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방법 논문

액체 크로마토그래피-트랩 이온 이동성 분광법-비행 시간 질량 분석법을 통한 식품 매트릭스에서 조절되는 맥각 알칼로이드 검출

2K 조회수

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DOI:

10.3791/67484

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2024년 11월 22일

 ,  ,  , 
1Department of Analytical Chemistry, Faculty of Sciences, University of Granada, 2Department of Preventive Medicine and Public Health, Food Science, Toxicology and Forensic Medicine, Faculty of Pharmacy and Food Science, University of Valencia

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 최근 발표된 EU Commission Regulation 2023/915에 따라 식품 내 맥각 알칼로이드의 존재를 결정하기 위해 검증된 액체 크로마토그래피-이온 이동성-고분해능 질량 분석 방법을 제공합니다.

초록

Ion Mobility 질량분석법(IMS)은 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS) 워크플로우에 통합될 때 추가 분리 차원으로 작용합니다. LC-IMS-MS 방법은 기존 LC-MS 방법에 비해 더 높은 피크 분해능, 동중원소 및 이성질체 화합물의 향상된 분리, 향상된 신호 대 잡음비(S/N)를 제공합니다. IMS는 분석물 식별을 위한 또 다른 분자 특성, 즉 충돌 단면(CCS) 매개변수를 제공하여 거짓 양성 결과를 줄입니다. 따라서 LC-IMS-MS 방법은 식품 안전 분야에서 중요한 분석 과제를 해결합니다(즉, 복잡한 식품 매트릭스에서 미량 수준의 화합물 검출 및 동중원소 및 이성질체 분자의 명확한 식별).

맥각 알칼로이드(EA)는 곰팡이에 의해 생성되는 진균독의 일종으로, 호밀, 삼백초, 밀, 보리, 기장, 귀리와 같은 작은 곡물을 포함한 다양한 잔디 종을 공격합니다. 이러한 진균독의 최대 수준(ML)은 위원회 규정 EC/2023/915에 자세히 설명된 대로 여러 식품에서 확립되었습니다. 이 새로운 법안에는 6개의 주요 EA와 해당 에피머가 포함되어 있으므로 동시 발생을 고려하여 이러한 이성질체 분자를 적절하게 구별하기 위해서는 효율적인 방법론이 필요합니다.

따라서 이 프로토콜의 목표는 LC-MS 워크플로우에 IMS를 통합하는 것이 어떻게 이성질체 EA의 분리에 기여하여 분석 방법의 선택성을 향상시키는지 보여주는 것입니다. 또한 분석 표준물질의 특성화를 통한 CCS 라이브러리 생성이 어떻게 진균독소 식별에 대한 더 높은 신뢰성을 제공하는지 보여줍니다. 이 프로토콜은 식품 안전에서 IMS를 구현하는 이점을 명확하게 설명하기 위해 고안되었으며, 곡물의 EA를 측정하는 것을 예로 들어 설명합니다. QuEChERS 기반 추출에 이은 LC 트랩 이온 이동성 분광법(TIMS)-MS 분석은 ML의 1.5배, 1배, 0.5배에서 허용 가능한 정확도(에르고타미닌의 경우 회수율은 낮음)로 0.65 - 2.6ng/g 범위의 정량화 한계를 제공했으며, 매트릭스 효과는 무시할 수 있는 수준이었습니다.

서론

이온 이동성 질량분석법(IMS)은 점점 더 많이 사용되는 분석 기법으로 자리잡고 있으며, 종종 MS 워크플로우와 결합된 기존 액체/가스 크로마토그래피(LC/GC)에 통합된 추가 분리 차원으로 제시됩니다. IMS는 완충 가스로 채워진 이동성 셀을 따라 전기장과 대기압1에서 분자를 분리하는 것으로 구성됩니다. 질량 대 전하 비율(m/z)과 기하학적 형태에 따라 이온화된 분자는 이동성 셀을 가로질러 이동할 때 버퍼 가스와 상호 작용하며, 이는 이온 이동성(K) 매개변수2 에 반영되고 다음 방정식을 통해 계산됩니다.

figure-introduction-1

여기서 D 는 총 드리프트 길이, td 는 총 드리프트 시간, E 는 전기장을 나타냅니다. 따라서 K는 m2 V−1 s−1 로 측정되지만 실용적인 이유로 종종 cm2 V−1 s−1 로 표시됩니다. 이동성 셀을 가로질러 이동할 수 있는 내재적 능력은 드리프트 시간으로 측정할 수 있으며, 나중에 IMS 기기3와 독립적으로 각 분자에 대해 재현성이 높은 매개변수인 소위 CCS(Collision Cross Section) 값으로 변환할 수 있습니다. CCS는 다음 방정식에 따른 이동성에서 파생될 수 있습니다.

figure-introduction-2

q 는 이온의 전하입니다. N 은 버퍼 가스 수 밀도; μ 충돌 파트너의 감소된 질량은 가스 이온을 완충합니다. kB 볼츠만 상수; 및 T 는 버퍼 가스 온도입니다. 따라서 IMS는 크로마토그래피 및 MS 분석에서 얻은 분석 데이터를 보완하는 추가 정보를 제공합니다.

