니다. 보호되지 않은 당은 유사한 효과를 얻기 위해 더 높은 농도(일반적으로 100-500μM)가 필요하지만 일단 세포 내부로 들어가면 시알산 대사 경로로 직접 들어갈 수 있습니다. 대조적으로, 과아세틸화된 당은 대사적으로 활성화되기 전에 세포 내 비특이적 에스테라제에 의해 완전히 탈아세틸화되어야 합니다. 더 낮은 농도(일반적으로 10-50μM)에서 사용할 수 있지만 불완전한 탈아세틸화는 효소 활성을 방해하거나 부분적으로 아세틸화된 시알산 유사체의 통합으로 이어져 잠재적으로 다운스트림 분석을 왜곡할 수 있습니다. 또한 아세트산의 방출은 국부적으로 pH에 영향을 미쳐 잠재적으로 세포 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. Chen과 동료들은 또한 per-O-acetylated 당이 비효소 메커니즘을 통해 단백질의 유리 시스테인 잔류물과 반응하여 off-target 혼입 및 비특이적 신호 증가로 이어진다는 것을 입증했습니다 17,18. 따라서 본 프로토콜에서는 보호되지 않은 ManNAc 보고자를 고용합니다.

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그림 2: 대사 올리고당(metabolic oligosaccharide) 엔지니어링 및 시알산(sialic acids)의 라벨링. UDP-GlcNAc는 세포질에서 GNE/MNK의 UDP-GlcNAc 2-에피머라제 도메인에 의해 ManNAc로 변환됩니다. 그런 다음 ManNAc는 GNE/MNK의 ManNAc 6-키나아제 도메인에 의해 세포질에서 인산화되어 ManNAc-6-인산염을 형성합니다. N-아세틸뉴라미네이트 합성효소는 ManNAc-6-P와 포스포에놀피루베이트의 응축을 촉매하여 Neu5Ac-9-인산을 생성하고, 이후 시알산 인산가수분해효소에 의해 탈인산화되어 Neu5Ac를 생성합니다. Neu5Ac는 세포내이입(endocytosis)과 리소좀 재활용(lysosomal recycling8)을 통해 구제 경로를 통해 공급될 수도 있다. 핵으로 수송된 후 CMP-시알산 합성효소에 의해 CMP-Neu5Ac로 전환됩니다. 골지체에서 CMP-NeuAc는 성숙 당접합체에서 글라이칸의 말단 위치에 Neu5Ac 부분을 도입하는 시알릴전이효소의 기질이며, 이는 결국 세포막에서 발현되거나 분비됩니다. 생체 직교 손잡이를 가진 ManNAz 화학 리포터는 미확인 활성 수송체를 통해 세포를 관통하고 대사 경로로 들어갈 수 있습니다. 생합성 후 글라이칸에 통합된 태그가 지정된 Neu5Az 단위는 형광 프로브의 CuAAC 매개 접합을 통해 표지됩니다. 약어 : NAc = N- 아세틸; UDP-GlcNAc = 우리딘 이인산 N- 아세틸 글루코사민; ManNAc = N-아세틸만노사민; GNE = UDP-GlcNAc 2-에피머라제; MNK = ManNAc 6-키나아제; ManNAc-6-P = ManNAc-6-인산염; NANS = N-아세틸뉴라미네이트 합성효소; PEP = 포스포에놀피루베이트; Neu5Ac = N-아세틸뉴라민산; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-인산염; NANP = 시알산 인산가수분해효소; CMP = 시티딘-5'-일인산염; CMAS = CMP-시알산 합성효소; STS = 시알릴 전이효소; ManNAz = N-아지도아세틸만노사민; Neu5Az = N-아지도아세틸뉴라민산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