LC-MS 플랫폼에서 IMS를 구현하면 특히 미량 농도의 화합물로 작업할 때 분석 결정의 신뢰성이 증가하는 것으로 나타났습니다. 여러 연구에서 LC-IMS-MS 방법이 궁극적으로 방법의 민감도에 영향을 미치는 배경 잡음을 줄여 질량 스펙트럼의 품질을 개선하고 다중 잔류 LC-MS 방법론 4,5,6에서 제공하는 거짓 긍정 및 음성 비율을 줄인다고 보고했습니다. 또한 CCS 값의 재현성을 통해 동일한 기술을 사용하는 서로 다른 기기 간뿐만 아니라 가장 자주 사용되는 시스템인 TWIMS(traveling wave ion mobility spectrometry), TIMS(trapped ion mobility spectrometry) 및 DTIMS(drift tube ion mobility spectrometry)2,7와 같은 서로 다른 Ion Mobility 기술을 비교할 수 있습니다1. 따라서, 식별 매개변수로서 CCS의 잠재력의 주목할 만한 결과는 CCS 라이브러리 구축의 가능성에 있으며, 이는 대사체학 연구에서의 적용 가능성에 반영되어 있습니다8. 그럼에도 불구하고 IMS의 가장 강력한 기능 중 하나는 LC-MS 방법으로 충분히 분리되지 않을 수 있는 이성질체 및 동중압 화합물을 분리할 수 있다는 것입니다. 이는 복잡한 매트릭스에서 대규모 관심 분석물 세트로 작업할 때 발생할 수 있으며, 이는 환경 및 식품 분석에서 일반적인 상황입니다. 이러한 맥락에서 LC-IMS-MS 방법은 살충제와 식품의 동물용 의약품 및 진균독소를 모니터링하기 위해 제안되었습니다9.

높은 분리력과 선택성으로 인해 LC/GC-IMS-MS 플랫폼은 식품 안전의 현재 과제, 특히 이성질체 혼합물과 관련된 문제를 해결하는 데 가장 유용한 도구로 부상하고 있습니다. 식품 오염 물질로서의 이성질체 혼합물과 관련된 건강 문제는 예를 들어 여러 식품에서 6개의 주요 맥각 알칼로이드(EA)와 이에 해당하는 6개의 에피머의 최대 농도를 제한하는 현재 유럽 법률에 반영되어 있습니다10.

EA는 주로 Clavicipitaceae 계통 (예 : Claviceps purpurea, 광범위한 숙주 범위로 인해 가장 중요한 EA 생산자)의 광범위한 곰팡이에 의해 생성되는 독성 2 차 대사 산물의 가족을 구성하지만, 개화시 살아있는 식물 (예 : 호밀, 보리, 밀, 귀리)의 종자 머리에 기생할 수있는 Trichocomaceae 11, 12. 특정 조건, 특히 온도 및 수분 활동에서 Claviceps 곰팡이는 숙주 작물의 sclerotia 또는 맥각으로 알려진 자실체에 축적되는 EA를 생성할 수 있습니다. 어느 정도까지 EA는 최종 제품에 도달할 때까지 원료 가공을 견딜 수 있습니다. 따라서 먹이 사슬에 침입합니다. 오염된 음식을 섭취하면 맥각증으로 알려진 EA 중독이 발생할 수 있으며, 이는 복통, 구토, 피부 작열감, 불면증 및 환각과 같은 급성 증상을 나타냅니다13. EA가 인체 건강에 미치는 영향을 줄이기 위해 유럽연합 집행위원회(European Commission)는 주요 EA의 합계에 대해 여러 식품의 최대 수준(ML)을 설정했습니다: R-에머체 에르고메트리닌(Em), 에르고타민(Et), 에르고신(Es), 에르고크리스틴(Ecr), 에르고크립틴(Ekr) 및 에르고코르닌(Eco) 및 이에 해당하는 S-에피머: 에르고메트리닌(Emn), 에르고시닌(Esn), 에르고타미닌(Etn), 에르고코르닌닌(Econ), 에르고크립티닌(Ekrn), 및 에르고크리스티닌(Ecrn). 이러한 화합물은 특히 강한 빛에 노출되거나, 장기간 보관되거나, pH 12가 높거나 낮은 상태에서 일부 용매와 접촉하는 경우 R에서 S 형태로 또는 그 반대로 에피머화될 수 있습니다. R 형태와 S 형태의 비율은 조건에 따라 다를 수 있지만, EFSA CONTAM Panel은 식품 내 EA에 대한 이용 가능한 문헌을 검토한 후 S 형태보다 R 형태의 발생률이 더 높다고 보고했습니다14. 따라서 ML은 작물의 민감성, 가공 정도 또는 소비 빈도와 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. EU 프레임워크에서 보리, 밀, 스펠트 및 귀리의 도분 제품에 대한 ML은 50 또는 150 μg/kg(회분 함량이 각각 900 mg/100 g 미만 또는 이상)으로 설정되었으며, 사람이 직접 소비하는 곡물은 시리얼 기반 이유식을 제외하고 150 μg/kg의 ML이 적용됩니다. 여기서 ML은 20μg/kg10으로 감소합니다.

이 엄격한 법률은 오염된 샘플에서 R- 및 S 이성질체를 함께 찾을 수 있기 때문에 미량 농도(μg/kg) 수준을 결정하는 동시에 규제된 EA와 해당 에피머를 적절하게 식별할 수 있을 만큼 충분히 민감한 분석 방법론을 요구합니다. 이 작업은 각 독소-에피머 쌍이 동일한 정확한 질량 및 단편화 패턴을 공유하기 때문에 중요한 과제입니다. 또한 두 화합물 간의 적절한 크로마토그래피 분리는 복잡할 수 있습니다. 따라서 식품 샘플에서 EA 에피머가 동시에 발생할 때 잘못된 정량화를 방지하기 위해 잘 최적화된 LC 그래디언트가 필요합니다. 여러 연구에서 EA15,16,17,18의 명확한 측정을 위한 LC-MS 방법을 보고했지만, EA를 명확하게 식별하기 위해 크로마토그래피 피크의 적절한 분리를 달성하기 위해 크로마토그래피 방법을 광범위하게 연구해야 합니다. 그러나 이는 일반적으로 서로 다른 화학군에 속하는 오염 물질을 동시에 측정하는 다중 등급 분석법에서는 실현 가능하지 않습니다. 이러한 맥락에서 Carbonell-Rozas, Hernández-Mesa 등이 수행한 최근 연구19에서는 현행 법률에 따른 규정 미준수를 검출하기 위해 재현 가능한 CCS 값과 LOQ(Low Limits of Quantification)를 제공하는 두 개의 서로 다른 TWIMS 기기를 사용하여 밀 및 보리 샘플에서 EA를 정량화하기 위한 LC-IMS-MS 방법을 보고했습니다. 따라서 이 프로토콜의 목표는 LC-MS 워크플로우에 IMS를 통합하는 것이 어떻게 이성질체 EA의 분리에 기여하여 분석 방법의 선택성을 향상시키는지 보여주는 것입니다. 또한 분석 표준물질의 특성화를 통한 CCS 라이브러리 생성이 어떻게 마이코톡신 식별에 대한 더 높은 신뢰성을 제공하는지 보여줍니다. 이 프로토콜은 식품 안전 분석에서 IMS를 구현할 때의 이점을 명확하게 설명하기 위해 고안되었으며, 곡물의 EA를 측정하는 것을 예로 들어 설명합니다. 이 프로토콜은 QuEChERS 절차, LC-TIMS-MS에 의한 시료 분석, IMS 데이터 추출 및 해석을 기반으로 한 시료 처리를 다룹니다.

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프로토콜

1. 재고, 중간 및 작업 표준 솔루션의 준비

알림: 니트릴 장갑, 실험실 가운 및 보안경을 사용하십시오.

  1. 아세토니트릴을 사용하여 4mL 황색 유리 바이알에 10,000ng/mL의 12개 EA(재료 표 참조)의 개별 원액을 준비합니다. R-형태(-ine)는 이전에 25,000ng 부분으로 분주된 반면, S-형태(-inine)는 10,000ng 부분으로 분배되었습니다. 이 연구는 이러한 부분 표본으로 시작하여 R- 및 S 형태를 각각 2.5 및 1mL의 아세토니트릴로 희석한 다음 2분 동안 볼텍싱하여 10,000ng/mL의 농도에 도달했습니다.
  2. 12mL 호박색 유리 바이알에 총 EA 1,000ng/mL(각 83.33ng/mL)의 중간 원액을 준비하려면 각 알칼로이드 용액 65μL와 아세토니트릴 7.02mL를 추가합니다.
    참고: 중간 원액이 준비되면 개별 원액을 건조하고 -20°C에서 보관해야 하며, 이는 에피머화를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 덮여 있어야 합니다.
  3. 4 mL 호박색 유리관에 2.7, 1.8 및 0.9 mL를 피펫팅하여 중간 원액에서 작동 표준 용액을 준비합니다. 부드러운 질소 흐름으로 건조시키고 600μL의 아세토니트릴에 재현탁합니다.
    참고: 결과 농도는 샘플 1g에 50μL를 첨가할 때 mL(150ng/g)의 1.5배, 1배 및 0.5배에 도달하는 것으로 설정되었습니다. 이는 검증 연구를 위한 농도 수준(즉, 회수율, 반복성 등)으로 선택됩니다.
  4. 200 μL를 피펫팅하여 각 작업 표준 용액 600 μL를 2 mL 호박색 유리 바이알 3개에 나누고 건조시킵니다.
    참고: 1.2-1.4단계는 그림 1에 개략적으로 설명되어 있습니다. 작업 표준 용액을 나누고 건조함으로써 검증 연구에서 요구하는 대로 EA의 화학적 무결성을 잃지 않고 3일 동안 3회 동안 강화할 수 있습니다.
  5. 각 검증일에 각 강화 수준의 2mL 호박색 유리 바이알 1개를 200μL의 아세토니트릴에 재현탁합니다.
    참고: 각 강화 수준은 샘플당 50μL를 사용하여 삼중으로 평가됩니다. 따라서 총 150μL의 용액이 사용됩니다.

2. 시약 및 용액의 준비

알림: 니트릴 장갑, 실험실 가운 및 보안경을 사용하십시오.

  1. 24.02mg의 탄산암모늄의 무게를 측정하고 50mL의 물에 용해시켜 5mM 탄산암모늄 용액을 준비합니다. 24.02mg의 탄산암모늄을 비커에 넣고 약 5mL의 물을 추가합니다. 용액을 수동으로 부드럽게 교반하여 탄산암모늄을 용해한 다음 50mL 부피 플라스크로 옮깁니다. 최종 부피인 50mL에 도달하려면 비커를 추가 물로 헹구고 상승을 부피 플라스크로 옮깁니다.
  2. 212.5mL의 아세토니트릴과 2.1단계에서 제조한 암모늄 용액 37.5mL를 혼합하여 추출 용액[아세토니트릴:5mM 탄산암모늄(85:15, v/v)] 250mL를 준비합니다.
  3. 샘플 추출물을 재현탁시키기 위해 100mL의 메탄올:물 혼합물(1:1, v/v)을 준비합니다(8.8단계).
  4. 각 샘플에 대해 분산 세척 단계(8.5단계)를 위해 15mL 원심분리 튜브에 분산형 고체상 물질 C18:지르코니아 기반 흡착제 혼합물(1:1, w/w) 150mg의 칭량을 측정합니다.
  5. 크로마토그래피 분리를 위한 용매를 두 개의 다른 병, 즉 0.3%(v/v)의 포름산을 함유한 1L의 초순수(용매 A)와 메탄올(용매 B)에 준비합니다. 이 농도를 달성하기 위해 3.03mL의 포름산(순도 99%)을 병에 첨가했습니다.
    참고: 이동상용 용매는 LC-IMS-MS 분석을 실행하기 직전에 준비해야 합니다.