가능한 생체 직교 반응 중에서 우리는 구리 촉매 아지드-알킨 순환 첨가 (CuAAC) 16 , 19 에 관심을 집중했습니다. 우리의 경험에 따르면 CuAAC는 고정 세포에서 세포 내 글라이칸을 라벨링하는 데 가장 적합한 옵션입니다. 이 반응은 잘 정립되어 있고 생물 직교 화학에서 철저하게 연구되었으며 복잡한 생물학적 환경에서 사용할 수 있도록 표준화되어 견고한 지식 기반과 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 빠른 동역학은 실제로 높은 반응 효율과 특이성을 제공하며, 합성이 쉽고, 안정적이며, 살아있는 시스템에 없고, 네이티브 생체 분자에 대해 불활성인 아지드 및 알카인 그룹을 포함하므로 구리 독성이 문제가 되지 않는 고정 세포 응용 분야에 이상적입니다. 균주 촉진 알킨 아지드 순환 첨가 (SPAAC) 20 , 21 은 구리 독성을 피하면서 역학이 느리고 프로브가 부피가 커서 소수성 트래핑으로 인해 세포 내 응용 분야에서 백그라운드 신호가 더 높아지고 신호 대 잡음비가 감소하는 경향이 있는 반면, 역 전자 수요 Diels-Alder (IEDDA) 22 , 23는 빠르고 구리가 없지만 더 복잡한 프로브 합성을 포함하며 MOE 응용 분야에서 아직 완전히 특성화되지 않은 더 큰 리포터 그룹이 필요합니다. ExM은 고정 세포만을 필요로 하기 때문에 CuAAC는 생체 직교 라벨링을 위한 강력하고 효율적인 솔루션을 제공합니다.

이 논문은 대사 라벨링, 생물직교 클릭 화학 및 확장 현미경을 결합하여 세포 내 세포 내 시알릴화 당단백질을 시각화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 본 논문에 기술된 실험 절차에서는 N-아지도아세틸만노사민(ManNAz)을 화학 리포터로 사용하며, 팽창 절차 전에 작은 유기 형광단의 CuAAC 결찰을 수행합니다. 당단백질(glycoprotein)은 겔화(gelification), 분해(digestion) 및 팽창(expansion) 전에 NAS와 함께 하이드로겔에 고정됩니다. 시알산의 MOE 라벨링은 cis-Golgi 장치에 국한된 마우스 anti-GM130 1차 항체에서 볼 수 있듯이 공동 국소화 평가를 위한 면역형광 접근법과 관련될 수 있습니다. 이 프로토콜은 생리학적 상태의 세포 또는 화학적 처리를 받은 세포에 적용할 수 있습니다. 이를 설명하기 위해 클로로퀸은 세포 내 당단백질의 처리 및 이동에 영향을 미치는 리소좀 기능을 억제하는 데 사용되었습니다. 핵 염색은 세포의 국소화뿐만 아니라 ExM 공정의 품질을 나타내는 지표로 사용됩니다. 팽창 계수는 실제로 확장 전(preExM)과 확장 후(postExM)의 크기를 비교하여 측정할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 세포 파종

알림: 층류 후드 아래에서 멸균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오. 이 방법은 본 연구에 사용된 모든 세포주(HeLa, MCF7, 1차 섬유아세포) 또는 연구에서 일반적으로 사용되는 가장 부착성 세포주 모델에 적용할 수 있습니다 20,24,25.

  1. 5% CO2 대기에서 37°C의 T75 플라스크에 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 DMEM 고포도당 배지에서 세포를 성장시킵니다.
  2. 세포가 완전히 포화도에 도달하면 세포 배양 배지를 제거하고 PBS 4mL로 세포를 세척합니다.
    알림: 이 단계와 모든 후속 세척 단계에서 사용되는 PBS 용액은 사용하기 전에 0.2μm PTFE 멤브레인을 통한 여과로 멸균해야 합니다.
  3. 0.5 g/L의 트립신이 함유된 1x 트립신-EDTA 용액 2 mL에 37 °C에서 5분 동안 세포를 배양하여 플라스크 바닥에서 세포를 방출합니다.
  4. 10% FBS를 함유한 DMEM 고포도당 배지 8mL를 추가하고 완전히 혼합하여 모든 세포가 플라스크 바닥에서 분리되도록 합니다.
  5. 세포를 15mL 코니컬 튜브에 옮기고 200 × g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 동안 12웰 플레이트의 각 웰에 하나의 커버슬립(직경 12mm, 두께 130-160μm)을 추가합니다.
    알림: 커버슬립 두께는 후속 이미징 단계에서 사용되는 현미경의 요구 사항에 맞게 조정해야 합니다.
  6. 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠렛을 1mL의 세포 배양 배지에 재현탁합니다.
  7. 최소 두 번의 측정에서 혈구 측정으로 평균 세포/mL 수를 결정합니다.
  8. 세포 배양 배지에서 세포 현탁액을 mL당 300,000 세포 농도로 희석하고 각 웰에 현탁액 1mL를 시딩합니다.
  9. 다음 단계 전에 5% CO2 분위기 하에서 37°C에서 10% FBS를 함유하는 10% FBS를 함유하는 DMEM 고포도당 배지에서 세포가 24시간 동안 정착하도록 합니다.

2. 클로로퀸 치료(선택 사항)

참고: 2.1-2.8단계는 클로로퀸을 예로 사용하여 외부 시약(억제제, 효과기, 약물)으로 처리된 세포에 프로토콜을 사용하는 방법을 보여줍니다. 외부 시약으로 처리되지 않은 세포의 경우 이 단계를 건너뜁니다.

  1. 정확한 양의 클로로퀸 이인산염(CQ)을 계량하여 10mM 원액의 충분한 부피를 준비합니다.
    알림: 층류 후드 아래에서 멸균 상태에서 다음 단계를 수행하십시오.
  2. 10mM의 최종 농도를 위해 원하는 양의 탈이온수에 고체 CQ를 용해시킵니다.
  3. 0.2μm 필터를 통해 용액을 필터링합니다.
  4. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 10mM 스톡 용액 1mL를 부분 표본으로 추출하고 -20°C에서 보관합니다.
  5. 1.9단계에서 준비한 세포 샘플을 PBS 1mL로 세척합니다.
  6. 10% FBS를 함유한 9.9mL의 DMEM 고포도당 배지에 100μL의 100mM CQ를 추가하여 최종 농도 100μM의 CQ를 얻습니다.
  7. 5% CO2 분위기에서 37°C에서 100μM의 CQ가 보충된 배지 1mL에서 8시간 동안 세포를 배양합니다.
  8. PBS 1mL로 세포를 3x 세척합니다.

3. 대사 올리고당 공학

  1. 10% FBS를 함유하는 DMEM 고포도당 배지에서 ManNAz(또는 음성 대조군 조건의 경우 ManNAc)의 5mM 원액을 준비합니다.
    참고: 이 원액은 각 웰을 1mL의 설탕 유사체 용액으로 처리할 수 있을 만큼 충분한 부피여야 합니다. 층류 후드 아래에서 멸균 상태에서 다음 단계를 수행합니다.
  2. 0.2μm 필터를 통해 용액을 여과하고 필요할 때까지 -20°C에서 1mL 분취량에 보관합니다.
  3. 3.2단계에서 준비한 1mL 원액 분취액을 10% FBS를 함유한 9mL의 DMEM 고포도당 배지로 희석하여 500μM의 ManNAz 또는 ManNAc가 보충된 배지를 준비합니다.
  4. 1.9단계(처리되지 않은 세포 실험의 경우) 또는 2.8단계(CQ 처리된 세포 실험의 경우)에서 제조된 세포를 500μM ManNAz(대조군의 경우 500μM ManNAc)가 보충된 배지 1mL에 5%CO2 분위기 하에서 37°C에서 24시간 동안 배양합니다.

4. 정착과 투과성

알림: 이 모든 단계는 흄 후드 아래에서 수행됩니다.