3. 기기 매개변수 설정

참고: 이 LC-IMS-MS 연구를 수행하는 데 사용된 기기는 진공 절연 프로브 가열 전기 분무 이온화(VIP-HESI) 소스가 장착된 IM-HRMS와 결합된 UHPLC였습니다. 기기는 포지티브 모드에서 작동되었습니다.

  1. 다음 용리 그래디언트를 설정하여 분석물 분리를 위한 수집 소프트웨어를 사용하여 크로마토그래피 분석법을 생성합니다: 0분, 10% B; 2분, 10% B; 4.5분, 40% B; 9분, 45% B; 11분, 95% B; 12분, 95% B; 13분, 10% B; 16분, 10% B.
  2. 이동상 유속을 0.4mL/분, 컬럼 온도를 35°C, 주입 부피를 5μL로 설정합니다. 가능하면 오토샘플러 내부의 온도를 10°C로 고정하십시오.
  3. IMS 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 모빌리티 값(1/K0), 0.1 - 1.5 V·s/cm2; 램프 시간, 100ms; 정확도 시간, 10ms; 듀티 사이클, 10%; 및 램프 속도, 9.05Hz.
  4. MS 검출을 위한 이온 소스 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 모세관 전압, 2,500V; 분무기 압력, 2.5 bar; 건조 가스 유량, 8 L / min; 건조 가스 온도, 200 °C; 칼집 가스 온도, 450 °C; 칼집 가스 유량, 4 L / min. MS 획득의 경우, 두 가지 스캔 이벤트를 고려하여 다음 매개변수를 선택합니다: 20에서 1,300까지의 m/z로 전체 질량 스펙트럼을 전체 스캔한 다음 24, 36 및 50eV의 세 가지 고정 충돌 에너지에서 모든 전구체로부터 생성물 이온을 생성하는 bbCID(광대역 충돌 유도 분해)를 수행합니다. 양극 모드에서 이온화 및 데이터 수집을 수행합니다.
  5. 나중에 사용할 수 있도록 이 획득 방법 파일을 저장합니다.

4. EA 분석 표준물질에서 데이터 수집

알림: 니트릴 장갑, 실험실 가운 및 보안경은 4.1단계에만 사용하십시오.

  1. 1,000ng/mL에서 500μL의 중간 용액이 들어 있는 1.5mL 호박색 바이알 2개와 세척 용액으로 용매 A와 B(1:1, v/v)가 혼합된 다른 바이알을 준비합니다.
  2. 제조업체에서 지정한 대로 timsTOF 기기를 보정하고 IMS 및 MS 수집 모두에 대해 양의 극성을 선택합니다.
  3. 3.5단계에서 저장한 획득 방법 파일에 표시된 대로 온도를 35°C로 설정하고 C18 컬럼( 재료 표 참조)을 LC 오븐 내부에 놓습니다.
    알림: 양쪽 끝이 잘 조여졌는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 이동상 누출이 관찰됩니다.
  4. 0.1mL/분의 이동상 유속을 허용하도록 LC 컬럼을 컨디셔닝하고 초기 이동상 조성 비율로 용매 A 및 B 혼합 비율 90:10(%)을 선택합니다.
  5. 컬럼 압력이 안정될 때까지(~130bar) 기다립니다.
  6. 이동상 유속을 0.2mL/분으로 늘리고 압력이 안정될 때까지 기다린 다음 다시 0.3mL/분으로 높입니다.
  7. 압력이 다시 안정화되면 유속을 0.4mL로 설정하고, 이는 3.5단계에서 저장한 획득 방법 파일에 자세히 설명된 대로 작업 유속이 되며 압력이 약 350bar로 안정화될 때까지 기다립니다.
    참고: 유량을 0.2mL/분에서 0.4mL/분으로 직접 증가시키지 않는 것이 중요합니다. 흐름의 강한 변화는 크로마토그래피 컬럼에 해를 끼칠 수 있는 고압 피크를 유발합니다.
  8. 컬럼이 컨디셔닝되는 동안 4.1단계에서 설명한 대로 1,000ng/mL의 EA 중간 용액을 포함하는 두 개의 바이알과 세척 바이알을 포함하는 두 개의 샘플을 포함한 작업 목록을 작성합니다. 세척 바이알을 샘플 배치의 시작과 끝에서 두 번 분석합니다.
  9. worklist의 Method file 열에서 3.5단계에서 이전에 저장한 Acquisition Method 파일을 로드합니다.
  10. 수집된 모든 데이터 파일을 저장할 폴더를 만들고 Sample path 열에서 폴더를 선택하여 모든 샘플을 라우팅합니다.
    참고: 추가 처리를 위해 검증 연구 중에 생성된 모든 파일을 동일한 폴더를 사용하여 저장해야 합니다. 컬럼 조절하는 동안 압력이 안정화되는 값은 약간 달라질 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 컬럼 무결성을 유지하기 위해 유속을 다시 증가시키기 전에 압력이 안정적인지 확인하십시오. 또한 작업 유속에 도달하면 재현 가능한 크로마토그래피 분리를 달성하기 위해 압력도 안정적이어야 합니다.
  11. 소프트웨어의 상단 도구 모음으로 이동하여 작업 목록을 실행합니다.