  1. PBS 1mL로 샘플을 세척합니다.
  2. 500μL의 5% 파라포름알데히드를 추가하여 각 커버슬립의 세포를 고정합니다. 실온에서 15분 동안 그대로 두십시오.
  3. PBS 1mL로 3x 세척합니다.
  4. 뚜껑이 있는 충분히 큰 불투명 상자(예: 폴리스티렌 상자)를 사용하여 맞춤형 습한 챔버를 준비합니다. 상자 바닥에 젖은 압지 조각을 놓고 그 위에 파라필름을 한 겹 얹습니다.
    알림: 습한 챔버는 닫혔을 때 외부 광원으로부터 샘플을 완전히 보호해야 합니다.
  5. 파라필름에 커버슬립을 놓고 세포가 위를 향하도록 합니다.
    참고: 파라필름에 샘플의 이름 또는 참조를 미리 표시하십시오.
  6. PBS에 200μL의 0.5%(v/v) Triton X-100을 사용하여 실온에서 15분 동안 세포 투과화를 수행합니다.
  7. 200μL의 PBS로 3회 세척합니다.

5. 형광 라벨링

  1. 태그가 지정된 시알릴화 글라이칸의 CuAAC 라벨링
    참고: CuAAC 반응 완충액은 사용 전에 새로 준비해야 하며, 반응물은 지정된 순서로 첨가해야 하며 아스코르브산나트륨은 마지막에 첨가해야 합니다. 산소화된 수용액에서 Ascorbate로 Cu(II)가 환원되어 형성된 Cu(I) 이온은 점차적으로 Cu(II)로 재산화되어 시간이 지남에 따라 Ascorbate 농도가 감소합니다. 결과 재현성을 유지하기 위해 버퍼는 4°C에서 며칠 이상 보관해서는 안 되며 당일에 사용하는 것이 좋습니다.
    1. 섹션 3에서 조작된 아지드 변형 시알릴화 글라이칸을 라벨링하기 위해 5μM AlexaFluor 488 알킨(AF488Alk), 150μM CuSO4, 300μM 2-(4-((bis((1-(tert-butyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)amino)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)acetic acid(BTTAA), 0.1 M K2HPO4 및 2.5 mM 아스코르브산 나트륨으로 구성된 CuAAC 반응 완충액을 탈이온수. 각 커버슬립에 200μL를 도포할 수 있는 충분한 용액을 준비합니다.
    2. 각 커버슬립에 200 μL의 CuAAC 버퍼를 추가하여 반응을 시작합니다. 샘플이 방울로 균일하게 덮여 있는지 확인하고 빛으로부터 보호된 실온에서 45분 동안 반응하도록 합니다.
    3. 200 μL의 PBS로 3x 세척하여 반응을 중지하고 과도한 프로브와 시약을 제거합니다.
  2. 핵 염색
    1. Hoechst 33342를 사용한 핵 라벨링의 경우 PBS에서 1:2000으로 10mg/mL 원액을 희석합니다.
      참고: 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)과 같은 동등한 핵 대조염색제를 사용하여 동일한 효과를 얻을 수 있습니다.
    2. 이 용액 200 μL로 세포를 덮고 빛으로부터 보호되는 실온에서 5-10 분 동안 배양합니다.
    3. 200μL의 PBS로 3회 세척합니다.
  3. 면역형광 염색
    1. 50mL의 완충액에 대해 젤라틴 0.1g, BSA 1g, FBS 1mL 및 PBS 49mL를 함유한 소 혈청 알부민(BSA) 차단 완충액을 준비합니다.
    2. 200 μL의 BSA 차단 버퍼에서 4 °C에서 1 시간 동안 샘플을 배양합니다. 빛으로부터 샘플을 보호하십시오.
    3. 정제된 마우스 anti-GM130 항체(인식된 항원결정기: Rat GM130 aa. 869-982 | RRID: AB_398142)을 사용하여 준비된 BSA 차단 완충액에서 1:100으로 1차 항체를 희석합니다.
      참고: 이 단계는 관련 1차 항체를 사용하여 다른 소기관을 표적으로 하는 면역형광 염색에 적용할 수 있으며, 이 경우 제조업체의 지침에 따라 희석 인자를 조정해야 합니다.
    4. 항체가 포함된 용액 70μL를 커버슬립에 첨가하고 빛으로부터 보호된 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
    5. 200μL의 PBS로 3회 세척합니다.
    6. 형광 2차 항체(Alexa Fluor 546 anti-mouse IgG)를 BSA 차단 버퍼에 1:600으로 희석하고 각 커버슬립에 100μL를 추가합니다.
    7. 빛을 차단한 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.
    8. 200μL의 PBS로 3회 세척합니다.
    9. 커버슬립을 6웰 플레이트로 옮깁니다. 샘플을 4°C의 PBS 2mL에 담아 빛으로부터 보호하여 며칠 동안 보관하십시오.
      참고: 확장 전후의 비교 목적을 위한 참조로 preExM 시각화 전용으로 복제를 항상 준비하고 확장 후 라벨링 패턴이 왜곡되지 않았는지 확인하는 것이 좋습니다.

6. 샘플의 Preexpansion 이미징

참고: 다음 단계는 사용하는 바이오이미징 장비에 따라 다르며 기계의 요구 사항에 맞게 조정해야 할 수 있습니다. 지역 실험실 또는 바이오이미징 플랫폼의 규칙을 따르십시오. 여기서 6.1-6.13 단계는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 수행됩니다.

  1. 현미경을 켜고 광원(레이저)이 예열되었는지 확인합니다. 바이오이미징 획득 소프트웨어를 엽니다.
  2. 형광단에 해당하는 레이저 여기 파장을 선택하여 채널을 생성합니다(예: 핵 염색의 경우 405nm, AF488Alk 표지된 시알릴화 글라이칸의 경우 488nm, 면역형광 표지의 경우 546nm). 그에 따라 레이저를 활성화하십시오.
  3. 32mm 직경의 커버슬립(130-170μm 두께)을 현미경에 맞게 조정된 홀더에 놓고 고정합니다.
  4. 5.3.9단계에서 준비한 샘플을 세포가 아래를 향하도록 하여 32mm 커버슬립에 놓습니다. 샘플이 마르는 것을 방지하기 위해 탈이온수 한 방울을 추가합니다.
  5. 적절한 대물 렌즈를 선택하며, 여기서는 1.4 개구수 또는 이에 상응하는 63x 오일 이멀젼 대물렌즈를 선택하십시오.
    참고: 가장 높은 개구수가 최상의 해상도를 제공합니다. 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용할 때 대물렌즈와 커버슬립 사이에 오일 한 방울을 추가하는 것을 잊지 마십시오.
  6. 홀더를 현미경 스테이지에 놓습니다.
  7. 명시야 또는 낮은 레이저 강도 형광 모드를 사용하여 샘플에서 관심 영역을 찾습니다.
  8. 초점을 설정합니다.
  9. 소프트웨어의 세포를 라이브 형광 모드로 시각화합니다. 각 채널의 레이저 강도를 설정합니다. 광표백을 피하기 위해 낮은 레이저 출력으로 시작하십시오. 레이저 출력을 천천히 증가시키고 검출기 게인 및 오프셋을 조정하여 과다 노출 없이 형광을 명확하게 시각화하기 위해 필요에 따라 과도한 노이즈를 도입하지 않고 신호를 증폭합니다.
    알림: 배경 소음을 최소화하고 신호 포화를 피하도록 매개변수를 조정해야 합니다. 음성 대조군을 포함한 일련의 실험에서 모든 샘플에 걸쳐 일관된 설정을 유지하는 것이 중요합니다.
  10. 원하는 관측치에 도달하는 데 필요한 핀홀 크기(예: 1 Airy Unit), 스캔 속도(예: 8), 확대/축소 계수(예: 1), 밝기 값 범위(예: 16비트), 평균 수(예: 2), 모드(예: 선) 및 방법(예: 평균)과 같은 이미지 매개변수를 설정합니다.
    참고: 이 값은 시스템 및 샘플에 따라 다르며 획득 전에 최적화해야 합니다. 핀홀 크기는 개구수, 배율 및 파장에 따라 달라지며, 이를 줄이면 신호 대 잡음비가 저하되는 대신 해상도가 향상될 수 있습니다. 광표백을 방지하기 위해 스캔 속도를 빠른 값(픽셀당 작은 체류 시간에 해당)으로 설정하는 것이 좋습니다.
  11. 수집을 수행하고 나중에 참조할 수 있도록 적절한 메타데이터와 함께 원하는 형식으로 데이터를 저장합니다.
  12. 수집이 완료되면 한 쌍의 핀셋으로 쉽게 이동할 수 있도록 소량의 탈이온수를 추가하여 샘플을 6웰 플레이트에 다시 넣습니다.
    참고: 6.12단계는 이 특정 샘플의 확장이 필요한 경우에만 수행됩니다. 그렇지 않으면 샘플을 폐기하고 다음 단계를 위해 다른 반복실험을 사용합니다.