5. 정량화 방법 생성을 위한 데이터 처리

  1. 작업 목록이 실행되면 정성적 소프트웨어를 엽니다.
  2. File (파일) | 작업 목록을 엽니다.
  3. 1,000ng/mL의 EAs 중간 용액에 해당하는 샘플을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Edit chromatogram(크로마토그램 편집)으로 이동한 다음 Type(유형) | 추출된 이온 크로마토그램을 입력하고, 각 EA와 관련된 양성자화 이온의 이론적 분자량을 입력합니다. 그런 다음 추가를 클릭하고 마지막으로 확인을 클릭합니다. 분석물 세트는 동일한 정확한 질량을 공유하는 6개의 EA와 관련 에피머로 형성되기 때문에 6개의 추출된 이온 크로마토그램이 나타납니다.
    참고: Width 매개변수는 m/z 창의 범위를 변경합니다. 관심 분석물의 크로마토그래피 피크를 찾는 데 어려움이 있는 경우 충분히 넓은 m/z window를 선택하는 것이 좋습니다. 그러나 가능한 간섭(0.05 단위 미만)을 피하기 위해 좁은 m/z 창을 설정하는 것이 좋습니다.
  4. 추출된 각 이온 크로마토그램에서 메인 EA 및 그 에피머와 관련된 두 개의 크로마토그래피 피크가 나타납니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하면서 한 피크의 전체 영역을 선택합니다. 결과적으로 Ion Mobility 스펙트럼이 바로 아래에 나타납니다.
  5. Ion Mobility Spectrum의 x축으로 이동하여 마우스 오른쪽 버튼을 클릭한 다음 Collision Cross Section을 클릭합니다. CCS 값을 기록해 둡니다.
    참고: CCS 값이 자동으로 나타나지 않으면 상단 도구 모음에서 Calibrate (보정)로 이동한 다음 Mobility calculator(이동성 계산기)로 이동하여 이동성 값을 수동으로 입력하여 해당 CCS를 가져옵니다.
  6. 동일한 이온 크로마토그램 내에서 다른 크로마토그래피 피크에 해당하는 영역을 선택하고 5.4단계를 반복합니다. 및 5.5.
  7. 마찬가지로 조각화 패턴은 5.4단계 후에도 나타납니다. 문헌 및 데이터베이스에 보고된 단편화 패턴을 기반으로 가장 강렬한 산물 이온을 비교하고 보완적인 식별 지점으로 선택합니다.
  8. 머무름 시간, CCS 값 및 각 EA의 주 이온 부가물(일반적으로 양성자화된 이온)의 정확한 질량을 기록하여 정량 분석법을 생성합니다.
  9. 5.4-5.8단계를 반복합니다. 나머지 분석물에 대해.
  10. 5.3단계에서 생성된 모든 분자 질량을 Ctrl 키를 누른 상태에서 클릭하여 선택합니다. 그런 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 복사를 선택합니다. EAs 중간 솔루션에 해당하는 다른 샘플로 이동하여 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Paste를 선택합니다. 이온 크로마토그램과 이동성 스펙트럼이 자동으로 추출됩니다.
  11. 이 두 번째 샘플의 모든 분석물에 대한 식별 파라미터를 다시 확인합니다.

6. 맥각 알칼로이드의 일상적인 측정을 위한 데이터 처리 방법 생성

  1. 소프트웨어를 열고 Method Management 탭을 클릭합니다.
  2. Analyte 설정을 클릭하고 각 EA의 이름과 머무름 시간, CCS 값 및 5.4단계에서 수집된 양성자화된 부가물의 질량을 입력합니다. 5.9로. 필요에 따라 각 식별 지점의 허용 오차를 변경하지만, 이 프로토콜의 적용에는 기본 설정이 권장됩니다.
    참고: 허용 오차 값이 높을수록 이론적 값에서 더 큰 편차가 허용되기 때문에 거짓 긍정을 처리할 가능성이 높아집니다. 마찬가지로, 허용 오차 값이 너무 엄격하면 거짓 음성이 발생할 수 있습니다. 이것은 이론적 값과의 편차가 전적으로 기기의 성능에 의해 발생하는 경우에 발생합니다.
  3. 나중에 사용할 수 있도록 정량 분석 방법을 저장합니다.

7. 샘플링

  1. 유럽연합 집행위원회(European Commission20)에서 정한 샘플링 지침에 따라 슈퍼마켓에서, 가급적이면 1kg 용기에 담긴 밀과 귀리 샘플을 확보하십시오. 1kg 패키지를 사용할 수 없는 경우 전체 분석을 완료하기 위해 최소 50g의 샘플이 있는지 확인하십시오.
  2. 그라인더를 사용하여 샘플을 밀링합니다. 이 연구에서는 블레이드 그라인더를 사용하여 패키지의 전체 내용물을 밀링한 다음 균질화를 위해 원래 패키지로 되돌려 놓았습니다.
    알림: 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 사이에 그라인더를 철저히 청소하십시오. 실험실 코트를 사용하십시오.
  3. 균질화된 샘플을 50mL 원심분리 튜브에 분취하고 서늘하고 건조한 상태로 보관합니다.

8. 샘플 준비

  1. 연속되지 않은 3일 동안 검증 연구를 수행하기 위한 일정을 준비합니다(원내 재현성 평가를 위해). 매일 225ng/g(1.5mL), 150ng/g(ML) 및 75ng/g(0.5mL)에서 시료를 강화하여 세 가지 농도 수준을 분석합니다. 각 레벨을 3회씩 연구하며, 하루에 9개의 스파이크 샘플과 3개의 빈 샘플을 나타냅니다.
    참고: 3일의 검증일을 고려할 때, 총 36개의 샘플과 함께 매트릭스 일치 보정 곡선을 준비하기 위한 또 다른 8개의 빈 샘플이 필요합니다. 프로토콜의 이 전체 섹션에 니트릴 장갑, 실험실 가운 및 보안경을 사용하십시오.
  2. 1g의 샘플을 50mL 원심분리 튜브에 넣습니다.
    참고: 검증 연구를 수행할 때 1.3단계에 자세히 설명된 해당 작업 표준 용액 50 μL로 칭량한 직후 샘플을 강화하십시오. 및 1.5.
  3. 추출 용액 4mL[아세토니트릴:5mM 탄산암모늄 수용액(85:15, v/v)]을 추가합니다. 1분 동안 샘플을 소용돌이치십시오.
  4. 9,750 × g 및 4 °C에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다.
    참고: 원심분리기의 용량은 절차의 제한 요소가 될 수 있으므로 원심분리기에 들어갈 수 있는 정확한 수의 샘플만 동시에 추출하는 것이 좋습니다.
  5. 전체 상등액을 150mg의 세척 흡착제(1:1, w/w) 혼합물이 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1분 동안 샘플을 소용돌이치십시오.
  6. 튜브를 9,750 × g 및 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  7. 상층액을 모아 4mL 호박색 유리 바이알에 넣습니다. 부드러운 질소 흐름으로 추출물을 증발시킵니다.
    참고: 샘플은 같은 날 분석하지 않는 경우 -20°C에서 건조된 상태로 유지해야 합니다.
  8. 750 μL의 메탄올:물(1:1, v/v) 혼합물로 샘플을 재구성합니다.
  9. 추출물을 2mL 주사기로 옮기고 0.22μm 나일론 필터를 통해 1.5mL 앰버 크로마토그래피 바이알로 여과합니다.
  10. 매트릭스 일치 보정 곡선을 위한 8개의 blank 샘플의 재구성된 추출물을 12mL 호박색 유리 바이알에 수집합니다(각 샘플은 750μL에 재현탁되며 총 부피는 6mL임을 나타냄).
  11. 1,000ng/mL(맥각 알칼로이드당 83.33ng/mL)의 중간 용액 1mL를 2mL 호박색 유리 바이알에 피펫팅하고, 부드러운 질소 흐름으로 용매를 건조시킨 후 이전에 수집한 blank 샘플 추출물 1mL에 재현탁합니다.
    참고: 1,000ng/mL(각 EA당 83.33ng/mL) 농도의 이 혼합물을 사용하여 매트릭스 일치 검량선을 준비합니다.
  12. 2mL 호박색 유리 바이알 10개를 준비하고 각 바이알에 450μL의 빈 샘플 추출물(8.10단계)을 놓고 1에서 10까지의 숫자로 표시합니다. 각 바이알은 보정 곡선의 한 지점이 됩니다.
    참고: 이 프로토콜에서는 450 μL가 사용되었는데, 이는 LC 장치가 인서트를 사용하지 않고 바이알 내부에 도달할 수 있는 가장 낮은 값이었기 때문입니다. 바늘이 바이알 깊숙이 닿지 않으면 부피를 늘리고 결과적으로 각 샘플이 750μL의 메탄올:물(1/1, v:v) 혼합물에 재현탁되는 것을 고려하여 얼마나 많은 추가 빈 샘플을 추출해야 하는지 계산합니다.
  13. serial dilution에 의한 검량선을 구축합니다. 단계 8.11에서 준비한 혼합물 450μL를 옮깁니다. 이미 450 μL의 blank 샘플 추출물이 함유되어 있는 바이알 1에 넣어 41.67 ng/mL(가장 높은 검량점)의 농도를 얻을 수 있습니다. 바이알을 2분 동안 소용돌이치세요.
    알림: 혼합물의 부피는 빈 샘플의 부피와 일치해야 합니다.amp각 단계에서 두 번 희석하기 위해 추출물.
  14. 바이알 1에서 450μL를 이미 450μL의 빈 샘플 추출물이 함유된 바이알 2로 전달하여 20.83ng/mL(두 번째로 높은 보정 지점)의 농도에 도달합니다.
  15. 8.14단계를 반복하고(즉, 바이알 2에서 바이알 3으로 등) 10개의 보정 지점을 얻을 때까지 계속합니다. 각 EA의 농도 범위는 41.67, 20.83, 10.42, 5.21, 2.60, 1.30, 0.65, 0.33, 0.16 및 0.08ng/mL입니다.
  16. 8.11단계에 설명된 대로 1,000ng/mL(각 EA당 83.33ng/mL)에서 1mL의 메탄올:물(1:1, v/v) 혼합물을 사용하여 표준 혼합물을 준비합니다.
  17. 8.13 - 8.15 단계에 자세히 설명된 대로 표준 검량선을 준비하되 연속 희석을 위해 450μL의 메탄올:물(1:1, v/v) 혼합물을 사용합니다. 이 검량선은 매트릭스 정합 검량선과 비교하여 매트릭스 효과를 평가하는 데 사용됩니다.