7. 확장 현미경 프로토콜

참고: 샘플은 광표백을 방지하기 위해 빛으로부터 최대한 보호됩니다. 앵커링 및 겔화 단계는 흄 후드 아래에서 수행됩니다.

  1. 정박
    1. PBS 중 3.2mg/mL 농도의 N-아크릴로일숙신이미드(NAS)를 실온에서 1시간 동안 기계식 셰이커에 주입하여 샘플을 배양합니다. 웰당 500μL의 용액을 추가할 수 있는 충분한 양의 용액을 준비합니다(원액: DMSO의 16mg/mL NAS).
      참고: NAS는 단백질의 라이신 잔류 물 및 N-말단과 반응하여 아크릴로일 그룹을 이식하여 단백질이 후속 단계에서 하이드로겔에 고정될 수 있도록 합니다.
    2. PBS 1mL로 3x 세척합니다.
  2. 겔화
    1. 1x PBS 50mL(pH 7.4)에 NaCl 5.843g, 아크릴아미드 1.25g, 비스-아크릴아미드 0.075g, 아크릴레이트나트륨 4.313g을 첨가하는 단량체 용액을 준비합니다. 각 커버슬립에 70μL를 도포할 수 있는 충분한 용액을 준비합니다. 겔화 최소 24시간 전에 1mL 분취액을 동결합니다.
      주의 : 단량체는 독성이 있습니다. 적절한 보호 장비를 사용하여 조심스럽게 다루어야 하며 흄 후드 아래에서 무게를 측정해야 합니다.
    2. 파라 필름 조각에 70 μL 방울의 단량체 용액을 놓고 1.4 μL의 10 % (v / v) N, N, N ', N'- 테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TMEDA)을 첨가 한 다음 1.4 μL의 10 % (w / v) 과황산 암모늄 (APS)을 방울에 혼합합니다.
      참고: 교차결합제 시약은 TMEDA를 먼저 첨가한 다음 APS를 첨가해야 합니다.
    3. 재빨리 셀이 아래를 향하도록 용액에 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.
    4. 용액이 습한 챔버에서 실온에서 1시간 동안 중합되도록 합니다.
  3. 소화
    1. 1x TAE 완충액, 0.5%(v/v) Triton X-100, 0.8M 구아니딘 HCl 및 8U/mL proteinase K로 구성된 분해 완충액을 준비합니다.
      참고: 분해 버퍼는 사용하기 전에 30°C에서 37분 동안 신선하게 준비하고 사전 배양해야 합니다.
    2. 7.2단계에서 형성된 하이드로겔에 1mL의 분해 완충액을 추가합니다. 기계식 셰이커에서 3°C에서 37시간 동안 분해를 진행하십시오.
    3. 소화 버퍼를 제거하고 탈이온수 3mL로 젤 2x를 부드럽게 씻습니다.
      알림: 하이드로겔은 약간 팽창하여 커버 슬립에서 분리됩니다.
  4. 확장
    1. 하이드로겔을 탈이온수 3mL에서 2시간 동안 팽창하도록 둡니다. 30분마다 물을 갈아주세요.