9. 정량적 데이터 처리

  1. 4.1단계에 설명된 지침에 따라 기기를 초기화하고 실행합니다. 를 4.11로 설정합니다. 이 프로토콜에 사용된 작업 목록은 그림 2 를 참조하십시오.
    참고: 검량선에 대한 작업 목록을 작성할 때, 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도까지 표준 검량선으로 시작하는 강화 샘플, 메탄올:물(1:1, v/v)이 포함된 세척 바이알, 가장 낮은 농도에서 가장 높은 농도까지 매트릭스 일치 검량선보다 먼저 주입합니다.
  2. 정량 소프트웨어를 열고 TASQ Quick tab(TASQ 퀵 탭)으로 이동합니다. 왼쪽 하단의 일괄 가져오기 .
  3. 4.10단계에서 생성한 폴더를 선택합니다. 모든 원시 데이터(작업 목록에 포함된 모든 샘플에 대해 LC-IMS-MS 분석 후 획득한 정보와 관련된 파일)를 포함합니다.
  4. 소프트웨어로 가져오면 Import batch 바로 아래에 있는 Process batch(일괄 처리)로 이동합니다.
  5. 처리할 샘플(즉, 27개의 스파이크 샘플, 9개의 블랭크 및 두 보정 곡선)과 6.1단계에서 이전에 생성한 데이터 처리 방법을 선택합니다. 6.3으로. 설정할 다양한 매개변수(즉, 크로마토그래피 피크를 평가하기 위한 적분기 유형 또는 고려해야 할 분석 신호 유형 등)가 있는 창이 나타납니다. 원하는 대로 해당 매개 변수를 변경하지만 기본값은 이 프로토콜의 실행에 적합합니다.
  6. Review screening after data processing is completed(데이터 처리 완료 후 스크리닝 검토 )로 이동하여 서로 너무 가까이 있을 수 있는 잘못된 크로마토그래피 피크 선택과 같은 자동 적분과 관련된 문제가 있는지 확인합니다. 그렇다면 Quantitative Method 파일에 처음 설정된 머무름 시간 허용 오차, CCS 값 허용 오차 및/또는 질량 오차를 참조하는 값을 좁히고 데이터를 다시 처리합니다. 자동 피크 적분(automatic peak integration)이 여전히 잘못된 피크를 선택하는 경우, Review Screening(스크리닝 검토) 창에 나타나는 크로마토그램의 영역을 선택하여 피크를 수동으로 적분합니다(이를 위해 섹션 5에서 EA 표준물질에 대해 얻은 분석 파라미터를 고려).
    참고: 일부 주요 EA-에피머 쌍은 머무름 시간이 매우 유사하고 소프트웨어에 의해 잘못 식별될 수 있으므로 각 샘플을 검토하는 것이 매우 중요합니다.
  7. 모든 샘플에 대해 모든 피크가 성공적으로 적분되면 왼쪽 상단 모서리에 있는 배치 관리 탭을 클릭하고 각 분석과 관련된 샘플 유형(용매, 블랭크, 품질 관리, 샘플 또는 보정 포인트)을 표시합니다. 후자의 경우 숫자가 있는 수준에서 각 교정 점을 할당합니다.
  8. 동일한 Batch 관리 탭에서 Batch concentration(배치 농도 )이라는 하단 창으로 이동하여 이전 단계에서 설정한 각 수준에 대한 농도 값을 지정합니다. 이 작업이 완료되면 농도 저장을 클릭합니다.
  9. Quantify 배치를 클릭하고 원하는 대로 매개변수를 변경합니다(즉, 보정 데이터에 맞는 모델, 가중치, 모델이 강제로 0을 교차하는지 여부 등). 기본값은 1/x로 전환된 보정 곡선의 가중치를 제외하고 이 프로토콜의 실행에 적합합니다.
    참고: 소프트웨어는 한 번에 하나의 검량선만 고려할 수 있으므로 표준 및 매트릭스 정합 검량선에 대한 정보를 얻으려면 9.9단계를 두 번 반복해야 합니다. 이 프로토콜에서는 분석물의 정량화를 위해 매트릭스 일치 검량선을 사용했기 때문에 용매 검량선을 먼저 평가하고, 나중에 9.13단계에서 설명한 대로 검량 데이터를 추출하고, 마지막으로 샘플의 정량화를 수행하기 위해 매트릭스 정량선을 선택했습니다.
  10. 정량화 방법 파일에 따라 맥각 알칼로이드의 정량화가 수행되면 화면 상단의 정량 분석 탭을 클릭합니다.
  11. 9.9단계에서 설정한 기본 매개변수가 우수한 선형성과 정밀도를 제공하지 않는 경우, 각 보정 레벨에서 적절한 정밀도(편차 20% 미만)를 가진 우수한 선형 모델(R2 > 0.99)을 얻기 위해 그래프를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 피팅과 가중치를 변경하여 보정 곡선을 조정합니다.
    참고: 소프트웨어는 적절한 정밀도를 제공하지 않는 보정 수준의 셀을 빨간색으로 표시합니다.
  12. 완료되면 화면 맨 왼쪽에 있는 배치 폴더를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 보고서 생성을 선택합니다. 그런 다음 Analyte quantitation 을 선택하여 보고서를 원하는 형식으로 내보냅니다.