8. 샘플의 팽창 후 이미징

  1. 직경 32mm의 커버슬립(두께 130-170μm)을 놓고 홀더에 고정합니다.
  2. 하이드로겔 조각을 잘라내어 세포가 젤 바닥에 오도록 하여 커버 슬립에 놓습니다.
    참고: 절제된 조각은 관찰을 위한 적절한 표면적을 제공할 수 있을 만큼 충분히 커야 하지만 젤 취급을 어렵게 하고 파손 위험을 증가시킬 수 있으므로 너무 크지 않아야 합니다(권장 크기: 5-8mm). 커버슬립의 전체 표면을 덮을 수 있을 만큼 충분한 하이드로겔 조각을 놓습니다. 이렇게 하면 조각을 제자리에 고정하고 이미징 중 드리프트를 방지하는 데 도움이 됩니다. 드리프트 문제가 있는 경우 커버슬립을 poly-D-lysine으로 사전 코팅하는 것이 유리할 수 있습니다6.
  3. 홀더를 현미경 스테이지에 놓습니다.
  4. 6단계에서 설명한 대로 오일 이멀젼 대물렌즈가 있는 Laser Scanning Confocal Microscope에서 이미지 획득을 수행합니다.

9. ImageJ에서 확장 계수(EF) 계산

  1. ImageJ 프리웨어 또는 이와 동등한 제품에서 이미징 데이터를 엽니다.
  2. 다중 채널 이미지에서 작업하는 경우 Select Image(이미지 선택) | 색상 | 채널을 분할합니다.
  3. 핵 직경을 측정하려면 Select Image(이미지 선택) | 조정 | 임계값.... 기본 드롭다운 메뉴에서 이미지에 가장 잘 맞는 방법(예: Otsu)을 선택하고 핵의 모양이 배경에서 명확하게 잘릴 때까지 임계값을 조정합니다.
    참고: 하나의 설정이 모든 이미지 또는 모든 샘플에 맞지 않을 수 있으므로 각 이미지에 대해 임계값 설정을 조정해야 합니다.
  4. Select Analyze(분석 선택) | 측정 설정 .... 메뉴에서 Feret diameter(페렛 지름)를 선택하고 필요한 경우 소수를 조정합니다.
  5. 이미지 분석을 시작하려면 Select Analyze(분석 선택) | 입자를 분석하여 입자의 크기를 설정합니다. 핵의 경우 5-infinity μm² | 결과 표시 | 관리자에 추가 | 가장자리 및 오버레이에서 제외. 분석을 시작합니다.
  6. 분석이 시작되면 여러 창이 나타납니다. 창 결과에서 Feret 컬럼에 있는 각 핵의 최대 Feret 직경을 찾습니다. 원시 데이터를 스프레드시트에 복사하여 붙여넣고 사전 확장 및 확장 샘플의 평균 핵 크기를 계산합니다.
    참고: 각 핵에 해당하는 관심 영역(ROI)이 핵의 전체 주변을 따르는지 확인하십시오.
  7. 확장 계수(EF)를 다음과 같이 계산합니다.
    EF = figure-protocol-1
    참고: EF 계수는 샘플이 얼마나 확장되었는지를 결정합니다.

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결과

아래는 CQ 처리(프로토콜 섹션 2) 및 면역형광 공동 국소화 염색(프로토콜 단계 5.3)을 생략하고 HeLa 세포(그림 3A) 및 MCF7 세포(그림 3B)에서 시알릴화된 당단백질을 시각화하기 위한 프로토콜의 적용입니다.

figure-results-1
그림 3: ExM 프로토콜 이전(왼쪽)과 이후(오른쪽)의 시알릴화 라벨링 패턴 비교. (A) Hela 세포 및 (B) MCF7 세포를 500μM ManNAz로 24시간 동안 배양했습니다...

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토론

본 CuAAC 라벨링 프로토콜은 반응 완충액에 아미노구아니딘을 포함하지 않는다. 세포 내 glycoconjugate를 시각화하는 것을 목표로 하기 때문에 세포 독성 문제를 방지하고 촉매 시스템의 흡수를 개선하기 위해 대사 통합 단계 후에 고정된 세포에서 수행됩니다. 아미노구아니딘의 사용은 일반적으로 단백질의 디하이드로아스코르베이트와 아르기닌, 히스티딘 및 라이신 잔기 사이의 부반응을 방지하기 위해 살아있는 세포의 세포 표면 표지에 권장됩니다28. 이러한 변형은 실제로 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있으며 잠재적으로 섭동 또는 세포 독성을 유발할 수 있습니다. CuAAC 반응 완충액에 대한 또 다른 중요한 고려 사항은 BTTAA에 의한 구리 이온의 복합화가 빠르지만 즉각적이지는 않다는 것입니다. 변형된 설탕의 효율적인 라벨링을 보장하기 위해 라벨링 프로세스를 시작하기 최소 30분 전에 용액을 준비하여 초보 사용자가 결과를 재현할 수 있도록 하는 것이 좋습니다.

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계나 기타 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업을 수행하는 데 도움이 되는 기술 환경을 제공한 TisBio 시설과 PLBS 플랫폼에 감사드립니다. 이 작업은 CNRS와 Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche의 보조금으로 지원되었습니다. 토론을 고무하고 Fibroblast 533T 세포주와 1차 항체 GM130을 제공해 주신 François Foulquier 박사, Zoé Durin, Dorothée Vicogne 여사, Céline Schulz 여사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(+) 나트륨 L-아스코르브산염 시그마 알드리치11140
12 웰 세포 배양 플레이트코닝3513
아크릴아미드시그마 알드리치A8887
아크릴산 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 시그마 알드리치A8060
알렉사 플루어 488 알킨 Jena BioscienceCLK-1277-5
Alexa Fluor 546 염소 안티 마우스 IgGInvitrogenA11003
과황산 아모늄시그마 Aldrich9913
비스 아크릴 아미드시그마 Aldrich146072
BSA시그마 AldrichA7906
BTTAAJena BioscienceCLK-067-100
원심분리 튜브 2 mLEPPENDORF30120094
클로로퀸 디포스페이트 염Sigma AldrichC6628
코니컬 튜브 15 mLFalcon352097
커버 슬립 12 mm #1에프레디아CB00120RA120MNZ0
커버 슬립 32 mm #1에프레디아CB00320RA140MNZ0
CuSO4Sigma Aldrich209198
DMEM 고혈당 매체 DutscherL0104-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) DutscherL0615-500
소 태아 혈청biowestS1810-500
섬유아세포 533T--건강한 개인에서 수집
FIJI ImageJ 2.9.0--
젤라틴Bio-RAD170-6537
구아니딘 HCl시그마 알드리치50950
HeLa 세포ATCCCCL-2
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Imaris 10.2--
K2HPO4EuromedexPB0447-B무수
LSM 780 Confocal Microscopy 
ATCCHTB-22
N-아세틸만노사민 (ManNAc)BIOSYNTHMA05269
NaClCarlo Erba479687
N-azidoacetylmannosamine (ManNAz)BIOSYNTHMA46002
Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 oil DIC M27Zeiss420782-9900-799 
인산염 완충 식염수 (PBS) 10xEuromedexET330
단백질분해효소 K시그마 알드리치P2308에서  Tritirachium 앨범
정제 마우스 GM130 항체BD Bioscience61082250 µ g
아크릴레이트 나트륨 시그마 알드리치408220
T75 플라스크코닝430641
TEMED시그마 알드리치T9281
트리스 아세테이트 EDTA (TAE) 10xEuromedexEU0202-B
트리톤 X-100시그마 알드리치X-100
트리판 블루Dutscher702630
트립신-EDTA 1xDutscherL0930-100
Zeiss-MCF7

참고문헌

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