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결과

먼저, 여기에서 분석된 각 EA의 모든 식별 기능(즉, 머무름 시간, CCS 및 질량 스펙트럼)을 얻기 위해 작업 표준 용액을 LC-IMS-MS 기기에 주입했습니다. 정확한 질량을 제외한 식별 매개변수는 초기에 알 수 없었기 때문에 획득 방법은 전체 질량 스펙트럼의 전체 스캔으로 시작하여 bbCID가 뒤따르는 두 번의 스캔 이벤트를 기반으로 했습니다. 이 연구에 대한 후향적 접근 방식은 Q-TOF 고분해능 질량 분석기를 통해 가능하며, 이 분석기는 분석물에 대한 입력이나 사전 정보 없이 데이터를 수집하고 생성합니다. 수집된 데이터 내에서 각 쌍 주 EA-에피머의 정확한 질량을 검색하여 다른 식별 특성(즉, 머무름 시간 및 CCS 값)도 얻었으며, 이는 샘플 데이터 처리를 위한 정량적 방법을 만드는 데 사용됩니다. 분석 후 얻은 실험 매개변수는 표 1에 자세히 설명되어 있습니다.

크로마토그래피 분리는 Et 및 Etn을 제외한 각 주요 EA-에피머 쌍에...

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토론

이 프로토콜의 성공적인 사용은 보리 및 밀과 같은 복잡한 식품 매트릭스에서 EA를 추출할 수 있을 만큼 효과적인 추출 용매의 사용을 구현한 Carbonell-Rozas 등[17]이 이전에 수행한 추출 절차의 최적화와 상대적으로 낮은 SSE 값을 제공하는 정리를 기반으로 합니다. 추출 용매의 선택은 분석물의 화학적 특성과 분해 및 에피머화에 대한 EA의 불가능성을 고려하는 중요한 단계이지만, 동시에 분석 대상 매트릭스의 조성을 고려합니다. 이 경우, EA(및 일반적으로 마이코톡신)는 아세토니트릴(에피머화를 방지할 수 있는 비양성자성 용매)이 선택된 용매일 때 매우 우수한 효율을 제공합니다 21,22,23,24.<...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 Consejería de Universidad, Investigación e Innovación - Junta de Andalucía (PROYEXCEL_00195) 및 Generalitat Valenciana 및 European Social Fund+(CIAPOS/2022/049)에서 제공한 박사후 연구원의 지원을 받았습니다. 저자는 이 프로토콜에 사용되는 분석 기기에 대한 액세스를 제공한 그라나다 대학교의 "Centro de Instrumentación Científica(CIC)"에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AcetonitrileVWR83640.32
Amber 유리관 4 mLVWR548-0052
Amber 유리관 12 mLVWR548-0903
Amber 바이알 1.5 mLAgilent5190-9063
암모늄 카보네이Fluka9716
분석 저울 BAS 31 Boeco4400519
밸런스 CP 323 S Sartorius23-84182
C18Supelco52604-U
원심분리기 튜브, 15 mLVWR525-1082
원심분리기 튜브, 50 mLVWR525-0155
원심분리기 Universal 320 RHettich1406
Compass HyStar BrukerAcquisition 소프트웨어
DataAnalysisBrukerQualitative software
Elute PLUS  UHPLCBruker
EVA EC-S 증발기VLMV830.012.12
분석용 포름산 GR ACS, Reag. Ph EurMerck100264
그라인더 TitanMill300Cecotec1559
메탄올VWR83638.32
Milli-Q 정수 시스템 (18.2 MΩ cm)MilliporeZD5211584
피펫 팁 1- 5 mLLabortecnic162005
피펫 팁 100 - 1000 &마이크로; LLabortecnic1622222
피펫 팁 5 - 200 &마이크로; LLabortecnic162001
Pippette Transferpette S 변수, DE-M 10 - 100 &마이크로; L브랜드704774
피펫 전사 S 가변, DE-M 100 - 1000 &마이크로; LBRAND704780
피펫 전사 S 가변, DE-M 500 - 5000 &마이크로; L브랜드704782
주사기 2 mLVWR613-2003
주사기 필터 13 mm, 0.22µ mPhenomenexAF-8-7707-12
TASQBruker정량 소프트웨어
timsTOFPro2 IM-HRMSBruker
Vortex Genie 2Scientific Industries15547335
Zorbax Eclipse Plus RRHD C18 column (50  엑스  2.1 mm, 1.8 &마이크로; m 입자 크기)Agilent 959757-902
Z-Sep+Supelco55299-U지르코니아 기반 흡착
제맥각 알칼로이드CAS 레지스트리 흡착제
Ergocornine (Eco)Techno SpecE178564-36-3
Ergocorninine (Econ)Techno SpecE130564-37-4
Ergocristine (Ecr)테크노 스펙E180511-08-0
에르고크리스티닌 (Ecrn)테크노 스펙E188511-07-9
에르고크립틴 (Ekr)테크노 스펙E198511-09-1
에르고프크립티닌 (Ekrn)테크노 스펙E190511-10-4
에르고메트린 (Em)Romer Labs"002067"60-79-7
에르고메트리닌 (Emn)Romer LabsLMY-090-5ML479-00-5
에르고신(Es)테크노 사양E184561-94-4
에르고시닌(Esn)테크노 사양E194596-88-3
에르고타민(Et)Romer Labs"002069"113-15-5
에르고타미닌(Etn)Romer Labs"002075"639-81-6
트

참고문헌

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